两种小麦糖原合成酶激酶3/ shaggy样激酶的鉴定与表征

背景

植物糖原合成酶激酶3/ shaggy样激酶(GSKs)参与了许多生物过程，从胚胎、花、气孔发育到应激和伤口反应。它们是油菜素内酯信号传导的关键调控因子，也参与了生长素和油菜素内酯途径之间的交叉对话。与包含两个基因的人类基因组不同，植物gsk是由多基因家族编码的。我们对百合知之甚少．禾本科相比之下十字花科葛兰素史克。在这里，我们报告了两个GSK同源物的鉴定和结构表征TaSK1和TaSK2在六倍体小麦基因组以及广泛的陆地植物gsk系统发育分析。

结果

基因组和cDNA序列比对以及利用无染色体-四染色体系进行的染色体定位提供了强有力的证据，证明有三个表达的基因拷贝位于同源染色体上TaSK1也为TaSK2．预测的蛋白质显示出明确的GSK特征。在体外激酶实验表明，TaSK1和TaSK2具有激酶活性。陆地植物GSKs的系统发育分析表明，TaSK1和TaSK2属于植物GSKs的II支系拟南芥它们的成员都参与油菜素内酯信号传导。基于所有陆地植物最后共同祖先的单一祖先基因，通过古多倍体化事件获得并保留了相似基因，在被子植物中产生了6至8个基因。最近的重复事件使某些血统的数目增加到10个。

结论

为了解释植物在功能、形态和发育方面的多样性，必须关注百合属植物禾本科gsk除了拟南芥葛兰素史克。在本研究中，通过分子鉴定、染色体定位、激酶活性测试和系统发育分析(1)明确了同源/旁系与同源的地位任务序列，(2)指出它们隶属于GSK多基因家族，(3)显示出功能性激酶活性，(4)允许在II分支中分类，其成员参与BR信号传导，(5)允许在全基因组复制事件的背景下获得被子植物中GSK相似物的获取和保留信息。我们的研究结果为百合属植物的研究提供了一个框架禾本科gsk的功能是开发。

糖原合成酶激酶3 (GSK-3) / SHAGGY激酶(SGG)是多功能非受体丝氨酸/苏氨酸激酶。

在人类和动物中，GSK-3/SGG是一系列信号通路的关键调节因子，它们的失调导致许多疾病或发育异常，这两个方面在文献中都有大量记载。

在人类中，由两个基因编码的两种名为GSK-3β和GSK-3α的酶参与糖原代谢的调节[1]，细胞周期的调节[2]，细胞骨架的稳定性[3.]，凋亡[2，4]，在调节转录因子如c-Jun和c-Myc的活性[2]以及包括老年痴呆症在内的一系列疾病[4]和癌症[5]．

SGG/GSK-3是Wnt/Wingless(Wg)通路的主开关，参与动物的基本发育过程，如细胞命运规范、模式形成和体轴形成[qh]2，6，7]．SGG/GSK-3的调控在无脊椎动物和脊椎动物胚胎极性的建立过程中都是一种保守的进化策略。在果蝇，由单个基因编码的一组SGG同工酶对于确定胚胎片段内的细胞命运和极性是必要的[8]以及神经系统的发育[9]．腹侧注射催化无活性形式的GSK-3β in非洲爪蟾蜍光滑的胚胎诱导背侧发育和异位多体轴分化，表明GSK-3调节背-腹侧计划的形成[10]．在九头蛇HyGSK-3活性的抑制赋予体柱头部组织者的特征，导致体柱上异位头和触角的分化[11]．

gsk也存在于许多植物物种中[7]．虽然对GSK-3工厂的调查是最近才开始的，但它们的作用似乎也很多。与动物不同，植物gsk是由一个多基因家族编码的[12]．

目前关于它们的生物学功能和作用机制的研究大多是通过对BIN2的研究提供的拟南芥。brassinosteroids insensitive2/拟南芥蓬毛相关蛋白激酶(eta)及其两个近亲ASKiota和ASKdzeta，都是II分支的成员，参与油菜素内酯(BR)信号传导[13，14]．功能增益bin2.1突变导致类似BR缺陷或BR信号突变的矮化表型[13，15]．BIN2在BR信号通路中起负作用[13]．该激酶磷酸化转录因子bri1 - mes -suppressor1 (BES1)和brassinazol - resistant1 (BZR1)，以促进BRZ1蛋白降解[16]，影响BRZ1和BES1的亚细胞定位[17，18]并影响与目标启动子的结合和BES1的转录活性[14]．上游BR信号通过蛋白酶体介导的降解负向调节BIN2蛋白水平[19]并通过保守酪氨酸残基的去磷酸化使BIN2激酶活性失活[20.]．的研究ULTRACURVATA1编码ASKη/BIN2的基因已经表明该蛋白参与油菜素内酯和生长素信号通路之间的交叉对话[15]．此外，还发现了生长素反应因子2转录活性受BIN2直接调控，揭示了生长素与BR信号传导之间的直接分子联系[21]．最近，ASKtheta属于拟南芥gsk的III级分支也参与了BR信号传导[22]，而有证据表明I组ASKgamma在这一信号通路中可能存在影响[20.]．因此，到目前为止，4个分支中的3个分支中的10个atsk中有5个被认为参与了BR信号。

