植物防御反应的细胞外代谢产物的抑制gydF4y2Ba两gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba烟gydF4y2Ba在gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

两gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba烟gydF4y2Ba（gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba)是烟草野火病的致病因子。几个pathovarsgydF4y2Ba两gydF4y2Ba产生一种被称为冠状嘌呤(COR)的植物毒性细胞外代谢物。COR已经被证明可以抑制植物的防御反应。有趣的是,gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba不产生COR，但仍然积极抑制早期植物防御反应。目前还不清楚是否gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba产生任何在细菌发病机制期间主动抑制早期防御的任何细胞外代谢物。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细胞外代谢物提取物(gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba显著抑制非宿主病原体诱导的气孔关闭和非宿主超敏反应(HR)细胞死亡，gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2BaT1 (gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1),gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba．我们还发现，非宿主病原体的积累，gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1和gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba．glycineagydF4y2Ba（gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba)，增加了gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba处理后的植物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。病原体相关分子模式(INF1)、基因间相互作用诱导HR细胞死亡(gydF4y2Ba美国专利商标局gydF4y2Ba/gydF4y2BaAvrPtogydF4y2Ba和gydF4y2BaCf-9gydF4y2Ba/gydF4y2BaAvrCf-9gydF4y2Ba)和乙醇无延迟或抑制gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。我们进行了代谢物分析，以研究来自的细胞外代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba利用UPLC-qTOF-MS鉴定了49种细胞外代谢产物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba浮在表面的文化。结果表明，该基因表达谱gydF4y2BaPR-1, PR-2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR-5gydF4y2Ba，gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2Ba，gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba,gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba表明,gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细胞外代谢产物可能干扰sa介导的防御途径。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在这项研究中，我们发现gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物可抑制非寄主病原菌诱导的植物气孔关闭和非寄主HR细胞死亡等防御反应gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1的gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

叶面细菌、植物病原等gydF4y2Ba两gydF4y2Ba种类以附生植物的形式在植物叶片表面生存[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在初始侵染过程中，病原菌产生毒力因子，包括效应蛋白和次级代谢物，使早期植物防御反应如气孔免疫失活[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]和感染部位的超敏反应(HR)细胞死亡[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．早期病原识别失败延迟了下游防御级联的启动，并导致植物疾病症状的发展。因此，早期植物防御反应的抑制是细菌病原体成功殖民植物组织的重要步骤之一，导致疾病。gydF4y2Ba

长期以来，人们一直认为气孔是植物病原菌的被动入口。然而，最近的研究表明，气孔作为植物固有免疫系统的一部分，在限制细菌入侵方面发挥着积极的作用[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．鞭毛蛋白(鞭毛蛋白)、脂多糖(脂多糖)和延伸因子Tu (EF-Tu)等多种细菌病原菌相关分子模式(PAMPs)诱导叶表皮表皮的气孔关闭gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．目前认为，气孔关闭是一种常见的植物防御反应，由感知细菌PAMPs引起，限制细菌入侵植物。然而，某些细菌病原体已经进化到传递特定的毒性因子，如冠状嘌呤(COR)，以克服pamp触发免疫(PTI)和基于气孔的防御。gydF4y2Ba

COR是一种非宿主特异性的、非蛋白性的毒力效应因子，由几种致病菌产生gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这是研究最广泛的植物细菌次生代谢产物之一，调节植物激素防御信号，作为一个基于气孔的免疫抑制因子。COR在结构和功能上与12-氧植物二烯酸(12-OPDA)和茉莉酸异亮氨酸(JA- ile)等茉莉酸类化合物相似，并激活拟南芥和番茄中的茉莉酸通路[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．致命的病原体gydF4y2BaPgydF4y2Ba．gydF4y2Ba两gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba应变DC3000 (gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000)在植物表面产生COR，重新打开封闭的气孔，允许细菌增加进入[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．一个gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000突变(gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3118)，当浸接种或喷接种拟南芥和番茄叶片时，其毒性已严重减弱[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．然而，这种缺陷可以在拟南芥突变体中恢复(gydF4y2Bafls2gydF4y2Ba，gydF4y2Baost1gydF4y2Ba和gydF4y2Bagpa1gydF4y2Ba)，在ABA和pamp调节的气孔关闭中有缺陷[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

