植物钙调蛋白基因的全基因组鉴定及功能分析茄属的物种

背景

钙调素(CaM)是真核生物中主要的钙传感器。它结合钙，并根据钙信号调节下游蛋白质的活动。然而，很少有人知道凸轮基因家族茄属的品种，包括经济上重要的品种，番茄(茄属植物lycopersicum)和基因沉默模式植物，烟草benthamiana．此外，CaM在植物抗病方面的潜在功能仍不清楚。

结果

我们进行了全基因组鉴定凸轮基因家族茄属的物种。采用生物信息学方法，多个全长凸轮基因是从番茄，n benthamiana还有土豆(美国tuberosum)基因组，番茄有6个凸轮的基因,n benthamiana有7凸轮基因方面，马铃薯有4种凸轮基因。序列比较分析表明，三个番茄基因，SlCaM3/4/5，两个马铃薯基因StCaM2/3，以及两套n benthamiana的基因,NbCaM1/2/3/4而且NbCaM5/6,编码相同的CaM蛋白，但基因包含不同的内含子/外显子组织，位于不同的染色体上。进一步的序列比较和基因结构和系统发育分析表明茄属的物种获得了一个新的群体凸轮进化中的基因。这些新凸轮基因是不寻常的，因为它们包含三个内含子，而已知的典型基因只有一个内含子凸轮植物中的基因。番茄凸轮（SlCaM)基因在所有器官中均有表达。5'上游序列中顺式作用元件的预测和表达分析证实了这一点SlCaM基因有可能对各种生物和非生物刺激高度敏感。此外，沉默SlCaM2而且SlCaM6改变了一组信号和防御相关基因的表达，导致抗性显著降低烟草拨浪鼓病毒卵菌病原体，瓜果腐霉。

结论

的凸轮基因家族茄属的种西红柿,n benthamiana土豆是通过全基因组分析确定的。这三种植物都有一小组编码相同CaM蛋白的基因，这可能表明植物有保留冗余或增强定量基因功能的策略。此外,茄属的物种进化出了一组新的凸轮进化中的基因。凸轮基因在植物对多种病原体的抗病能力中起着重要作用。

钙(Ca^{2 +})是植物细胞壁中必需的元素，是植物生长的重要营养物质。此外，Ca^{2 +}在真核生物中作为第二信使调节各种生物过程，以响应各种生物和非生物刺激[1- - - - - -4］．

钙调蛋白(CaM)是一种重要的钙^{2 +}传感器思想来解释Ca^{2 +}植物的特征。它是一种小蛋白质，通常只包含大约149个氨基酸。它有四个称为EF手的螺旋-环-螺旋基序，每个都能结合Ca^{2 +}［5］．

凸轮基因已经在几种植物中被发现。的全基因组鉴定凸轮模式植物物种中的基因，例如拟南芥还有大米[5- - - - - -7]，揭示了CaM蛋白通常是由基因家族编码的。此外，植物可能含有几种CaM亚型，这些亚型仅在少数氨基酸上存在差异，其中一种亚型由位于基因组不同染色体上的几个基因编码。例如，在拟南芥7个基因编码4种CaM亚型，其中CaM1而且CaM4编码一个相同的蛋白质序列和CaM2，CaM3而且CaM5也编码相同的蛋白质序列，与CaM1/CaM4亚型只有少数氨基酸不同。这四个拟南芥CaM异构体之间的差异仅在1 - 5个氨基酸上[5］．在水稻中，5个基因编码3种CaM亚型。OsCaM1-1，OsCaM1-2而且OsCaM1-3编码一个相同的蛋白质序列。OsCaM2和OsCaM3蛋白只有两个氨基酸不同。此外,凸轮基因已在其他植物物种中发现，如烟草[8]，土豆[9]和大豆[10］．然而，cam在很多地方茄属的物种，包括经济上重要的物种番茄和基因沉默研究的模式物种，烟草benthamiana尚未鉴定或鉴定。全基因组分析凸轮其他基因家族茄属的物种研究也尚未进行。

作为主要Ca^{2 +}传感器，cam在工厂中是多功能的。CaMs在植物生长发育和抗非生物胁迫中起着重要的调节作用[11，12］．例如，的过度表达AtCaM7在拟南芥促进光形态发生生长[13］．功能丧失的突变AtCaM2导致花粉萌发率显著降低[14］．金盏花CaM调控不定根发育[15］．表达的OsCaM1，MCaM3而且GmCaM4在水稻中，桑葚和大豆分别增强了抗旱性和/或耐盐性[16- - - - - -19］．