植物gsk参与了广泛的发育过程，如胚胎、花、气孔发育以及伤口反应。ASKdzeta、ASKeta/BIN2和ASKtheta在发育中的胚胎中表达，尽管它们在胚胎发育中的功能在很大程度上尚不清楚[23，24]．AntisensAtSKalpha和AtSKgamma植物显示出更多的萼片和花瓣，以及雌蕊的顶端和基部图案的变化[25]．油菜素内酯信号通过BIN2参与气孔发育[j]26]．最后，紫花苜蓿的创面诱导GSK-3 (WIG)参与创面反应[27]．

考虑到植物gsk的多样性和已经观察到的多方面的功能能力，有必要更多地了解它们在植物发育中的作用，并将研究扩展到其他植物科十字花科．在这篇报道中，我们关注的是单子叶植物禾本科由于其农学和生态学的重要性，系统发育的相关性以及它们的发育，特别是它们的胚胎发育在许多方面与双子叶不同拟南芥发展。

在本文中，我们报道了两个同源小麦GSKs的分子特性TaSK1和2（小麦蓬松样激酶1和2)以及它们的同源基因拷贝。染色体定位各自同源基因的拷贝和功能在体外提供了两种同源物的激酶活性。此外，任务与其他相关的系统发育关系禾本科gsk和选定的dicot，包括拟南芥分析ask作为提供功能研究框架的第一步。

小麦的分子特性任务

一个cDNA片段编码一个与哺乳动物糖原合成酶激酶3 (GSK-3)高度同源的蛋白果蝇丝氨酸/苏氨酸激酶SHAGGY (SGG)从抑制减法杂交(SSH)方法构建的胚胎cDNA文库中分离得到[28]．利用该片段进行SMART RACE cDNA扩增，获得两个新的cDNA序列并命名小麦毛状激酶1和2（TaSK1和TaSK2)。作为5 '的一部分TaSK1通过后一种技术无法克隆，因此进行了额外的克隆。因此，克隆后进行了23个cDNA和56个基因组克隆的比对TaSK1以及18个cDNA和21个基因组克隆TaSK2为三种表达基因拷贝的发生提供了证据TaSK1和TaSK2命名TaSK1-A, B, C和TaSK2-A, B, C。使用手工方法和CLUSTALX、MAFFT、MUSCLE、Figtree和Quicktree算法/程序对这些克隆序列进行组装、比对和亚组[29- - - - - -32]．的基因组和cDNA一致序列TaSK1-A，- b和- c，及TaSK2-A，- b和- c从排列中提取。

一致的基因组序列TaSK1-A, B, C大小分别为4436,4422和4195 bps。的内含子1TaSK1-C无法克隆。一致的基因组序列的大小TaSK2-A, B, C分别为3825、3999、3824 BPS。它们的基因组结构与报道的相似拟南芥问年代(12即12个外显子被11个内含子打断。

三者的比较TaSK1基因组和cDNA水平上的一致序列表明它们具有高度的序列保守性。事实上，同一性TaSK1-A, B, C基因组序列的识别率为88.5% ~ 96%，完整编码区(CDS)序列的识别率为96.9 ~ 98.4%1- a, B)。同样，高身份也被观察到TaSK2-A, B, C基因组序列(90.3 ~ 97.9%)和CDS序列(98.9 ~ 99.7%)(表3)1- a, B)。

TaSK1-A、C和TaSK1-B预测考虑最长开放阅读框(ORF)的蛋白分别含有400和401个氨基酸。它们的计算分子量分别为44.9和45.0 kDa。这三个TaSK2共识cdna编码预测蛋白的402个氨基酸(最长的ORF)，分子量为45.2 kDa。TaSK1-A、B、C三者之间的一致性在98.8% ~ 99%之间，TaSK2-A、B、C三者之间的一致性在99.3% ~ 99.5%之间1C).相比之下，TaSK1和TaSK2显示了88.3到88.8%的身份(表2)1C).因此，三个TaSK1之间和三个TaSK2之间的同一性高于TaSK1和TaSK2之间的同一性。

的拷贝数和染色体定位任务小麦六倍体基因组中的基因

全局比对提供了强有力的证据，证明存在三个表达的基因拷贝TaSK1以及三份快递副本TaSK2．小麦六倍体基因组的复杂性引起了这些拷贝是同源基因拷贝还是同源基因拷贝的问题。

无染色体-四染色体线小麦栽培品种“中国春”已成功地用于定位六倍体小麦特定染色体上的同源基因[33]．这样的一条线缺少一对染色体，由一对额外的同源染色体代替。换句话说，这些线对于同源染色体中的一条是零染色体体(N)，对于另外两条同源染色体中的一条是四染色体体(T)。在42种可能的4 -nullisomic组合中，已经测试了19种组合，其他组合要么是多余的，要么是致命的。特别是，无效组2A和4B系不可用。根据已知的索诺拉小麦品种克隆序列，设计每个基因拷贝的特异性引物(表1)2)。对于每个引物组合，一个引物被设计用于识别具有特定基因拷贝的核苷酸插入或删除的序列区域，第二个引物结合到任意一个非特异性区域TaSK1或TaSK2．