相比于对产生co的细菌病原体所做的大量研究，它在很大程度上被忽视了其他病原体gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba没有COR也可能产生非蛋白毒性因子来抑制植物的固有免疫。gydF4y2Ba黄定gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba定gydF4y2Ba（gydF4y2BaXccgydF4y2Ba)，其宿主范围广泛，包括gydF4y2Ba十字花科gydF4y2Ba显示家庭在拟南芥中克服气孔防御[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．由…分泌的细胞外代谢物gydF4y2BaXccgydF4y2Ba是由gydF4y2BarpfgydF4y2Ba(致病因子调控)基因簇。这gydF4y2BarpfgydF4y2Ba突变株的gydF4y2BaXccgydF4y2Ba而乙酸乙酯提取物能使气孔恢复闭合gydF4y2BaXccgydF4y2Ba将培养上清添加到拟南芥突变株中[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．其他两个gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba菌株，gydF4y2Bap .年代gydF4y2Ba．pv。gydF4y2Ba烟gydF4y2Ba（gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba),gydF4y2Bap .年代gydF4y2Ba．pv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba菌株T1 (gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1)，不产生COR，但这些菌株分别能在烟草和番茄植株中积极打开气孔[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

超敏反应(Hypersensitive response, HR)是对病原菌的另一种重要的早期防御反应。HR与防御有关，防御高度表现为细胞快速死亡的发展。从细菌病原体中已经描述了一些HR激发子。植物细菌无毒蛋白(Avr)在含有相应植物抗性的不亲和相互作用中引起HR (gydF4y2BaRgydF4y2Ba）基因（基因抗性抗性介导的HR）。蛋白质产品的gydF4y2BaHRP.gydF4y2Ba(超敏反应和致病性)基因家族引起非宿主植物的HR(非宿主抗病介导的HR;nonhost人力资源)。非宿主HR细胞死亡是在许多植物中观察到的对非适应的细菌病原体作出反应的常见现象[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．的细菌效应蛋白gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba通过病原体III型分泌系统（TTS）注入植物细胞中以抑制宿主植物中的基底抗性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．tts和gydF4y2BaHRP.gydF4y2Ba-缺陷突变体不能引起非宿主HR细胞死亡或对宿主植物致病[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，来自gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000在抑制肿瘤中起着重要的作用gydF4y2BaRgydF4y2Ba-基因介导的番茄HR [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，也有研究表明gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaDC3000效应体AvrPto抑制非宿主HR细胞死亡gydF4y2Ba烟草benthamianagydF4y2Ba和番茄gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．我们最近表明，Cor也可以抑制非健康病原体引起的人力资源gydF4y2Ban benthmainagydF4y2Ba［gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在目前的研究中，我们报道了来自gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba抑制植物的防御反应，如气孔免疫和超敏反应(HR)细胞死亡。我们进行了细胞外代谢物分析gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba通过超高效液相色谱-混合四极杆飞行时间质谱(UHPLC-qTOF-MS)和分离的推测代谢产物参与早期植物防御反应的抑制gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．植物防御基因的表达模式表明，sa介导的防御途径可能受植物的胞外代谢产物的调控gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

细菌病原体,gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1，抑制寄主植物的早期防御反应，gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba分别和番茄gydF4y2Ba

早期感染过程gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba使用番茄中的T1gydF4y2BaGFPuvgydF4y2Ba表达细菌(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．喷雾接种5 d后，在长波长紫外光照射下，在感染部位观察到一些荧光点(细菌定植)gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在番茄里gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1感染。相比之下，只有少数荧光点被检测到gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子感染gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba在番茄植株上感染gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaA).我们也观察到两者gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1在各自的寄主植物中能够重新开放气孔并积极地进入质外体空间(图)gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).然而，当接种非寄主病原体时，番茄的大多数气孔仍然关闭，gydF4y2BaPstab。gydF4y2Ba类似的,大多数gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba当接种非宿主病原体时，气孔保持关闭，gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1。此外，接种gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1诱导典型非宿主HR细胞死亡gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba20小时内离开，同时寄主病原体gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在那个时间点没有引起任何可见的细胞死亡(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaC).我们推测非宿主的HR细胞死亡gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba由PAMPs或非宿主病原体效应物触发，gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1。这种PAMP和/或效应体触发的HR可能在过程中受到抑制gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba-gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba相互作用，从而导致接种后的疾病症状。这些结果表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba产生宿主特异性的毒力因子，以灭活气孔闭合，并且可能抑制PAMP-和/或效应触发的人力资源gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．这促使我们研究是否有任何细胞外代谢物(s)gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba可以使植物的防御反应失效。gydF4y2Ba