CaM在植物抗病方面的作用报道有限。大豆异位过表达凸轮的基因,SCaM4而且SCaM5，增强对疫霉parasiticavar。nicotianae，两pv。烟和转基因烟草中的TMV [20.]和top .两pv。番茄DC3000转基因拟南芥［21］．表达的CaCaM1促进活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的产生，并增加抵抗黄定pv。实验用胡椒[22］．击倒的NtCaM13表达增强了对Ralstonia solanacearum而且辣椒烟草[23］．CaM可以直接与CAMTA3/SR1结合，CAMTA3/SR1结合并负调控EDS1，从而下调水杨酸依赖的防御和抵抗[24］．CaM家族的不同亚型可能在植物防御调控中发挥不同的作用[25］．

利用最近公布的一些完整的基因组茄属的物种，我们进行了全基因组鉴定凸轮番茄中的基因家族n benthamiana和土豆。通过系统系统发育、基因结构和表达分析，我们发现了一组新的凸轮基因在茄属的，并证明了一小组基因编码相同的CaM蛋白序列，这可能是典型的植物[5- - - - - -7］．编码相同蛋白质的多个基因可以确保关键生命功能的冗余，或者可能需要产生足够的蛋白质产物。另外,多个凸轮基因可能是植物有效进化功能基因谬误的一种策略的证据。最后，我们提供的证据揭示了SlCaMs在抵抗病毒和卵菌病原体方面的功能。

的识别凸轮基因在茄属的基因组

识别凸轮基因组中的基因茄属的物种，全部四种拟南芥收集3个水稻CaM蛋白序列，并与SGN数据库进行TBLASTN搜索。http://solgenomics.net/)．在番茄、马铃薯(美国tuberosum),烟草benthamiana分别的基因组。这些序列与标准序列一致拟南芥用CLUSTALX程序对CaM (AtCaM2)进行测序，并通过GeneDoc查看AtCaM2的序列标识。序列进一步用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)及CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)程序来确认EF-hand域的存在，这是Ca的一个特征域^{2 +}绑定。与AtCaM2序列同源性超过90%且具有4个ef -hand的基因被定义为cam，遵循先前的先例[5］．比较分析了所有候选CaM的基因组序列、cDNA序列和蛋白序列。我们发现其中一种的cDNA和蛋白序列n benthamiana由于第二个内含子识别错误，之前存入数据库的CaMs (NbS00037851g0005.1)不正确。序列已校正(表1,数据1而且2)．最后是6号，4号和7号全长凸轮在番茄、马铃薯和马铃薯中鉴定出基因n benthamiana基因组。为了更好地反映出它们之间的同源关系茄属的而且拟南芥凸轮基因，我们称之为茄属的凸轮成员按照其系统发育和序列相似性的个体AtCaMs(表1)．

序列分析表明，所有茄属的CaM蛋白由149种氨基酸组成(表2)1)．用Pfam和CDD进行Motif分析，结果表明茄属的cam携带两对EF-hand结构域，对应于两个EF-hand 7 motif (PF13499)。序列对齐使用ClustalX演示了茄属的CaM家族的氨基酸序列高度保守，同源性超过90%(图1)．番茄cam编码SlCaM3，SlCaM4而且SlCaM5其余3种SlCaM蛋白与SlCaM3/4/5蛋白氨基酸序列相同，氨基酸序列91% ~ 99%相同。马铃薯StCaM2和StCaM3蛋白序列相同，StCaM1和StCaM4与StCaM2/3的氨基酸序列相同，分别为99%和91%。在这种情况下n benthamiana摄像头,NbCaM1，NbCaM2，NbCaM3,NbCaM4编码一个相同的蛋白质序列，和NbCaM5而且NbCaM6也编码一种相同的蛋白质。另外两个NbCaMs与NbCaM1/2/3/4的序列同源性为99%(表21,图1)．然而，核苷酸序列凸轮与蛋白质序列相比，基因家族更加多样化。核苷酸序列的同一百分比凸轮基因家族为79%-92%SlCaMs， 79%-91%StCaMs83%-98%nbcam，分别(附加文件1)．值得注意的是，即使编码相同CaM蛋白序列的基因也不相同。的编码序列SlCaM3/4/5，StCaM2/3，NbCaM1/2/3/4而且NbCaM5/6仅占88%-92%，86%，83%- 96%和99%(图2)．这些基因主要在编码三联体氨基酸的第三个核苷酸上有所不同(图2)．