用特异性引物获得pcr产物TaSK1-A除N3B-T3D线外，所有测试线均为定位提供了强有力的证据TaSK1-A在3B染色体上(图1A).用特异性引物进行扩增TaSK1B除N3D-T3A外的所有品系，强烈提示定位TaSK1-B在染色体3D上(图1A)相似的方法得出的结论是TaSK1-C最有可能位于3A染色体上，因为唯一没有扩增的系是N3A-T3B(图3)1一个)。

同样的,TaSK2-A可能定位在1b染色体上TaSK2-B位于1A染色体上(图1B).不幸的是，这种基于序列特异性引物的聚合酶链反应(PCR)方法不适合TaSK2-C由于该序列没有适当的特异性核苷酸插入或删除，使其与其他序列区别开来。但是外显子4TaSK2-C携带一个保守的核苷酸交换产生一个Rsa1另一种没有限制性位点TaSK2而在TaSK1序列。特定引物TaSK2在该酶切位点的上游和下游设计序列(表2)2)。放大后Rsa1除N1D-T1B线外，所有测试线(箭头)都产生了消化产物，这表明该线中没有消化位点(图1)1B)，因此我们得出结论TaSK2-C位于1D染色体上。

总之,TaSK1-A, B, C分别位于同源染色体3B、3D、3A上，而TaSK2-A, B, C位于同源染色体1B、1A、1D上。很可能每个基因拷贝只存在于一条染色体上。这些数据加强了序列比对分析的结果，并提供了强有力的证据，证明了三者之间的关系TaSK1一只手复印，三只手复印TaSK2另一方面，拷贝是同源基因拷贝。

小麦任务显示GSK3/SGG签名

TaSK1-A、B、C和TaSK2-A、B、C的催化结构域与的催化结构域具有较高的序列一致性拟南芥BIN2 (91 - 90%),黑腹果蝇SHAGGY(67-68%)和智人GSK-3β(70 - 71%)。作为比较，人GSK-3β和果蝇SHAGGY的催化结构域具有85%的同源性。上述百分比为通过ClustalW2获得的两两对齐得分。

所有的task都含有高度保守的基序CDFGSAK和SYICSR (TaSK2s为AYICSR)，这些基序将GSK-3亚家族与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区分开来(图2)2) [23，34]．

在后一个基序中，所有的TaSKs都有一个酪氨酸(Tyr)残基，其位置与GSK-3β的Tyr 216相同(图2)2)。该残基的磷酸化与人类和动物激酶活性的调节有关拟南芥［20.，35- - - - - -37]．

GSK-3β中存在与Arg 96、Arg 180、Lys 205位置相当的残基(图2)2)。在GSK-3β的情况下，这些残基定义了一个用于结合引物底物的口袋[35，36，38]．被另一个激酶预磷酸化(引物)的底物与这个口袋结合，从而被GSK-3β正确定位磷酸化[35，36，38]．然而,尽管拟南芥BIN2包含这个口袋，它的磷酸化活性不是基于启动磷酸化，而是需要与BRZ1直接相互作用[39]．

胰岛素信号通路中GSK-3β的抑制依赖于N端残基丝氨酸9 (Ser9)磷酸化[j]38]．Ser9在TaSKs中不存在，因为BIN2也是如此(图2)2) [7]．

由于存在植物II类gsk的SIDIW盒特征，任务被分类为II组(图2)2) [23]．就像拟南芥BIN2, TaSKs包含TREE motif(图2)2)。几乎所有的Bin2.1功能突变的增益定位于该基序[13，15，19]．Bin2.1蛋白质被证明比其野生型形式更稳定[19]．任务还包含基序MEYV，它包含对接的关键残基拟南芥GSK抑制剂比基尼(图2) [40]．该抑制剂对基序为LDYV的人GSK-3β抑制较差[40]．

蛋白质序列分析为GSKs蛋白激酶亚家族中的任务分类提供了强有力的证据。

TaSK1和TaSK2是功能性激酶

一个在体外通过激酶活性测定来评估TaSK1和TaSK2是否具有激酶活性。完整长度TaSK1和TaSK2(最长ORF)，拟南芥BIN2, OsGSK7(任务同源)栽培稻)和小麦TaGSK1过表达大肠杆菌作为GST融合蛋白和亲和蛋白在天然条件下纯化。用放射性标记的ATP测定了牛髓鞘碱性蛋白片段(MBP)的转磷酸化活性，该片段包含激酶蛋白的几个一致磷酸化位点3.)。作为融合蛋白表达的TaSK1、TaSK2、OsGSK7、BIN2和TaGSK1能够磷酸化MBP片段，而GST单独不能磷酸化MBP(图2)3.(顶板)。此外，将SDS-PAGE凝胶长时间暴露在x射线胶片上显示，TaSK1、BIN2、OsGSK7和TaGSK1具有明显的自磷酸化活性(图2)3.而GST-TaSK2则观察到较弱的信号。