细胞外非极性代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba抑制非寄主病原菌引起的气孔关闭gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1gydF4y2Ba

我们准备了gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba研究是否抑制了气孔防御(如图所示)gydF4y2Ba1gydF4y2BaB)是由于细菌分泌的代谢物。由非寄主病原菌引起的气孔关闭gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1被抑制gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1与乙酸乙酯提取物的胞外代谢物混合gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba接种前培养上清液gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba为了确定抑制气孔关闭的代谢物是胞外产物还是胞内产物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba从培养上清液和细菌细胞微球中分别制备提取物。分离gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子漂浮在细菌悬浮液上gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1与最小培养基(MG;控制)或gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上层清液(gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba)，或gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细菌细胞丸(gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单元格。）。这gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba在培养4小时后，叶质内T1细胞数量显著增加(由于更多的细菌通过气孔进入)gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba与叶子中的细菌数相比，上清液gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单元格提取或控件(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaB)这些发现表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上清液具有抑制气孔关闭的作用。我们还检测到，与MG提取物相比，细胞提取物的细菌进入量略有增加，可能是由于存在剩余的少量gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细菌细胞丸的细胞外萃取物。gydF4y2Ba

PstabgydF4y2Ba提取物抑制由非HATHOST病原体触发的过敏反应（HR）细胞死亡gydF4y2Ba

非寄主抗病是植物抵御各种潜在病原体的常见防御机制。HR是植物与病原菌互作中常见的非寄主抗性现象。我们进一步检测从gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba（gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物)也能克服非宿主HR细胞的死亡gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1的gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．静脉滴注后16小时内发生HRgydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1（2.1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2BaCFU /毫升)gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．有趣的是，非宿主的HR细胞死亡在gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。此外,当gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单用提取物浸润，无明显症状gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

来确定gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物在毒力中发挥作用，我们检测了两种非宿主细菌病原体的生长，gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1和gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba光伏gydF4y2Ba．glycineagydF4y2Ba（gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba),在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子在gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。co-inoculation后gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1或gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba结果表明，两种菌种在接种面积上的菌落生长显著增加gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 +gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取并gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba+gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba共接种区提取物比gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1或gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2BaMG培养基提取物(模拟)(图gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC和gydF4y2Ba3.gydF4y2BaD)。gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba对两者来说都是一个gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1，接种后2 d，种群数量逐渐减少。细菌的数量gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物含量也有所下降，但种群数量高于模拟接种后的种群数量。两者均未发现明显的疾病症状gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba+gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取或gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 +gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba与模拟对照相比，接种区叶片中提取物的含量显著增加。gydF4y2Ba

为了检测代谢物的稳定性，gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba将提取物在95℃下处理5分钟并用三种非健康病原体渗透，gydF4y2Bap s。gydF4y2Bapv。gydF4y2BaphaseolicolagydF4y2Ba，gydF4y2Bap s。gydF4y2Bapv。gydF4y2BamaculicolagydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1。煮沸对非宿主HR细胞死亡的抑制程度gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba对所有被检测的非宿主病原体，提取物没有变化(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba然而，在注射器浸润处有细胞死亡，煮沸后出现褪绿症状gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物，提示毒力因子在gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba摘要可能受到干扰。调查是否gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上清提取物有抑制作用gydF4y2BaR -gydF4y2Ba基因和pamp介导的细胞死亡，我们瞬时表达gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gydF4y2BaAvr的gydF4y2Ba基因组合，gydF4y2Ba美国专利商标局gydF4y2Ba/gydF4y2BaAvrPtogydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),gydF4y2BaCf-9gydF4y2Ba/gydF4y2BaAvrCf-9gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子随着gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。此外，我们还表示gydF4y2BaINF1.gydF4y2Ba主要分泌的诱导素gydF4y2Ba5种gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba编码PAMP并导致细胞死亡gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba随着gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。从接种后24小时开始监测细胞死亡(HR)的发展。有趣的是,gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物没有抑制或降低对两者观察到的细胞死亡的强度gydF4y2BaRgydF4y2Ba-gydF4y2BaAvr的gydF4y2Ba-基因和pamp诱导的HR(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.此外，化学诱导的细胞死亡(20% EtOH)也不受影响gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取,这表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物特别抑制非宿主HR细胞死亡(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