除了凸轮上述基因的67、77和89等序列的番茄、马铃薯和n benthamiana分别从BLAST搜索中检索拟南芥和大米凸轮(附加文件2)．在这些序列中，番茄、马铃薯和马铃薯的序列分别为33、46和55n benthamiana它们分别短于200个氨基酸，含有ef -手，但没有任何其他已知的功能域。这些蛋白质序列被命名为茄属的类钙调素(CML)序列，遵循之前使用的标准[4］．在剩下的序列中，番茄29个，土豆30个，34个n benthamiana序列比典型cam长，含有500多个氨基酸，不仅含有EF-hand结构域，还含有蛋白激酶结构域;这些可能是钙依赖性蛋白激酶的候选者。

基因结构和染色体定位茄属的凸轮基因

发现几个基因编码相同的CaM蛋白在各种茄属的《物种》促使我们对其基因结构和染色体位置进行研究凸轮不同物种的基因。将基因组DNA序列与相应的cDNA序列进行比较，结果表明凸轮基因被内含子中断。值得注意的是拟南芥凸轮携带单个内含子的基因，内含子的数量是不同的Solanacous凸轮基因，有一个在SlCaM1来SlCaM5，StCaM1来StCaM3七个都是nbcam3个内含子SlCaM6而且StCaM4(表1和图3.)．有趣的是,所有茄属的凸轮基因被Gly26密码子中的第一个内含子破坏，类似于先前报道的拟南芥凸轮［5］．对于含有3个内含子的基因，第2和第3内含子的中断位点分别为Asp70和Leu106密码子。中断Gly26密码子的内含子为phase 1型，其余两个为phase 0型(图3.)．此外，一般情况下，内含子的大小明显较长茄属的摄像头相比之下,拟南芥凸轮但与大米的长度相似摄像头(图3.)．

染色体定位分析表明SlCaM基因位于番茄基因组的不同染色体上。这两个SlCaM2而且SlCaM3都位于10号染色体上，而其他4个SlCaM基因分别位于4条不同的染色体上(1,3,11和12)1)．染色体位置的信息摄像头在其他茄属的物种尚未提供。

之间的系统发育关系茄属的而且拟南芥和大米CaM蛋白

的全长氨基酸序列茄属的而且拟南芥对水稻CaMs进行系统发育分析。建立了最大似然(ML)系统发育树。CaM蛋白聚集成两大类(图4)．大多数茄属的cam属于同一组，这里称为组I。其中包括6个slcam中的5个;4个stcam中的3个和全部7个nbcam。所有五个拟南芥3个水稻cam也属于i组茄属的CaMs、SlCaM6和StCaM4分属另一组(组II)(图4)．有趣的是茄属的，拟南芥而水稻cam则形成了不同的群体。所有拟南芥与水稻CaMs属于同一组(组I)茄属的CaMs被分为两组(I组和II组)，其中II组新增(图4)．的凸轮编码II族蛋白质的基因携带三个内含子，而编码I族蛋白质的基因只携带一个内含子(图3.)，支持系统发育分为两个CaM类群。这些数据表明茄属的物种在进化过程中进化出了一种新的CaM类型。

潜在顺式调控序列的生物信息学预测SlCaM基因表达

的5 '上游非编码序列凸轮编码相同CaM蛋白的基因并不是很保守(数据未显示)，这表明这些基因在对各种刺激的反应中可能有不同的表达，即使它们编码相同的蛋白质。

获取如何表达的提示凸轮基因可能被调控，潜在的顺式作用元件在上游1000 bp的序列SlCaM基因分析。PLACE分析显示SlCaM基因上游序列携带多种潜在的顺式作用元件，包括受脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、生长素、茉莉酸(JA)和乙烯(ETH)等激素调控的转录因子的结合位点。顺式作用元件的模式在不同品种间有显著差异SlCaM基因。的SlCaM1基因启动子包含15个可能对这5种激素都有反应的元素，而对其他所有激素都有反应SlCaMs缺乏对一种或几种激素有反应的元素。SlCaM4缺乏顺式元素会对生长素和乙烯产生反应，SlCaM2，SlCaM5而且SlCaM6含有已知对两种激素有反应的成分，而SlCaM3只携带对生长素有反应的顺式元素。此外，所有的SlCaM上游序列携带大量的W-box元素，这表明SlCaMWRKY的表达可能受到WRKY转录因子的调控(表2)．