这些数据表明克隆的TaSK1和TaSK2是功能活跃的激酶。

TaSK1和TaSK2属于植物gsk的II支系

核心真子叶植物的基因组芸苔科拟南芥包含10个不同的gsk。这些要求已按其顺序分为以下三个[12或四[41]主要分支。我们对百合属植物知之甚少。禾本科gsk及其系统发育关系的比较拟南芥．因此，选择的gsk的系统发育关系禾本科来Arabidospsis对其他所选的真子叶植物进行了调查和分析。

的禾本科科包括12个亚科，其中Pooideae, Ehrhartoideae和Panicoideae它们为人类提供了大部分营养。除了小麦(小麦)Pooideae包含像大麦芽(大麦)和Brachypodium distachyon后者最近被提议作为新的草地模型系统[42]．栽培稻(大米)和玉米(玉米)被选为代表Ehrhartoideae和Panicoideae,分别。

拟南芥是一种古多倍体，在所谓的γ事件之后经历了两次额外的全基因组复制(wgd)，称为α和β事件，后者是一个三倍复制事件，导致许多或大多数被子植物的六倍体共同祖先[43- - - - - -45]．因此，两个核心真子叶的GSK序列，即芸苔属番木瓜和基部的蔷薇葡萄,均未暴露于最近α和β WGD事件特异性十字花科或者是γ复制后的其他事件，被纳入本研究[46- - - - - -48]．此外，GSK序列的耧斗菜coerulae最基部或茎的真子叶(毛茛属)和苔藓的一个成员Physcomitrella金属盘以非种子植物为代表，加入系统发育分析。所有这些植物的基因组都被完全测序了。

除了出版的大米GSK和拟南芥ASK基因序列[7，41]，通过注释挖掘和BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)搜索(附加文件)在不同的数据库中识别出其他gsk的序列1)。

除了TaSK1-A,B,C和TaSK2-A,B,C外，数据库中仅鉴定出另外4个小麦GSK序列。考虑到小麦基因组由于其大小(16000 Mb)和多倍体的复杂性，这个数字显得很低。一旦全基因组测序数据在开放获取数据库中可用，可能会鉴定出更多的序列。在数据库中发现28种不同的玉米gsk(附加文件)1)。然而，其中10个亚组被区分出来，预测蛋白的一致性在97 - 99%之间。玉米是二倍体，用于产生cdna的组织来自不同的杂交体[49，50]．因此，我们假设每组中预测的蛋白质可能相同，观察到的差异可能是由于菌株多态性或高通量测序方法固有的测序伪影引起的，分别是基因结构预测的差异。因此，在每个组中选择一个加入作为该组的代表(附加文件)1)。

如前所述，之前的系统发育分析鉴定出了不同的植物GSK分支，命名为I至IV [12，41]．这个分支的命名法是根据拟南芥和水稻GSK支系成员。对于这些先前定义的亚科，邻域连接(NJ)树支持进化枝II(蓝色)，进化枝IV(绿色)和进化枝I(黄色)为单系，具有引导支持89-99(附加文件)2)，而最大似然(ML)树支持进化枝III(紫色)，进化枝IV(绿色)和进化枝I(黄色)，具有59-72四重奏支持(附加文件)3.)，贝叶斯推理(BI)树支持进化枝III(紫色)、进化枝II(蓝色)和进化枝IV(绿色)，后验概率为0.84-0.99(图2)4)。因此，进化支IV(绿色)被所有三种方法支持，而蓝色(II)，黄色(I)和紫色(III)进化支被三种方法中的两种支持为单系进化。

在所有三棵树中，TaSK1-A,B,C和TaSK2-A,B,C序列分别与其他禾本科的相关序列可靠地聚类在两个密切相关的亚枝中(图2)4、附加文件2和3.)。在BI和NJ树中，这两个包含TaSK1-A,B,C和TaSK2-A,B,C的亚枝被嵌入到一个单系进化枝II中(蓝色)4、附加文件2)。有趣的是，进化枝II包括ASKeta/BIN2，以及它的近亲ASKdzeta和ASKiota4），这三种都与油菜素内酯信号有关51]．迄今为止，在数据库中发现的小麦gsk中，没有一个被归类为III类，其中包括ASKtheta，显示它也参与油菜素内酯信号传导[22]．然而所有其他的禾本科在该分支中至少有一个GSK代表(图2)4)。

的存在Physcomitrella金属盘在所有三个分析的支持下，专门在绿色进化枝基部的类比表明，进化枝IV(绿色)是祖先的进化枝(已经存在于最早的陆地植物中)，所有其他家族成员随后都是从它进化而来的(图2)4、附加文件2和3.)。有趣的是，谱系特异性的获得和保留类似物发生在Physcomitrella金属盘使现存的同类植物数量达到7个，与种子植物的数量相当(见下文)。三对平行染色体可能来源于已知发生在这一谱系中的WGD [52]．