细胞外代谢物的代谢物图谱gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba

为了进一步证明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba能否将代谢物分泌到生长培养基中，我们对gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba使用UHPLC-qTOF-MS培养基(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一种）。摘录的提取物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba培养基中含有分泌的代谢产物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba以及MG培养基。共49个胞外代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在用镁培养基中存在的代谢物（图中）检测gydF4y2Ba5gydF4y2BaB).细胞外代谢物谱包括用于区分独特代谢物的保留时间、特定离子(m/z)和相对强度;然而，它们没有化学注释(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。其中离子最丰富的M39 (1080.7322 (m/z))在定量上是黄酮类细胞外代谢物中的主要代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

防御相关基因的表达改变gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取gydF4y2Ba

SA已被证明在HR细胞死亡中发挥作用。我们测定了其基因表达gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba解剖…的参与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在SA介导的防御途径中提取物。表达gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba基因略微诱导gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BaMG提取液处理后6、12小时，可有效抑制MG的活性gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。我们没有检查的表达gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba在治疗Mg提取物和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。海拔高度gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba表达不gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种可能与注射器浸润造成的创伤应激有关。然而，当处理gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1，表达水平gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba显著诱导。引人注目的是gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba和gydF4y2BaPR5gydF4y2Ba基因转录本明显减少gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子的时候gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取液与gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1（图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。我们检测的表达水平gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba，细胞死亡的标记基因[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),后gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种。的表达水平gydF4y2BaHSR203JgydF4y2BaMG提取物和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取不gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。然而，表达水平gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba显著增加gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种，但诱导gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba在6 hpi时要低得多gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取,这表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物可以延缓非宿主病原体诱导的hr细胞死亡的信号传导(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.虽然，我们没有观察到任何可见的细胞死亡的浸润部位gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 /gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物，水平gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba表达式gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 /gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物与gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1/MG提取物在12 hpi。这些结果表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物下调sa介导的早期防御，抑制非宿主HR细胞死亡。确定JA信号是否被gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba植物防御素(gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2Ba)作为JA信号通路的标记。的表达水平gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2BaMG浸提物在针囊浸伤后12小时内表达量迅速增加，而gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在实验过程中，单独的提取物变化很小(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)，表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物甚至能抑制伤口引起的防御反应。当gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba用mg提取物接种T1和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba摘录，文字记录gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2Ba在6 hpi时升高，在12 hpi时下降(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.差异无统计学意义gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 + MG提取物gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 +gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提示ja介导的对病原菌的防御信号通路可能不是直接受其调控的gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba而sa介导的途径则相反。gydF4y2Ba

冠状核不敏感1 (gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba)基因参与对细菌病原体的气孔防御[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，我们检测了该基因的表达gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba来确定gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物以该基因的表达为靶点。表达的水平gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba渗透液体提取物和逐渐减少gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单独提取(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。这一发现与拟南芥基因表达数据在eFP Browser (gydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgigydF4y2Ba)，蒸馏水渗透后6小时和12小时基因表达下调。后nonhost病原体gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种,gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba基因显著下调gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba接种后6小时提取。然而,gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba表达模式,gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1接种表现与T1接种相似gydF4y2BaCOI1gydF4y2BaMG浸出物和MG浸出物的表达模式gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单独提取(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。这一发现表明gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba6 hpi时表达降低gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物可能会干扰gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba介导的防御通路。gydF4y2Ba

脱落酸（ABA）是用于调节气孔开口和闭合的临界植物血症。gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba是由ABA和ABA信号通路的标记基因诱导的。的表达gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba类似于gydF4y2BaCOI1gydF4y2BaMG浸膏和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单独提取(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。在拟南芥中,gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba在水或缓冲液浸润后6小时表达降低(gydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgigydF4y2Ba）.gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1感染未改变表达gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba与MG浸提液相比gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba单独提取(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba；额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S1)。此外，表达模式gydF4y2BaABA1gydF4y2Ba之间没有显着差异gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 + MG提取液接种叶片后，对叶片进行处理gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 +gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物接种叶子。gydF4y2Ba