的表达SlCaM植物的基因是器官特异性的

六个SlCaM基因编码四种CaM亚型(图1而且2)．为了研究这些基因在发育植物中是否存在差异表达，从而可能具有不同的生理功能，我们使用qRT-PCR分析SlCaM基因特异性引物(表3.)．的表达模式SlCaM根、茎、叶、花和果器官中的基因如图所示5A. qRT-PCR表达分析结果显示所有SlCaM基因在所有器官中均呈组成型表达。然而，在不同的器官中表达水平是不同的。在SlCaMs，SlCaM1在所有器官中表达量最低。SlCaM4在除花外的所有器官中表达均较低。SlCaM2除果实外，其他器官转录物积累量最高。SlCaM3在根、茎和叶中表达量一般，但在果实和花中表达量较高。表达谱SlCaM5的相似之处SlCaM3，但绝对表达量相对较低。SlCaM6根、果、花表达量高，茎、叶表达量低。因此,SlCaM3，SlCaM4而且SlCaM5编码相同蛋白质的基因在不同器官中表达水平不同(图5A).一般来说SlCaM基因在花中表达量最高，在茎中表达量最低5一个)。

的表达SlCaM基因对不同刺激高度敏感

为了进一步了解潜在差异基因功能，SlCaM研究了不同植物激素的表达模式。表达式数据表明SlCaM2来SlCaM6对ETH、BTH和JA均有相似的表达模式，但与的表达模式不同SlCaM1在表达水平(图5B).表达SlCaM2来SlCaM6ETH处理在4 hpt(治疗后小时)时显著上调，然后保持表达水平升高，BTH处理在12 hpt时适度上调，而JA处理在4 hpt后强烈下调。的表达SlCaM1与对照组相比，对这三种激素的反应呈相似的趋势，但有显著不同的程度SlCaM2来SlCaM6．SlCaM1ETH和BTH处理在12 hpt时高度上调，而JA处理在4 hpt时下调至无法检测的水平。关于ABA处理，六SlCaM基因表现出不同的反应，但变化幅度一般不如对其他测试激素的反应大。的表达SlCaM2来SlCaM4被下调了，为什么SlCaM1，SlCaM5而且SlCaM6表达在4 hpt时上调，在12 hpt时下调(图5B).这些数据表明SlCaMs可能在各种激素调节的生物过程中发挥不同的调节作用。

来决定是否有角色SlCaM基因功能在抗病，基因表达在一系列病原体的反应进行了检查。的表达SlCaM在接种不同病原体后，基因会发生变化5C).表达SlCaM2来SlCaM6在接种后4 h显著降低，12 h显著升高两pv。番茄DC3000 (太平洋标准时间DC3000)，而SlCaM1在接种后4小时后，降至无法检测的水平(图5C)然而，所有的表达SlCaM接种后基因持续上调黄oryzaepv。oryzae（Xoo语)．在SlCaM基因，表达SlCaM2在接种Xoo后12 h诱导最多(图5C).这些数据表明SlCaMs可能参与植物抗病性的调控。

总的来说，SlCaM1表达对激素处理和病原体接种更敏感SlCaMs．

沉默的SlCaM2而且SlCaM6降低了番茄植株对TRV的抗性瓜果腐霉，但不是太平洋标准时间DC3000和Xoo语

为了了解SlCaMs在植物抗病中的功能，对植物进行了病毒诱导基因沉默(VIGS)SlCaM2而且SlCaM6．含有eGFP片段的载体被用作农业渗透植物的对照[26］．在农业渗透3周后，egfp对照处理的植株在某些叶片上没有或仅表现出非常微弱的花叶症状。然而，大多数的SlCaM2- - -SlCaM6-沉默番茄植株表现出明显的花叶病和黄化症状，其中以旱、旱、旱两季最为严重SlCaM6-VIGS植物(图6A).基因表达分析显示TRV转录本₁复制酶和TRV₂2b基因在这些植物中的积累量是egfp对照植物的2倍和25倍6B)。

检查症状和病毒基因转录物积累水平是否与沉默相关SlCaM2而且SlCaM6利用qRT-PCR技术对这些基因的转录量进行了定量分析。结果显示SlCaM2而且SlCaM6在经过vigs处理的植株中，转录本下降到egfp对照植株的30%左右6C).这些结果表明，沉默的SlCaM2而且SlCaM6基因导致TRV病毒症状和更高水平的病毒积累。总之，这些数据表明SlCaM2而且SlCaM6可能对番茄对TRV的抗性有正向调节作用。

为了进一步了解SlCaMs在抗病中的作用，对番茄植株进行了沉默研究年代是否接种了宿主病原体太平洋标准时间DC3000和瓜果腐霉非宿主病原体Xoo语，并评价耐药性。非宿主抗性Xoo语在沉默植物中与egfp对照植物中相似，因为这两种植物都在12 hpi时在浸润区域启动超敏反应坏死，并在24 hpi内显示完全组织崩溃(补充文件)3.A).抵抗太平洋标准时间与egfp对照植物相比，沉默植物的DC3000也没有显著改变。所有基因型均在12 hpi时出现坏死，在36 hpi时死亡3.B).然而，当接种p . aphanidermatum叶子坏死的症状SlCaM与egfp对照的植物相比，-沉默植物的病情明显更为严重(图7A).沉默植株的病灶直径为1.7 ~ 1.8 cm，明显大于对照植株的1.5 cm(图7B)这个结果揭示了SlCaMs对增强抵抗力有必要吗p . aphanidermatum在番茄植株中．

沉默的SlCaM2而且SlCaM6在番茄植株中改变信号和防御相关基因的表达

为了探究SlCaMs调控植物抗性的分子机制，我们定量分析了两个致病相关基因的表达PR1而且PR5，SlCNGC17而且SlCNGC18编码CNGC型钙通道蛋白，一个谷胱甘肽转移酶(GST)基因SlGSTF2,qRT-PCR检测到一种泛素延伸蛋白(UEP)基因。两者都沉默SlCaM基因表达显著降低公关基因和SlCNGC18，但增加了SlCNGC17．在SlCaM2沉默的植物，表达PR1，PR5而且SlCNGC18，分别下降98%、93%和60%SlCNGC17增加了2.7倍。在SlCaM6沉默的植物，表达PR1，PR5而且SlCNGC18，分别降低了56%、91%和91%SlCNGC17增强了3.2倍。然而，两者的沉默SlCaM基因对蛋白表达有不同程度的影响SlGSTF2而且SlUEP；沉默的SlCaM2两种基因的表达均增强了6.5倍以上SlCaM6沉默减少表达SlGSTF2的增长29%SlUEP下降57%(图8)．这些数据表明胞质Ca^{2 +}浓度，泛素化和氧化还原状态可能参与SlCaM-介导的疾病抗性以及SlCaM2而且SlCaM6可能采用不同的分子机制来调节抗病性。

为了开始了解CaM的作用，保守的真核生物Ca^{2 +}传感器，在植物，我们系统地识别完整凸轮基因家族茄属的品种有番茄、土豆和n benthamiana．此前，5个全长土豆和3个局部土豆凸轮用鸡进行马铃薯匍匐茎尖cDNA文库筛选，鉴定了相关基因凸轮作为探针[9，27］．其中五种全长马铃薯摄像头，PCAM5，PCAM6，PCAM7而且PCAM8编码一个相同的CaM序列，而PCaM1编码另一种CaM亚型。因此，这五个基因编码了两种不同的马铃薯CaM亚型。在本研究中，我们对马铃薯进行了全基因组分析凸轮基因全长鉴定4个StCaM我们命名的基因StCaM1来StCaM4．这4个基因编码3种不同的StCaM亚型，因为StCaM2而且StCaM3编码相同的蛋白质(图1而且2)．StCaM1在序列上与PCaM5/6/7/8相同，而StCaM2/3和StCaM4是新的异构体1,图3.)．

由于大量的基因编码与CaM有序列相关性的蛋白质，人们一直试图定义canoical CaM并将其与calmodulin-like (CML)蛋白区分开来。CaM是真核生物中最保守的蛋白质之一。例如，脊椎动物和植物CaMs之间的蛋白质序列一致性接近90%。在本研究中，我们发现番茄，土豆和n benthamiana氨基酸序列一致性百分比大于91%，cml序列与典型cam序列差异更显著，一致性百分比小于80%(表1，附加文件2,数据1而且2)．此外，CaM的长度为149个氨基酸，并携带两对EF-hand基序，例如茄属的本研究中确定的cam。我们遵循在以前的分析中使用的标准凸轮而且CML基因家族拟南芥［5]和被鉴定的CaMs，因为这些蛋白质应该包括那些由大约149个氨基酸组成，拥有两对EF-hand基序，与已知的典型CaMs具有90%以上的氨基酸序列相同的蛋白质。类似CaM的蛋白质有大约149个氨基酸和4个EF-hand基序，但共享不到90%的氨基酸同一性，被定义为CaM样(CML)蛋白质(附加文件)2)．利用这些标准，一些先前报道的CaMs，如NtCaM13 [8]和ScaM-4及SCaM-5 [10]，并不是真正的cam，而可能更恰当地称为cml。

CaM基因家族的一个非常不寻常的特征是一小组基因，通常是2到4个，编码相同的蛋白质异构体[4，5］．在茄属的本研究中使用的物种为番茄SlCaM3/4/5、土豆StCaM2/3，N. benthamiana NbCaM1/2/3/4而且NbCaM5/6所有编码相同的CaM亚型(表1,数据1而且2)．多个基因编码相同CaM亚型的现象在以前的研究中已经描述过;拟南芥AtCaM2/3/5，N. tabacum NtCaM3/4/5/6/7/8/11/12、大米OsCaM1-1/2/3、大豆GmCaM1/3都有CaM亚型[6- - - - - -8，10］．自然选择很可能使这些蛋白质序列保持保守，因为编码基因在序列上并不相同。这些基因在编码序列上有一定差异(主要是在氨基酸编码三联体的第三个核苷酸，摆动碱基，图2)，具有不同的5 '上游序列(序列数据未显示)，携带不同大小和序列的不同内含子，位于不同的染色体上(表1)．这种强烈的保守性表明CaM在植物生物过程中起着至关重要的作用，植物可能需要一个以上的CaM副本凸轮基因执行基本功能。此外，这种现象也可能反映了植物进化功能基因旁系的一种策略。这些基因可以通过染色体之间的序列交换获得。很可能所有的凸轮基因拷贝是有功能的，因为有很强的序列保守性。然而，不同的基因可能对刺激的反应不同，因为它们包含不同的上游序列和内含子。以番茄为例SlCaM3/4/5基因在植物组织和对病原体的反应中以不同水平表达(图5)．多个凸轮编码相同蛋白质异构体的基因可能与编码相似但不相同蛋白质的基因家族的类似情况有关，例如涉及抗病的基因(R) [28，29]和编码消费税[30.］．在多个基因编码密切相关的蛋白质的情况下，同一染色体附近的串联基因排列和/或基因簇可促进遗传多样性的进化[28- - - - - -30.］．

这项研究中另一个有趣的发现是茄属的物种似乎进化出了一种新的凸轮基因与拟南芥和米饭。系统发育分析揭示了这一切拟南芥与水稻CaM蛋白异构体形成一个分支;然而，cam的茄属的种分为两组，其中一组与属同一支拟南芥和水稻cam，而其他组成员是唯一的(图4)．这种分类不仅基于氨基酸序列的相似性，而且基于基因结构的数据。所有I组凸轮基因只包含一个内含子，而第二组摄像头有三个内含子(图3.)．这些数据表明，不同类型的CaMs可能在植物生物学过程中发挥不同的作用。

CaMs在植物生长发育和抗逆性中的作用已被广泛讨论。然而，CaMs在植物抗病中的功能仍未被充分探索。在这项研究中，我们发现沉默的两个SlCaM基因显著改变了信号和防御相关基因的表达，降低了番茄对TRV和重要卵菌病原体的抗性瓜果腐霉(数据6，7而且8)．因此，SlCaMs在病毒和卵菌抗性中很重要。cam调控抗病性的分子机制尚不清楚。我们在这项研究中发现，沉默SlCaM2而且SlCaM6基因表达显著降低SlCNGC18，但增加了SlCNGC17的表达也有差异SlGSTF2而且SlUEP基因(图8)．这些结果提示胞质钙的调控^{2 +}浓度、泛素化和氧化还原状态可能与slcam介导的疾病抗性有关SlCaM2而且SlCaM6可能采用不同的分子机制来调节抗病性。

的凸轮基因家族茄属的种西红柿,n benthamiana和马铃薯被鉴定出来。西红柿，土豆和n benthamiana基因组包含多个凸轮高序列保守性基因。茄属的该物种进化出了一组新的CaM基因，具有独特的基因结构。不同的CaM群是否发挥不同的作用还有待分析。

简化表达式SlCaM基因SlCaM2而且SlCaM6番茄对TRV和重要卵菌病原体的抗性受损瓜果腐霉表明这些SlCaMs在植物对多种病原体的抗病中发挥着重要作用。最后，我们的研究结果表明SlCaM2而且SlCaM6可能采用不同的分子机制来调节抗病性。

的识别凸轮基因在茄属的物种

找到凸轮基因在茄属的物种，全部四种拟南芥通过检索基因组序列数据库TAIR (the Arabidopsis Information Resource, the Arabidopsis Information Resource，http://www.arabidopsis.org/)和水稻基因组注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)．所有检索到的AtCaM和OsCaM蛋白序列被用于TBLASTN检索茄属的品种包括番茄、土豆和烟草benthamiana在茄科基因组网络(http://solgenomics.net/)．收集所有检索到的非冗余序列，并使用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)及保守域数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)项目。将这些序列与拟南芥典型CaM蛋白AtCaM2使用ClustalX 2.01程序[31]的默认设置，并由GeneDoc查看。含有两对EF-hand基序、氨基酸序列与AtCaM2相似度超过90%、氨基酸大小约为149个的被鉴定为CaM蛋白。根据序列的相似性来命名给定物种的CaMs拟南芥摄像头。

植物的系统发育和基因结构分析凸轮基因

摄像头采用ClustalX 2.01程序[31]使用默认设置。基于MEGA 5.0比对构建无根系统发育树[32]的最大似然(ML)方法。进行自举分析，设置1000个重复。外显子-内含子结构分析使用默认设置的基因结构显示服务器(Gene structure Display Server, GSDS)程序进行[33］．

调控因子的生物信息学预测SlCaM基因表达

上游1000 bp序列SlCaM利用“Signal Scan Search”程序在PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)．

病毒诱导基因沉默(VIGS)构建

的编码区域SlCaM基因是高度保守的。特异性沉默靶基因成员，每个基因特异性的3 ' UTR序列SlCaM按照以下步骤将基因插入到基于trv的VIGS载体pYL156中。一个171 bp 3 ' UTR片段SlCaM2用引物VSlCaM2-F (gcgaattcTTCCATTATCCTCTTGTTACA, a .)从番茄中PCR扩增出基因(Solyc10g081170.1.1)生态介绍了RI位点)和VSlCaM2-R (ttggatccGTAGAGATCACACCACTCATAC, aBamHI位点被引入)SlCaM6用引物VSlCaM6-F (gcgaattcTGACTTTAAGATTCTGTTAGCT, a .生态RI位点被介绍)和VSlCaM6-R (ttggatccGATATTACCAATGAACTATCTA, aBamHI站点介绍)。将PCR产物克隆到pYL156中生态RI /BamHI，经测序证实。重组结构体转化为根癌土壤杆菌(菌株GV3101)进行VIGS分析。

VIGS操作程序

番茄的VIGS分析如所述[34，35]除了使用pTRV₂-eGFP代替空pTRV2作为阴性控制载体，这样病毒症状就能被有效抑制[26］．简而言之，携带pTRV的农业接种菌₁和pTRV₂-eGFP或pTRV₂-SlCaM真空渗透到刚长出第一片真叶的幼苗子叶中。在植物生长室中，21°C，光照/暗光照16 h/8 h。3周后，对植物进行抗病分析，并对叶片取样，以检查基因沉默效率和积累和富特异性引物qRT-PCR检测基因转录物(表3.)．

植物材料表达分析

番茄(品种Suhong2003)在28°C的生长室中生长，每日光照/黑暗周期为16 h/8 h。从4个月大的番茄植株中采集根、茎、叶、花和果实等不同器官。收获的器官立即冷冻在液氮中，并保存在-80°C。

激素处理时，在7 ~ 8周龄番茄幼苗叶片上分别喷洒100 μM脱落酸(ABA)、10 mM乙烯利(ETH)、200 μM茉莉酸(JA)、350 μM苯并噻二唑(BTH)和消毒水作为对照。分别于处理后4 h和12 h对叶片进行取样分析SlCaM基因的表达。

为病原接种，对病原菌进行接种两pv。番茄DC3000 (太平洋标准时间DC3000)和黄oryzae光伏．oryzae（Xoo语)分别在含有利福平(50 μg/mL)和卡那霉素(50 μg/mL)的King’s B培养基和NA液体培养基上28℃孵育过夜。通过离心收集细菌细胞，然后稀释成悬浮液至OD浓度₆₀₀= 0.002和0.5使用10mm MgCl₂缓冲液或消毒ddH₂分别啊。制备的细菌溶液(10mm MgCl₂缓冲液或消毒ddH₂O作为对照)渗透到7 ~ 8周龄的番茄植株叶片中。分别于渗透后0、4、8 h取样Xoo语0小时，4小时，12小时太平洋标准时间分别用DC3000进行基因表达分析。

实时PCR基因表达分析

总RNA由Trizol regent (TAKARA, Japan)根据制造商说明书提取。RNA用DNase I处理(TAKARA，日本)，并使用PrimeScript RT regent kit (TAKARA，日本)反转录成cDNA。获得的cdna用实时定量PCR进行基因表达检测分析。RT-PCR在StepOne实时PCR系统(美国应用生物系统公司)中进行，使用SYBER Premix Ex Taq试剂(日本TAKARA公司)，程序如下:95°C 30 s, 95°C 5 s, 60°C 45 s, 40个循环。为了归一化样本方差，18 s rDNA内部控制由Gene担任。相对基因表达值用2^-△△Ct方法。为了保证RT-PCR的基因特异性，根据RT-PCR的5 '和3 ' UTR区域设计引物SlCaM基因。用于基因表达分析的引物列于表中3.．

实验进行了三次，每次对所有基因重复3次。对基因表达数据进行统计学分析，采用SPSS软件(Version 19.0, IBM, USA)进行方差分析。用邓肯多极差检验(DMRT)确定平均值之间差异的显著性。

植物抗病分析

对经vigs处理的植株进行抗病性评价。细菌病原体太平洋标准时间DC3000和Xoo语如上所述进行。卵菌病原体瓜果腐霉在25°C条件下，在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上生长2 d。从含有最活跃的年轻菌丝的外圆中取出直径为3mm的PDA插头，放在vigs处理的植株新发育的叶片上。接种后，将植株置于较高相对湿度下保存2 d，观察病害或HR症状。记录坏死的大小并照相应的照片。

每次实验至少分析6株植物对每种病原体的抗性，实验重复两次。

阿坝:

脱落酸

蓝芽:

Benzothiadiazole

凸轮:

钙调蛋白

中国:

环核苷酸门控通道

乙:

乙烯利

销售税:

谷胱甘肽转移酶

是:

茉莉酸

NtCaM:

烟草benthamiana钙调蛋白

公关:

Pathogenesis-related

Pst DC3000:

两pv。番茄DC3000

SlCaM:

茄属植物lycopersicum钙调蛋白

StCaM:

茄属植物tuberosum钙调蛋白

Xoo语:

黄oryzae光伏．oryzae

UEP:

泛素延伸蛋白

中收取:

病毒引起的基因沉默。

本工作由国家基础研究计划(no. 1)资助。农业公益性科研专项资金(2009CB119000);201103016)，高校长江学者创新团队资助项目(no. 201103016);IRT0943)、新世纪高校优秀人才资助计划(no.;NCET-08-0485)，浙江省新世纪151人才计划，美国国家科学基金(批准号:NCET-08-0485);mcb0817976至JB)。

从属关系

1. 浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，杭州余杭塘路866号，310058

   赵元，刘伟，曹佳义，蔡新忠

2. 浙江大学分析测量中心，杭州余杭塘路866号，浙江杭州310058

   You-Ping徐

3. 莱斯大学生物化学与细胞生物学系，休斯顿，德克萨斯州，77005-1892，美国

   珍妮特Braam

相应的作者

对应到Xin-Zhong蔡．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

该项目由XZC协调。YZ和WL进行了生物信息学和系统发育分析。YZ、YPX和JYC进行基因表达测定和VIGS分析。YZ设计并进行统计分析。XZC构思并参与了研究的设计和协调。JB提供了蛋白质分类的建议。XZC、JB、YZ共同撰写稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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