系统发育所揭示的总体主题是，每个苦子叶植物物种每个亚科都有一个(绿色，紫色)，两个(蓝色)或两个/三个(黄色)序列4)。在绿(祖先)进化枝号答:coerulea序列是存在的。最有可能的是，这个序列已经遭受了二次损失，或者没有合适的基因模型来描述这个序列。紫色进化支缺少一个c .木瓜然而，由于截断的基因模型，该序列已被删除(cf. Methods)。黄色分支有三个诉酿酒用葡萄另外三个物种各有两个基因和两个基因，树状拓扑表明后两个基因的继发性损失(图2)4)。综上所述，这些结果指出，在伽马事件后，在原始的苦子叶植物基因组中存在6个(可能7个)gsk。从百合科分离出来之后

Liliopsida的系统发育，考虑到完全测序的基因组(除了h . vulgare和t . aestivum)，表明这些物种中的每个进化枝通常有一个(紫色，绿色)，三个(黄色)或三个/四个(蓝色)GSK序列。进化支I(黄色)不包括第三个进化支玉米葛兰素史克。该序列已被删除，因为它是不完整的(参见方法)。在进化系II中发现了第四个水稻GSK。综上所述，这些数据表明，在百合的祖先从真子叶分化出来的时候，它的基因组中存在8个gsk。

小麦非受体丝氨酸/苏氨酸激酶知之甚少。据我们所知，TaGSK1参与耐盐性的是迄今为止在小麦中研究的唯一多基因家族成员[53]．我们确定了两个表达的基因序列，称为TaSK1和TaSK2在小麦基因组中。蛋白质序列分析清楚地显示GSK标志。特别的是，它们都有一个酪氨酸残基在GSK-3β的tyr216的等效位置，其磷酸化状态调节激酶活性。BSU磷酸酶将等效的BIN2酪氨酸残基(Tyr200)去磷酸化，后者是BR信号的正调节因子，抑制BIN2的激酶活性[20.]．在人类中，这种位于激活环中的酪氨酸残基的磷酸化被认为是通过使结合位点更容易接近来促进底物结合[35，36]．虽然Tyr 216的磷酸化并不是激酶活性的严格要求，但有人提出它可以显著提高GSK-3β的催化活性[35，37]．TaSKs也含有与GSK-3β的Arg 96, Arg 180, Lys 205相同位置的残基，尽管这些残基与TaSKs活性的相关性尚不清楚。在GSK-3β的情况下，这些残基形成一个用于结合引物底物的口袋。GSK-3β偏爱先前在GSK磷酸化位点的4个氨基酸C末端被另一激酶磷酸化的引物底物[35，36，38]．建议将引物底物与这个口袋结合，以便将它们正确地定位在催化槽中，以便随后被GSK-3磷酸化，并稳定酶的活性构象[35，36，38]．在动物中，紧密的激酶-底物对接相互作用也可以通过一种不同的机制实现，该机制涉及支架蛋白同时结合GSK3及其底物[6]．人类和植物对这种口袋的需求似乎不同。尽管BIN2含有用于结合引物底物的口袋，但该激酶已被证明通过不同于哺乳动物中描述的两种常见对接机制直接与BZR1相互作用[39]．磷酸化导致胰岛素通路中GSK-3β抑制的Ser9残基[38[]在TaSKs中不存在，就像BIN2的情况一样[7]．丝氨酸9残基的磷酸化产生一种引物假底物，该底物在分子内结合到引物底物结合的口袋中，从而以竞争性的方式阻碍GSK-3β对真底物的磷酸化[35，36，38]．因此，任务的抑制必须依赖于另一种机制。

在体外激酶活性测定表明TaSKs是功能性活性激酶。此外，它们还能够进行自磷酸化。在BIN2和ASKtheta中也观察到自磷酸化[22，54]．BIN2的Tyr 200已被鉴定在体外通过质谱分析作为主要的自磷酸化位点[20.]．tyr200突变为Phe大大降低了BIN2底物的磷酸化[20.]．对人GSK-3也观察到类似的效果[35，37]．然而，任务的自磷酸化的功能相关性仍有待阐明。

TaSK1和TaSK2预测的蛋白质具有88.3 - 88.8%的共一性。对于每个基因，鉴定了位于同源染色体上的三个基因拷贝。事实上，利用四染色体组-无染色体组的染色体定位解开了这个谜团TaSK1-A, B, C分别位于染色体3B、D和A上TaSK2-A, B, C在1B、A和d染色体上鉴定出TaSK1-A, B, C范围从98.8到99%，而由TaSK2-A, B, C显示99.3 ~ 99.5%的标识．

六倍体小麦的进化史包括两次多倍体事件[55]．在大约50万至36万年前的第一步，两个二倍体物种之间发生了杂交小麦属植物urartu(基因组^u一个^u)，而且很可能山盾草(基因组SS，接近BB)。六倍体小麦起源于栽培的四倍体小麦的杂交小麦属植物turgidum(基因组BBAA)二倍体陶氏Aegilops tauschii(基因组DD)大约一万年前。