对细菌诱导植物早期防御反应机制的研究揭示了植物-病原互作中的重要问题[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．值得注意的是，细菌已经进化到可以传递不同的毒性因子来击败复杂的植物防御系统[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．除了细菌可以传递到植物中的大量蛋白质效应物外，COR是第一个发现的有毒代谢物gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba可以抑制植物的防御反应[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．然而，我们仍然不知道是否有其他非产corpase的病原体gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba产生具有毒性作用的代谢物。目前尚不清楚来自细菌病原体的细胞外代谢物如何抑制植物的防御反应。gydF4y2Ba

在本研究中，我们证明了细胞外代谢物产生的非corgydF4y2Ba两gydF4y2Ba病原，gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba，能抑制植物的气孔关闭和非宿主HR细胞死亡等防御反应gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．大部分气孔位于植物表皮gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba接种与非质子病原体接种后3小时内gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1。这两个gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1和gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba不产生COR(由于缺乏参与COR生物合成的基因)，但它们仍然可以在各自的寄主植物中重新打开气孔(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.我们证明了gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物能抑制植物的气孔防御gydF4y2BaNgydF4y2Ba．gydF4y2BabenthamianagydF4y2Ba；但是，它是如何宣布的gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1抑制番茄的气孔防御。COR已被证明可以抑制拟南芥的气孔关闭[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，这对有毒细菌进入叶质非常重要。有趣的是，当非宿主病原体，gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1，被接种gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物，气孔关闭诱导gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1被抑制(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.这一发现表明，非corpproduction菌株gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba可能产生其他无特征的细胞外代谢物，这些代谢物可能在开气孔中具有与COR相似的功能。gydF4y2Ba

我们还发现，非宿主的HR细胞死亡由gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1的gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba接种时也被抑制gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.众所周知gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba产生引起褪绿病的tabtoxin，与烟草野火病和燕麦晕疫病的症状有关[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．Tabtoxin (tabtoxinine-β-Lactam, TβL)是一种无生物活性的二肽，需经肽酶水解生成有效的毒性成分tabtoxinine-β-Lactam (TβL)。TβL由细菌胞质中依赖锌的氨肽酶或植物细胞中的酶释放，并抑制谷氨酰胺合成酶，导致褪绿[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．Raaijmakers等人[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba描述由于毒素不稳定，证明Tβ1难以合成。Tabtoxin是一种相对不稳定的分子gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba在毒素提纯的过程中[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．已证明，在室温下，tabtoxin溶液的生物活性下降，半衰期约为一天[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．此外，褪绿是烟草毒素在烟叶中的最典型症状[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．因此，我们假设gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物不含tabtoxin。为了证明在气孔打开和HR抑制中起作用的是代谢物而不是活性蛋白，本研究采用gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba用1%甲酸乙酸乙酯有机溶剂提取培养上清。乙酸乙酯萃取法提取多肽gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba．我们还检查了是否gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物具有任何毒性活性gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。接种后的叶子没有产生任何明显的症状，而tabtoxin则会使叶子变黄(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

P. inringae.gydF4y2BaPathovars产生几种非效应型毒力因子，如毛蛋白，phaplootokin，mangotoxin和Cor [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．除COR外，所有这些植物毒素都是由小肽分子组成的。COR是一种非蛋白植物毒素，参与气孔打开和抑制依赖sa的宿主防御反应[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．COR从gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Bapv。gydF4y2Ba番茄gydF4y2Ba采用高效液相色谱分馏[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．然而，我们使用代谢组学方法分离生物活性代谢物(s)gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba使用UHPLC-qTOF-MS进行代谢物分析。代谢物谱测定了分泌的代谢物的总数gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在细菌培养中。这种代谢物谱分析技术已被有效地用于分离不同菌株中表达差异的代谢物[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．由于没有大量的代谢物（图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，我们可以进一步利用高效液相色谱法检测抑制气孔关闭和非宿主HR细胞死亡的生物活性代谢物。识别gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba未来抑制植物早期防御反应的细胞外代谢物将促进我们对细菌病原菌-植物感染的认识。gydF4y2Ba

水杨酸(Salicylic acid, SA)是一种重要的植物激素，调节气孔关闭和HR等防御反应[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．非强化病原体的细菌生长，gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba和gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1，明显高于gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba当他们与gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.这可能是由于sa介导的早期防御信号的抑制(图)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba或由于HR的抑制。接种3 d后，非寄主菌群水平逐渐下降，接种叶片未出现病害症状(图)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba一个和gydF4y2Ba3.gydF4y2BaB)表明gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物只能抑制早期防御反应，而不能作为致病性因子。gydF4y2Ba

我们决定是否gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba通过检测茉莉酸(jasmonic acid, JA)的水平来调节茉莉酸介导的防御途径gydF4y2BaPDF1.2gydF4y2Ba和gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba基因的表达。细菌毒力因子COR刺激JA通路，从而抑制拟南芥和番茄中的SA通路[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．已经证明，COR是目标gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba(SCFCOI1泛素连接酶的F-box亚基)/gydF4y2BaJAI1gydF4y2Ba(茉莉酸不敏感1)依赖途径促进对气孔免疫的抑制[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．JAZ蛋白是JA信号转导的阻遏因子，很少有JAZ蛋白(JAZ1, JAZ3和JAZ9)与之相互作用gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．也有证据表明gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba在植物-微生物相互作用中，在植物细胞死亡中起作用。当gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba是沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba，马铃薯X病毒引起细胞死亡(gydF4y2BaPVXgydF4y2Ba)被加速[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．提婆达斯等人[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba报道了一个gydF4y2Bahrl1gydF4y2Ba(超敏反应样病变1)gydF4y2Bacoi1gydF4y2Ba双突变体加重了细胞死亡病变，提示gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba对于细胞死亡限制是必要的。gydF4y2Ba

有趣的是，在我们的研究中，我们观察到非宿主的HR细胞死亡被抑制gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba但没有任何特定的R-AVR或PAMP触发细胞死亡有可能是未知的代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物可以特异性抑制非宿主抗性的防御机制。需要进一步的研究来分离代谢产物，并确定其在抑制非宿主HR细胞对病原菌死亡的作用。gydF4y2Ba

这里证明了另一个gydF4y2Ba假单胞菌gydF4y2Ba病原，gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在不产生COR的情况下，仍能积极抑制气孔防御和非宿主HR细胞死亡gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．这一发现清楚地表明gydF4y2Ba两gydF4y2Ba菌株可以产生除葫芦以外的代谢物，以抑制植物防御反应。隔离和表征的gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细胞外代谢物(s)将有助于更好地理解细菌病原体在寄主植物中引起疾病的策略。gydF4y2Ba

n benthamianagydF4y2Ba增长gydF4y2Ba

n benthamianagydF4y2Ba在无土盆栽混合料BM7 (Berger Co.， Quebec, Canada)上播种，在22 ~ 25°C的生长室内，光周期12小时，光强300 ~ 400 μmol mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}．将两周大的幼苗移栽到10 cm直径的圆形盆栽(BM7) (Berger Co.， Quebec, Canada)，每盆一株，在23°C的温室中生长，延长光照16小时，补充光照100 μmol mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}．植物定期施肥(20-10-20)。3到见面gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba这些实验用的是植物。gydF4y2Ba

番茄种子(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Ba简历。魅力)从斯托克斯种子公司(布法罗，纽约，美国)获得。植物在Scott-200®混合(美国俄亥俄州Marysville的Scotts Co.)中生长，并在生长室中维持(24°C, 40-70% RH, 12 h光周期，光子通量密度150-200 μmol mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}秒gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}）.将三周大的幼苗移栽到直径为10厘米的圆盆中，并保持相同gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物上面描述。gydF4y2Ba

代谢物提取物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba文化的上层清液gydF4y2Ba

从…中提取分泌的代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba，我们采用COR的提取方法，稍加修改[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．细菌菌株gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba在含有适当抗生素的KB培养皿上培养。一群gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba置于10ml甘露醇-谷氨酸(MG)培养基中(甘露醇，10g;l -谷氨酸2 g;KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba, 0.5克;氯化钠,0.2克;MgSO4, 0.2 g, pH7/升)，28°C, 250 rpm, 48小时。2.5 mlgydF4y2BaPstabgydF4y2Ba将培养物加入47.5 ml新鲜MG培养基中，18°C, 220 rpm，在旋转摇床中培养6天。这gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba培养物(150 ml) 3700 ×离心30 mingydF4y2BaggydF4y2Ba上清转移到无菌玻璃管中。这gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba用于分析细胞外代谢物的细胞内代谢物和上清液中的细胞粒料。用于提取细胞内代谢物，gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba细胞微丸置于装有5 ml含1% (v/v)甲酸的醋酸乙酯的玻璃瓶中，超声处理20 mingydF4y2BaggydF4y2Ba， 30分钟)和完全干燥，使用NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba气体。用于提取细胞外代谢物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上清液用含1%甲酸的乙酸乙酯萃取。培养上清液与酸化乙酸乙酯的比例为3:5。收集乙酸乙酯馏分，用NgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba气体。MG培养基无gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba按上述程序提取作为对照。将干提取物用600 μl 16.7%甲醇重悬于HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.在气孔和非宿主HR细胞死亡生物测定中，接种缓冲液(10 mM MES, pH 6.5)每毫升提取6 μl。gydF4y2Ba