有趣的是TaSK1-A和-B，最接近的两个基因拷贝TaSK1,以及TaSK2-A和-C，最接近的两份TaSK2,分别位于基因组B和D上山羊草属物种的贡献。

因此,任务是生物系统复杂性的完美例子。它们属于编码多任务蛋白的多基因家族，它们在小麦中分别由三个同源基因拷贝代表。在此背景下要解决的一个非常有趣但具有挑战性的问题是……的相关性任务亚官能化、新官能化、甚至非官能化的同源物和同源物。

这个问题是在异体多倍体观察到的同源基因表达偏差的光特别感兴趣Gossypium［56，57]．弗拉格尔的研究et al .,(2008) (57研究表明，对于很大一部分参与花瓣转录组的棉花基因来说，这种偏倚是由长期的进化过程造成的，包括重复基因的新功能化和亚功能化。对于一小部分基因，偏表达模式被认为是由于基因组合并而立即发生的多倍体化。亚当et al。(2003) (56观察到大量被分析的棉花基因显示出发育调节的沉默或偏向表达。据报道，同源物在不同器官中的相互沉默使得两个基因在植物的不同部位保持功能，这表明亚功能化。

虽然植物gsk可能通过差异转录产生，但值得注意的是它们是由一个多基因家族编码的。相比之下，人类基因组包含三个仅由两个基因编码的GSK3亚型[58，59而不同的同种异构体果蝇SHAGGY起源于单个基因的选择性剪接[60]．与动物相比，植物中其他蛋白质(如MADS-box转录因子)的基因数量也更多[61]．植物显然比动物更倾向于基因复制，然后是功能多样化[61，62]．

系统发育关系指出，这两个任务都是GSK II组的成员，GSK II组分别属于ASKiota、ASKdzeta和BIN2。这三个ask都与油菜素内酯信号有关[13，14]．对MADS box蛋白等多基因编码家族的研究表明，初级结构与调控功能之间存在很强的相关性[61]．这就提出了一个问题，即单胞任务属于第二组是否与BR信号中的功能相关，如下所示拟南芥第二组问。

参与油菜素内酯信号传导的ask数量表明具有高冗余性。然而，ASKtheta和BIN2对BRZ1/BES1/BEH2家族转录因子的结合特异性对于每个因子是不同的[22]．此外，BIN2、ASKdzeta、ASKiota和ASKtheta的表达模式不同，但有一定程度的重叠[23，24]．尽管存在冗余，但这些观察结果指向油菜素内酯信号的某种功能专门化。

TaSK1和TASK2在蛋白水平上具有较高的同源性。氨基酸序列分析表明，在植物或动物中发现的所有与功能、分类、抑制或稳定性相关的基序和残基在两种蛋白中都是相同的。唯一的例外是与GSK-3β的tyr216和BIN2的tyr200位置相等的功能性Tyr旁边的氨基酸。这个残基在TaSK1中是丙氨酸而不是丝氨酸。有趣的是,一个Physcomitrella7个gsk中也显示了这种氨基酸变化。关于TaSK1对TaSK2可能的功能特化的第一个提示可能来自于发育、器官和亚细胞表达模式。

被子植物在其进化早期经历了全基因组复制(WGD)，即所谓的古倍化[63]．γ WGD是一个三倍复制事件，导致许多或大多数被子植物的六倍体共同祖先。γ事件的位置仍不清楚。人们提出了不同的分裂点，即(1)在苦子叶类和百合子叶类分离之前，(2)在所有苦子叶类的共同祖先中，(3)在蔷薇类和小行星类分离之前，最后(4)作为蔷薇类宽复制[4]。64]．最近，有强有力的证据表明，在接近核心的地方(百合科和苦子叶科分裂之后，在菊科分离之前)曾发生过苦子叶的多样化[64]．此外，还有另外两个WGD发生的假设，一个发生在种子植物的共同祖先，另一个发生在所有被子植物的共同祖先，都发生在伽马事件之前[45]．此外，最近的α和β WGD事件发生在十字花科［44，45］．一个被称为σ的多倍体事件被认为发生在百合科谱系从真子叶植物分化出来之后，而最近的事件ρ发生在谷类谱系的主要谷类谱系的辐射之前[65]．

我们的系统发育分析，基于谱系特异性同源物的存在，表明许多基因在答:芥禾草来源于比γ事件更晚的WGD、片段重复或最近的多倍体。如果忽略这些类似物/同源物，进化支III和进化支IV各含有一个基因。进化枝I和II分别显示了双子叶植物和百合属植物的两种或三种祖先相似物。然而，进化枝I的祖先情况可能是如上所述的双子叶植物的三个类似物，这可能会因次要损失而变得复杂。Liliopsida(这里:禾草)、茎硬子叶植物和核心硬子叶植物都显示了由6到7个基因组成的同一祖先组的证据，这一事实允许两种可能的解释:i)相似物来源于γ事件，在这种情况下，它可能发生在Liliopsida/ ediotyleia分裂之前;ii)相似物在上述一个或两个更古老的WGD之后被保留下来。确定哪种情况更可能发生超出了本研究的范围。

TaSK1-A,B,C和TaSK2-A,B,C分别聚集在两个密切相关的亚分支中。这两个不同的亚科很可能来自草类共有的最后一次全基因组重复(ρ事件)[45，65]，而每个簇中的三个序列很可能代表来自近期多倍体化的同源，这已经推断出它们在同源染色体上的定位。

大规模复制后基因的保留被认为是有偏见的，取决于基因的功能[66，67]．事实上，在发育、转录调控和信号转导中起重要作用的基因——因此在生物复杂性和形态多样性中起主要作用——被认为在陆地植物WGD事件后保留的可能性更高[63，68]．

小麦六倍体基因组中的两个GSK同源物, TaSK1和TaSK2在蛋白水平上具有88%的同源性。它们的同源基因拷贝分别定位在同源染色体3B、3D、3A和同源染色体1B、1A、1D上。任务显示了在植物或动物中发现的与GSK功能、分类、抑制或蛋白质稳定性相关的所有基序和残基。分别对GST融合蛋白的激酶和自激酶活性进行了检测和确认在体外激酶化验。系统发育分析显示，两者均属于GSKⅱ支系拟南芥它们的成员都参与油菜素类固醇信号传导。基于所有陆生植物最后共同祖先的一个单一祖先的毛茸茸样激酶，通过祖先的WGD事件获得并保留了类似物，使被子植物的碱基数量达到6 - 8个。最近的WGD或片段重复事件在一些谱系中增加了10个。

这些发现为探索百合属植物奠定了基础禾本科gsk在植物发育中起作用。任务序列包括同源和同源基因拷贝，允许解决这些基因拷贝在亚，新，甚至非功能化方面的相关性。在分子和系统发育水平上获得有关任务的知识，但也有其他选择禾本科GSKs提供了一个框架来评估BR信号的功能在II支被子植物GSKs中是否具有进化保守性。系统发育分析揭示了在全基因组重复事件背景下被子植物GSK同源物的获得和保留，并提供了百合科/真子叶科GSK祖先基因集的信息。

基因的克隆与测序任务cDNA和基因组克隆

的cDNA片段TaSK1该基因最初是通过抑制减法杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)方法构建的胚胎cDNA文库筛选得到的。对于SSH，从胚材料中分离总RNA小麦cv Sonora使用TRIzol®试剂(Invitrogen)。Dynabeads Oligo (dT)₂₅从Dynal中纯化mRNA。根据供应商的说明，使用PCR-select cDNA消减试剂盒(Clontech)进行SSH。基因片段的5 '和3 '端由制造商推荐的BD SMART™RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)生成。

采用多种克隆方法获得了植物的基因组序列和cDNA序列TaSK1-A, B, C和TaSK2-A, B, C．

提取总RNA和基因组DNA小麦根据制造商的建议，分别使用RNeasy®Mini Kit和DNeasy®Plant Mini Kit (QIAGEN)进行检测。

使用SuperScript™II逆转录酶(Invitrogen)， RevertAid™H负第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas)或Bca制造商推荐的BEST™RNA PCR试剂盒(Takara)。标准PCR程序或PCR使用Bca采用BEST™RNA PCR试剂盒(Takara)扩增cdna。

基因组DNA通过传统的PCR扩增，可能包括使用BcaBEST™RNA PCR试剂盒(用基因组DNA代替cDNA)，反向PCR [69]或热不对称交错PCR [70，71]．

PCR产物克隆于PCR®II-TOPO®、PCR®2.1-TOPO®和PCR®-Blunt®载体(Invitrogen)。测序外包给GATC Biotech AG, Agowa GmbH, Eurofins MWG GmbH和Sequence Laboratories Göttingen GmbH。

测序TaSK1/TaSK2利用CLUSTALX2.0.12、快速傅里叶变换(MAFFT) v6.717b和MUSCLEv3.8算法对cDNA和基因组克隆进行人工组装、比对和亚分组。利用系统发育树程序Figtree v1.3.1和Quicktree-SD对克隆的基因组和cDNA序列进行亚群分析。

在GenBank数据库中保存的基因组和cDNA序列的登录号如下:TaSK1A [GenBank: JX307288, GenBank:JX294419]， TaSK1B [GenBank:JX307289, GenBank:JX294420]， TaSK1C [GenBank:JX307290, GenBank:JX307292]， TaSK2A [GenBank:JX307291, GenBank:JX307293]， TaSK2B [GenBank:JX312689, GenBank:JX312688]， TaSK2C [GenBank: JX312691, GenBank:JX312690]。

染色体定位任务

零体-四体系(cv Chinese Spring)最初由Sears建立等．(1966) (33]是由美国农业部(USDA)的国家小谷物种质研究机构提供的。

采用标准CTAB-DNA分离法提取基因组DNA [72]．

扩增的特异性引物TaSK1-A, TaSK1-B和TaSK1-C序列分别为SF97/SR96、SF61/SR98和SF99/SR101(表1)2)。扩增的特异性引物TaSK2-A，TaSK2-B和TaSK2-C分别为SF104/SR105、SF102/SR102、dCAPS-T2C-F/dCAPS-T2C-R(表2)。TaSK2-C扩增子随后用RsaI核酸内切酶。

以索诺拉和山齿鹑的dna为对照，根据cv设计引物。索诺拉任务序列。

在体外激酶活性测定

将TaSK1、TaSK2、BIN2、OsGSK7和TaGSK1全长蛋白的n端克隆到带GST标签的框架中。

GST-TaSK1、GST-TaSK2、GST-BIN2、GST-OsGSK7和GST-TaGSK1融合蛋白在大肠杆菌。在天然条件下通过Gluthatione Sepharose 4B树脂纯化。在体外加入10 μl纯化的gst融合蛋白，20 μl激酶活性缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.4, 15 mM MgCl)进行激酶反应_2，5 mM EGTA, 1 mM DTT)含ATP γ³²P和Jonak描述的牛髓鞘碱性蛋白(MBP，片段)等.， (2000) [27]．室温孵育45分钟，加入10 μl SDS-Page上样缓冲液停止反应。在95°C下变性1分钟后，在12% SDS/PAGE凝胶上迁移后，通过放射自显影分析蛋白质磷酸化。

系统发育分析

通过注释挖掘和BLAST搜索对GSK同源物进行初步筛选后，在选择的基因组中使用BLAST(切断30%的同源性和80个氨基酸的同源长度)检测同源物。所选谱系的GSK序列来源于EnsemblPlants、The Arabidopsis Information Resources (TAIR)、Plant Genome DataBase (PlantGDB)、Phytozome、GenBank、Hawaii Papaya Genome Project ASGPB和Rice Genome annotation Project (RGAP)数据库。目前的数据集只包含从完全测序的基因组中确认的基因，除了大麦芽和小麦。对鉴定的序列进行分析，以确定相关GSK基序和残基在蛋白质或预测蛋白质水平上的存在。只有禾本科具有转录水平证据的序列被纳入本研究。初始系统发育树的管理导致重复序列的丢弃。在初始树中，不属于带注释的粗毛激酶的序列被一个长分支隔开;除了两个序列外，其余序列都被丢弃，其余序列作为外组。蛋白质加入或基因座名称在附加文件中列出1．

利用M.A.F.F.T. v6.717b对全长氨基酸序列进行多重比对[32]在“自动”模式下，随后使用Jalview v2.7手动管理(删除对齐质量差的区域)[73]，得到501列用于系统发育推断。两个玉米[EnsemblPlants:GRMZM2G075992_P01, GRMZM2G332798_P01番木瓜[ASGPB: CARPA_18.208]序列没有被纳入系统发育分析，因为基因模型不完整，覆盖不到50%的比对，因此序列在初始系统发育中被放置在很长的分支上。最终拓扑是通过使用QuicktreeSD的neighbor - joining (NJ)来推断的[30.，74使用TreePuzzle v5.2，通过最大似然(ML)分析1000个bootstrap样本[75]和贝叶斯推理(BI)，使用MrBayes v3.1.2，具有8个伽马分布率和2个热/ 2个冷链，用于200万代。ProtTest v1.3 [76]用于确定最适合数据集的模型，结果是具有gamma分布率和不变位点的JTT，因此应用于ML和BI推理。这些树在树枝上是外群根的，导致了两种相关的、不蓬松的类型答:芥激酶[TAIR: AT1G73690.1, AT1G67580.1]。

这项研究得到了德国研究委员会对费舍尔-伊格莱西亚斯和冈瑟·纽豪斯的资助。Thomas Bittner获得了LGFG (LandesGraduiertenFörderungsGesetz)奖学金。我们感谢Eija Schulze出色的技术援助。我们非常感谢Tim Kunkel的语言更正。

从属关系

1. 德国弗莱堡大学细胞生物学，Schaenzlestr. 1，德国弗莱堡D-79104

   Thomas Bittner, Sarah Campagne, Gunther Neuhaus和Christiane Fischer-Iglesias

2. 弗莱堡大学生物学院和生物信号研究中心，Schaenzlestr. 1，弗莱堡，D-79104，德国

   Stefan A Rensing

3. 细胞生物学，马尔堡菲利普斯大学生物学院，Karl-von-Frisch-Str。8、马尔堡，D-35043，德国

   Stefan A Rensing

相应的作者

对应到克丽丝汀Fischer-Iglesias．

作者的贡献

TB对分子表征的实验设计做出了重大贡献，的拷贝数测定和染色体定位任务，以及在体外激酶活性测定。SC进行了SSH并启动了分子表征TaSK1和2.GN参与了结果讨论。SAR对实验设计和手稿撰写的系统发育分析做出了重大贡献，并进行了贝叶斯、最大似然和邻居连接分析。CFI构思并协调了该项目，对系统发育分析做出了重要贡献，并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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