抑制气孔关闭的试验gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取gydF4y2Ba

太平洋标准时间gydF4y2BaT1在KB培养基中28°C过夜。将培养菌3500 rpm离心10 min，以1×10浓度的纳米水重悬gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU /毫升。为了测定细菌通过气孔的迁移，分离gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子漂浮在细菌悬浮液上gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1含MG培养基萃取物或gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取1 ~ 4小时。培养后，收集叶盘，检测质粒内的细菌细胞数量。这个实验在相同的条件下重复了三次。气孔关闭试验采用表皮剥离试验[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．为了保证实验开始前大部分气孔都是开放的，植物在光照条件下保存3小时gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶片剥落后立即在气孔开放缓冲液(10 mM ms - koh, 30 mM KCl, pH6.3)上漂浮3小时。在不同时间点，用病原体、化学物质和细菌分泌的代谢物处理表皮。每个处理随机测量平均100个气孔孔径，每个试验取样3个样品，重复2次。gydF4y2Ba

抑制非宿主HR细胞死亡的试验gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取gydF4y2Ba

五个gydF4y2BaP. inringae.gydF4y2Ba物种，一个宿主(gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba)及四种非宿主病原体[gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1,gydF4y2Bap s。gydF4y2Bapv。gydF4y2BaglycineagydF4y2Ba（gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba)，gydF4y2Bap s。gydF4y2Bapv。gydF4y2BaphaseolicolagydF4y2Ba（gydF4y2BaPspgydF4y2Ba),gydF4y2Bap s。gydF4y2Bapv。gydF4y2BamaculicolagydF4y2Ba（gydF4y2BaPsmgydF4y2Ba被用来做这个实验。在KB培养基中加入适当的抗生素，在旋转摇床(250 rpm)上，在28°C下过夜。采用离心(3500 rpm/10 min)收集细菌，再悬浮于MES缓冲液(MES 10 mM, pH 6.5)中。将细菌悬液注射至充分膨胀gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶，以确定细菌生长(用于gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba）和非健康人力资源死亡（用于gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1)。以确定细菌的生长是否受gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物，非宿主病原体gydF4y2Ba巴黎圣日尔曼gydF4y2Ba不引起HR细胞死亡的细胞分别接种MG培养基和MG培养基gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取物。分别在0、1、3和5 d内检测胞质内的细菌数量。在非宿主HR细胞死亡试验中，每个代谢物样品被浸润gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2Ba用无针注射器给六周大的婴儿做T1gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。我们选择充分伸长的上部叶片进行接种。在所有的实验中，萃取物gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上清液和MG培养基分别作为阳性和阴性对照。以消除任何污染的蛋白质gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取液，95°C处理5 min。另外两种非宿主菌，gydF4y2BaPspgydF4y2Ba和gydF4y2BaPsmgydF4y2Ba,包括gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1随水煮接种gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取的gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba．在接种后12 ~ 72小时测定非宿主细胞死亡症状。gydF4y2Ba

确定的特异性gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba抑制非宿主HR细胞死亡的提取物，我们使用了几种gydF4y2BaAvr的gydF4y2Ba-gydF4y2BaRgydF4y2Ba基因组合(35 s:gydF4y2BaAvrPtogydF4y2Ba-35年代:gydF4y2Ba美国专利商标局gydF4y2Ba和35 s:gydF4y2BaAvr9gydF4y2Ba-35年代:gydF4y2BaCf9gydF4y2Ba) ［gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba分别在含抗生素的5 mL LB培养基中28℃培养24小时。细菌培养物1500 g离心10 min，用5 mL渗透缓冲液(10 mM吗啡酰亚乙烷磺酸(MES)和200 mM乙酰丁香酮)重悬。然后在室温下培养3 ~ 5小时。培养后，离心收获细菌细胞，稀释至5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2BaCFU /毫升(gydF4y2BaINF1.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba美国专利商标局gydF4y2Ba,gydF4y2BaAvrPtogydF4y2Ba)和2×10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU /毫升(gydF4y2BaCf9gydF4y2Ba和gydF4y2BaAvrCf9gydF4y2Ba浸润性)。gydF4y2Ba美国专利商标局gydF4y2Ba和gydF4y2BaAvrPtogydF4y2Ba,gydF4y2BaCf9gydF4y2Ba和gydF4y2BaAvrCf9gydF4y2Ba在渗透前将构建物按1:1混合gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba叶子。gydF4y2Ba

代谢物分析gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba上层清液提取gydF4y2Ba

干gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba用150 μl 80%甲醇重悬于HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和分析使用UHPLC-ESI (-) -qTOF-MS工具(水域总理qTOF)反相柱(ACQUITY UPLC™本·C18 1.7μm, 2.1毫米×150毫米),这是维持在60°C,和组件使用一个多步骤的梯度筛选了从95年的30%(水洗脱液,0.1%乙酸)超过30分钟,在流速0.56 mL/min下，30 ~ 5%超过3分钟和5 ~ 95% A超过3分钟。互补洗脱液B为乙腈。TOF-MS光谱采集条件为:光谱采集速率为3.13 / s;检测电压:2600 V;阈值:2037;应急服务国际公司:-4500 V;反溶剂温度:300°C;喷雾器压力:350kpa;接口:100°C。 Mass measurement accuracy was within 20 ppm. The MS system was calibrated using sodium formate, and raffinose was used as the lock mass for internal calibration. Data obtained from metabolite analyses were processed using MarkerLynx 4.1 (Waters) for accurate data mass extraction. Relative abundance was normalized by dividing each peak area by the value of the internal standard peak area.

确定被调制的防御信号gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取gydF4y2Ba

为了研究SA-、JA-和aba相关植物信号转导途径相关基因的表达模式，gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba在处理后的不同时间点采集叶片样品。分别在接种后0、6和12 h从叶片中分离到RNAgydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 +gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取(gydF4y2BaPstabgydF4y2Baext. /gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1)或gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1 + Mg中等提取物作为对照（MG Ext./gydF4y2Ba太平洋标准时间gydF4y2BaT1)。所有RNA样本用Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia california)提取，cDNA用Superscript III逆转录酶(Invitrogen, Grand Island, N.Y.)合成。RNA和cDNA的定量和纯度由NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, Del.)测定。的表情gydF4y2BaPR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaPR5, PDF1.2 ABA1,gydF4y2Ba和gydF4y2BaCOI1gydF4y2Ba，各ABA、SA和JA信号通路的代表基因gydF4y2BaHSR203JgydF4y2Ba对HR细胞死亡的影响，采用实时荧光定量PCR检测。每个样品至少3个生物学重复和3个技术重复进行实时PCR分析。不同RNA样本中每个基因的转录本数量与内控基因的转录本归一化gydF4y2BaNbActingydF4y2Ba以确保每个反应使用相同数量的cDNA。gydF4y2Ba

这项研究得到了塞缪尔·罗伯茨·诺贝尔基金会的支持。作者感谢Pierce Young (Texas A&M University)在2011年诺贝尔基金会暑期实习生项目期间提供的技术援助，感谢David Huhman先生进行UHPLC-qTOF-MS分析，感谢Hee-Kyung Lee进行RNA样本制备。我们也感谢Janie Gallaway和Colleen Elles对温室的支持，以及Jackie Kelley对手稿的编辑。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 塞缪尔·罗伯茨·诺贝尔基金会，植物生物学部门，阿德莫尔，OK, 73401，美国gydF4y2Ba

   Seonghee Lee，Dong Sik Yang，Srinivasa Rao Uppalapati，Lloyd W Sumner＆Kirankumar S MysoregydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaKirankumar年代迈索尔gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有任何相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

SL负责实验的主要部分;DY准备gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取并进行质谱分析gydF4y2BaPstabgydF4y2Ba提取;SRU对GFP进行共聚焦成像gydF4y2Ba紫外线gydF4y2Ba气孔和质粒空间中的-表达细菌;LWS设计了细菌代谢组学工作并编辑了本手稿;KSM参与了项目的设计和协调。手稿由SL和KM撰写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba