NaMYC2转录因子调控植物防御反应的一个子集gydF4y2Ba烟草attenuata则gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

为了在食草动物的攻击下存活下来，植物进化出了强大的机械或化学防御机制，这些机制在食草动物攻击后要么是构成性的，要么是可诱导的。由于防御部署的成本，植物通常使用各种转录因子(TFs)调节其生物合成。MYC2调控因子属于bHLH转录因子家族，参与植物防御和发育的许多方面。在这项研究中，我们发现了一个新的MYC2 TFgydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba并结合分子、分析和生态学方法对其调控功能进行了表征。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

转录物和靶向代谢物分析证明Namyc2主要参与尼古丁生物合成的调节和苯酚gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。此外，通过广泛的代谢产物分析，我们识别出了NaMYC2调控的其他一些代谢产物特征，经过全面注释后，这些特征有望拓宽我们对植物防御调控的理解。与之前的报道不同，茉莉酸类和一些JA-/ nacoi1依赖的代谢物(如HGL-DTGs)的生物合成并没有受到NaMYC2的强烈调控，这表明NaMYC2参与了其他独立的调控因子。在表现上没有观察到显著的差异gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba在gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba-沉默的植物，与众所周知的这种特殊昆虫对尼古丁的耐受能力相一致。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

通过调节尼古丁的生物合成，Namyc2可能增强植物抗性对非适应的草食虫，并有助于植物健身;然而，调节单独防御反应的多个JA / NACOI1依赖机制（可能涉及其他MYCS）可能存在gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。在jasMonate信号传导中调节的不同植物家庭中观察到的相当大的变化突出了植物工艺对攻击它们的食草动物的高度特异性和微调反应的复杂性。gydF4y2Ba

在它们的自然栖息地，植物暴露在许多非生物(如干旱、紫外线辐射、盐度)和生物(如草食和/或病原体攻击、竞争)的胁迫下，这极大地破坏了它们的达尔文适应性。为了对付食草动物，植物进化出了复杂的防御机制，包括机械屏障、毛状体、刺、乳胶、蜡和有毒/抗营养化学武库，这些武库或构成(如尼古丁、硫代葡萄糖苷)，或在食草动物攻击(如羟基香叶香醇-二萜苷(HGL-DTGs))后部署，酚酰胺，胰蛋白酶抑制剂)[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．此外，并与这些直接防御，植物募集捕食者或侵害攻击者的寄生虫，使用信息挥发性有机化合物或营养奖励[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．但是，国防响应的成本[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]需要制定严格的调节机制和几个植物转录因子（TFS）（例如，ERF，Bzip，MyB，BHLH和Wrky），以调节植物防御生物和非生物胁迫[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这些转录因子中的许多转录因子是响应于不同的应力而共同诱导，这表明复杂相互作用的存在[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在许多植物物种中，植物激素在协调防御反应发展中的作用已经清楚地显示出来，经常通过它们之间的相声来实现复杂精细的反应结果[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．具体地，茉莉甲酸信号通路在介导针对食草动物的防御反应中发挥着关键作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．针对草食动物的攻击，GLA1酶从叶绿体膜释放18:3 α-亚麻酸(α-LeA)。α-LeA随后在叶绿体中通过脂氧合酶(LOX)、氧化烯丙烯合成酶(AOS)和氧化烯丙烯环化酶(AOC)转化为氧植物二烯酸(OPDA)。OPDA被转运到过氧化物酶体，并被OPDA还原酶(OPR)氧化形成茉莉酸(JA)。在细胞质中，JA通过JAR酶与异亮氨酸结合，产生具有生物活性的茉莉酸酯(+)-gydF4y2Ba7-Iso.gydF4y2Ba-jasmonoyl-L-isoleucine (JA-Ile) [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．JA-Ile与SCF联系gydF4y2Ba^{COI1gydF4y2Ba}众所周知，众所周知的jaz压缩机并用26s蛋白群落的降解标记。在没有压力条件下，MyC2被Jaz压缩机压制，jaz抑制器，其循环（tpl）作为直接通过耳朵（乙烯响应因子相关的修正抑制）基序或使用忍者的耳动术（Jaz的新型互动因子）蛋白质[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．Jaz蛋白的降解从抑制中释放MyC2转录因子，重新配置下游转录过程[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MYC2是转录因子(TFs)的基本Helix-Loop-Helix (bHLH)家族成员[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba在许多植物中具有结构和功能保守的结构域。其中一个保守结构域，basic (b)区域，被用于与myc2调控基因启动子上发现的G-box六聚体(5'-CACNTG-3')的变体结合。HLH和ZIP结构域用于homo-/hetero-dimerization, JID (JAZ interaction Domain)结构域用于与JAZ蛋白相互作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

MYC2转录因子参与许多ja依赖的生理过程的调控:防御食草动物/病原体、耐旱性、生物钟、光信号和根系生长[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．guo等人。［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]在涉及模型或MEJA处理的野生型和MYC2植物的蛋白质组学研究中，最近鉴定了27种差异调节的JA诱导和MYC2依赖性蛋白，参与葡糖苷代谢（22％），应力和防御（33％），光合作用（22.2％），碳水化合物新陈代谢（7.4％），蛋白质折叠和降解（11.1％），突出了MyC2的非常多样化的作用。gydF4y2Ba

N.Attenuata.gydF4y2Ba是一种野生烟草，原产于美国犹他州的大盆地沙漠，我们的小组已经发展成为一种生态植物模型。这种物种对其特殊的食草动物的防御反应，gydF4y2BaManduca sexta,gydF4y2Ba已得到充分研究，并包括有效次级代谢物的生产:尼古丁、HGL-DTGs、酚酰胺和蛋白酶抑制剂[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们鉴定了一个假定的MYC2转录因子gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba（Namyc2）并用反向遗传，转录组和未确定/靶向的代谢方法表征其在防御响应调节中的作用。我们的转录组和代谢组数据表明Namyc2在尼古丁积累中的强烈累积。然而，沉默该基因对其他植物防御代谢物的积累仅产生有限的影响，这强烈地暗示了多个独立和/或冗余转录调节器在防御信号中的累围gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba植物。gydF4y2Ba

namyc2.gydF4y2Ba成绩单在草食病后诱发gydF4y2Ba

食草动物的攻击诱导了植物转录组的短暂重构，这转化为代谢组的重构。在gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba，在WW和WOS治疗后，诱导涉及用于防御食草动物的基因的转录物。有趣的是，许多转录物都表现出对WOS的更强的反应，特别是在系统诱导的组织中[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．在以往的研究中，MYC2 TFs的功能(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）在植物防御规范中被证明;然而，详细的调节机制在不同的植物物种中不同[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．在野生类型中gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba植物，成绩单gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba(GenBank登录号KC832837)。相比之下，在未经处理的系统叶片中，gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba转录物仅在WOS治疗后上调（图gydF4y2Ba2gydF4y2BaA和B），与草本调节基因对WW和WOS的差异响应一致。这些研究结果强烈建议Namyc2 TF在植物防御中对食草动物的影响gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．因此，确定Myc2的功能gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba在美国，我们使用了一种反向遗传方法来敲除积累gydF4y2Banamyc2.gydF4y2Ba(通过病毒诱导基因沉默，VIGS)的转录本，并在验证了VIGS程序的效率后对接种植物进行了表征。与空向量(EV;转化控制)的装置，在gydF4y2Banamyc2.gydF4y2BaMYC2-VIGS植物转录本积累(方差分析，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 339.22，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0001）或1小时（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,8gydF4y2Ba= 418.72，gydF4y2BaPgydF4y2Ba=0.0001)或3 h(方差分析，FgydF4y2Ba_1,3gydF4y2Ba= 42.41,gydF4y2BaPgydF4y2Ba=0.007)(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaC）。由于我们还确定了另一种Myc2转录因子（推定名为Myc2-like; Genbank登录号KC906192），其具有与MyC2相当的蛋白质序列相似性，我们测试了其转录物积累在Myc2-Vigs植物中受到影响。从基因非翻译3'UTR中的Myc2沉默区域的定位预期，我们发现没有显着减少了积累gydF4y2BaMYC2-likegydF4y2Ba与EV对照植物相比，MYC2-VIGS植物的转录本，表明VIGS沉默局限于MYC2 TF(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1和S2）。在随后的实验中，我们使用沉默的植物来确定Myc2在植物防御中的调节作用gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

Myc2-Vigs植物中次级代谢产物积累的靶向分析gydF4y2Ba

尼古丁，酚酰胺，羟基香叶醇二萜苷(HGL-DTGs)和酚类化合物是强效的，依赖于ja的抗草食化合物gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．他们的JA依赖性积累模式表明这些化合物的生物合成可能由NamyC2调节。为了测试这个假设，我们使用了Myc2-Vigs植物：以前，萨德勒和鲍德文[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba表明VIGS能有效地敲除植物防御基因的表达。gydF4y2BaPMTgydF4y2Ba）在两叶和根部gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba植物。然后，我们使用靶向代谢组学方法比较了未处理对照和wos处理(24、48和72 h) EV和MYC2-VIGS植株防御次生代谢产物的积累。gydF4y2Ba

尼古丁gydF4y2Ba

尼古丁是人体最主要的防御化合物之一gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba57gydF4y2Ba[涉及其生物合成中的大多数基因已经确定了[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．尼古丁在根中合成，然后运输到叶子。测试MYC2是否调节草食动物诱导的尼古丁生物合成gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba，我们在HPLC-PDA上测量了在未处理或WOS治疗的EV和Myc2-Vigs植物中的尼古丁的积累。我们发现与EV植物相比，尼古丁的积累以前显着降低（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,7gydF4y2Ba= 6.94,gydF4y2BaPgydF4y2Ba=0.03)或24 h(方差分析，FgydF4y2Ba_1,7gydF4y2Ba= 10.06,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.01），48小时（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,8gydF4y2Ba= 17.53,gydF4y2BaPgydF4y2Ba=0.003)和72 h(方差分析，FgydF4y2Ba_1,8gydF4y2Ba= 28.81,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0007）在MYC2-VIGS植物中的WOS治疗后（图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．在另一个独立的VIGS实验中也观察到了类似的结果(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S3a，b）表明尼古丁生物合成受到MyC2 TF的强烈调节gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。除了尼古丁外，我们还发现了另外两种生物碱，anatabine和cotinine的累积中的myc2特异性差异，如更具选择性和敏感的lc-tof / ms方法所确定的（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba有趣的是，当anatabine和nicotine的离子强度在MYC2-VIGS叶片中降低时，可替宁的积累增加。gydF4y2Ba

总体而言，我们的结果与先前的报告一致，该报告证明了MyC2 TFS对茉莉酸酯诱导的尼古丁/生物碱生物合成的调节。在gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba明亮黄色(BY-2)细胞与反相重复(ir)NtMYC2a/2b结构转化后，尼古丁和anatabine的积累明显减少，与未转化对照相比[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．NtMYC2蛋白也被证明可以通过直接与根中的尼古丁生物合成基因的启动子结合或激活NtERF189来调节尼古丁生物合成[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba，两种BHLH转录因子（名为NBBHLH1和NBBHLH2）以及NBERF1和NBHB1的VIGS减少了MEJA诱导的尼古丁积累[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．这些结果证明了MYC2的调节功能和转录因子网络在尼古丁生物合成调控中的参与。但是，烟草的功能gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba在天然食草动物喂养的背景下没有检查基因;这些都不是这些影响gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba研究了烟草其他防御代谢产物(如酚酰胺、HGL-DTGs等)积累的基因。从MYC/bHLH转录因子的系统发育关系gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba和gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和我们的结果，存在额外的MYC TFsgydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba是一个合理的预测。对这些假定的TFs的进一步表征可能有助于充分理解尼古丁/生物碱生物合成的生物合成和生态后果。此外，表征额外的调控因子将补充NaMYC2的部分调控功能，对不同类别的调控gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba防御代谢物，在下一节中演示。gydF4y2Ba

PhenolamidesgydF4y2Ba

近年来，国内外报道了NaMYB8 TF对酚酰胺生物合成的调控及其生态相关性gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．考虑之前的一份报告gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba表明AtMYC2调控MYB转录因子[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]我们的微阵列数据在Namyc2调节基因中鉴定了MYB TF（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：表S1），我们推理，在gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba，Namyb8或其调节的基因可能由Namyc2调节。为了测试这种可能性，我们通过WOS处理了EV和Myc2-Vigs植物，并测量了参与酚类生物合成的NamyB8和下游基因的相对转录物丰度。这些基因的成绩单累积在未处理的植物中的EV和Myc2-Vigs植物（0小时）之间没有差异;然而，在WOS治疗后1小时，在转录物累积中观察到显着减少gydF4y2Banamyb8gydF4y2Ba（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 9.81,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.02），gydF4y2BaNaPALgydF4y2Ba（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 17.14,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.006），gydF4y2BaNaAT1gydF4y2Ba（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 16.00,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.007),gydF4y2BaNaDH29gydF4y2Ba（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 28.25，gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001）和gydF4y2BaNACV86gydF4y2Ba（ANOVA，FgydF4y2Ba_1,6gydF4y2Ba= 6.66,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.04)在MYC2-VIGS植株中(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．我们的数据和先前展示的监管gydF4y2BaNaAT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNaDH29gydF4y2Ba，gydF4y2BaNACV86gydF4y2Ba通过gydF4y2Banamyb8gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba指出NaMYC2可能通过调控酚酰胺的表达来调控酚酰胺的生物合成gydF4y2Banamyb8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

接下来，我们测量了wos诱导的咖啡酰腐胺、二咖啡酰亚精胺、绿原酸和芦丁在EV和MYC2-VIGS植物中的积累，以检验这些化合物的积累是否遵循namyc2依赖的转录本积累模式。令人惊讶的是，我们发现EV和MYC2-VIGS样本之间几乎没有显著差异(图)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba），也在独立的Vigs实验中确认（附加档案gydF4y2Ba1gydF4y2Ba在两个VIGS实验中，由于沉默有效传播需要时间，用于提取EV-和MYC2-VIGS植物次生代谢物的样品都是在花期早期从PDS-VIGS植物的漂白部分对应位置采集的。沉默的gydF4y2Ba植物去脱离酶gydF4y2Ba（PDS）导致叶片的照片漂白，允许视觉验证沉默的散布，这对应于叶子上的透明白色叶绿素的区域。然而，在晚细长/开花阶段，已知野生酰胺积累的诱导性特征是停止，尽管在该阶段的成绩单累积没有任何知识的任何内容[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．考尔等人，[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba[表明，在玫瑰花莲和早期阶段的植物组织中，高诱导型咖啡酰肺术（苯丙胺 - 多胺缀合物）的高诱导型水平gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba开花和蒴果发育后，植株明显向生殖组织转移。因此，在成熟植物的叶片中几乎没有检测到任何咖啡因腐胺。因此，由于酚酰胺在植物发育后期积累的“结构性”和局部性，它们的生物合成可能不会受到NaMYC2的强烈影响。另外，即使生物合成酶的转录在发育的后期阶段仍然是可诱导的(图)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，酶的翻译/翻译后修饰可能不会发生，或必需的底物(如苯丙素和多胺)可能被转移到开花植物的其他重要功能。最后，我们检测myc2依赖差异的能力可能被掩盖了，因为植物对VIGS过程的反应(即病毒感染可能会诱导酚酰胺生物合成)，或者沉默的水平不足以影响酚酰胺生物合成。因此，转录本和代谢物数据之间的断开可以解释为酚酰胺生物合成的动态和/或协同调节;发育和被草食动物/病原体攻击。我们推测NaMYC2可能参与了年轻植物中酚酰胺生物合成的调控。然而，这在目前的实验装置(使用MYC2-VIGS植物)中无法测试，将需要产生稳定转化的植物。gydF4y2Ba

总羟基烷基丙氨酸二萜糖苷（HGL-DTGS）和TPI水平gydF4y2Ba

HGL-DTGS是JA依赖性代谢产物，在植物防御中具有良好的作用，对食草动物进行gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba55gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．研究植食性诱导的HGL-DTGs积累是否受MYC2调控gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba利用WOS处理EV和MYC2-VIGS植物，提取代谢物，采用HPLC-PDA分析总HGL-DTGs。我们发现，对照植株和WOS处理24、48和72 h的植株中总HGL-DTGs的积累没有显著差异(图)gydF4y2Ba6gydF4y2BaA和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba图S4E)，表明MYC2可能不参与调控这类化合物的生物合成。我们使用了径向扩散分析[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba[比较EV和Myc2-Vigs植物之间的WOS诱导的TPI活动，发现，尽管WOS治疗后TPI活性水平显着降低，但在诱导之前MyC2-Vigs植物中的水平较高;这并没有与之相关gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba表达（图gydF4y2Ba6gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

一起参加并考虑JA- / COI1依赖性HGL-DTG和TPI积累gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]， HGL-DTGs和tpi的生物合成gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba可能受到了依赖的依赖的，但是Namyc2独立机制的监管。或者，独立的功能和/或协同作用gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba基因gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba可以解释namyc2的部分功能。此外，类似于酚醛化，HGL-DTG和TPI的积累也受到植物发育阶段的强烈影响[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．Van Dam等人[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba]显示出gydF4y2Ba新创gydF4y2BaPI的合成仅限于植物发育的早期阶段，茉莉酸甲酯处理开花植物并没有显著提高其局部或系统的PI活性水平。此外，与幼嫩的源叶相比，对老叶的损害在幼嫩叶中引发的系统反应要弱得多gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．Heiling et al.(2010)研究表明，17-羟基香叶醇二萜苷(DTGs)在最有价值的年轻和生殖组织中浓度最高，这是这些组织有效防御植食动物所必需的gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

NaMYC2与植物激素积累的调控gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaMYC2调控植物激素生物合成的相关基因，并参与茉莉酸盐生物合成的反馈回路。MYC2也调节其自身的转录，可能进一步增强茉莉酸酯的反应[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．因此，我们提出NaMYC2是否参与了植物激素的生物合成或代谢gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba为了解决这个问题，我们在两个独立的Vigs实验中测量了在未处理和WOS治疗的EV和Myc2-Vigs植物中的茉莉酸盐积累。总之，在EV和Myc2-Vigs植物中的JA，OH-JA，JA-ILE，OH-JA-ILE和COOH-JA-ILE的积累中没有一致地观察到MYC2依赖性差异;我们也没有检测到ABA或SA累积的一致差异（图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S5)。与这些观察结果一致而与之不同的是gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，在我们的微阵列数据中，我们没有发现涉及这些植物激素生物合成/代谢的任何基因的转录本积累的显著变化(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。根据这些观察，我们得出结论，在gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba在美国，MYC2不调节茉莉酸类、ABA或SA的生物合成和/或代谢。gydF4y2Ba

特殊草食动物在MYC2-VIGS植物上的表现gydF4y2Ba

作为植物防御反应的关键调节者，我们询问了专业食草动物的表现，gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba受到了影响gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba沉默。因此，我们喂养新生儿(gydF4y2BangydF4y2Ba= 20）gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba在EV和Myc2-Vigs植物中为13 D测量其肿块每4天。在所有测量时间，我们观察到在EV或Myc2-Vigs植物上喂食毛虫的质量没有显着差异（图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这与观察结果一致意见，即在Myc2-Vigs植物中，仅在尼古丁的积累中观察到显着的变化，这是一种新生儿的代谢物gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba很宽容。相反，在与irCOI1植物的代谢物积累模式一致的情况下，新生的gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba以coi1沉默的植物为食的植物比以WT植物为食的植物获得了更多的质量[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．因此，问题是，是否有其他JA/ coi1在/依赖的MYC2(或其他)转录因子调控这些其他的防御代谢产物gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba这些都是非常重要的gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba幼虫。gydF4y2Ba

myc2沉默叶片的大规模转录组和代谢组学分析gydF4y2Ba

MYC2 TFS在协调植物防御和在几种植物物种的发育过程中的作用进行了综述[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．作为母部调节剂，MyC2 TFS可以直接调节负责防御代谢物生物合成或调节监管机构的基因[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．为了为进一步的研究提供信息，我们使用了无偏性方法，比较了EV和MYC2-VIGS的转录组和代谢组中草食动物诱导(WOS)的变化gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba植物。gydF4y2Ba

NaMYC2调控转录组gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba

对于转录组分析，我们使用WOS为1小时治疗EV和Myc2-Vigs植物，并使用微阵列进行各自的诱导的转录组。这种方法虽然无法发现晚期诱导的代谢基因可以揭示NamyC2下游中间调节剂和TFS。我们标准化和日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-转化原始数据，鉴定MYC2-VIGS植物中表达明显改变的基因(使用显著性分析的微阵列(SAM)包)，并由Blast2Go进行注释。与EV植物相比，MYC2-VIGS植物中有47个基因的表达发生了显著变化(2倍以上)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。我们根据TAIR(拟南芥信息资源)功能注释方案对调控基因进行了分组，发现这些基因参与了多种生理过程:转录调控(20.45%)、氨基酸代谢(11.3%)、次级代谢(4.5%)、生物胁迫(6.8%)、发育(6.8%)、转运(9.1%)、翻译后修饰(4.5%)和蛋白质降解(6.8%)(图)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。具体地，植物防御反应，转录因子（Wrky，MyB）或信号传导组分（钙调蛋白或钙结合蛋白）的几个关键调节器是通过微阵列分析鉴定的那些。仔细检查MYC2监管基因gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba鉴定额外的早期诱导的基因，参与外防的食草动物（萜烯合酶和蛋白酶抑制剂）或病原体（PR蛋白）（附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。我们的数据支持gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba该报告显示AtMYC2在一系列生理过程中的调节作用:从草食动物/病原体防御到激素生物合成;从初级和/或次级代谢[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]光学发育[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与独立进行的酚酰胺生物合成基因转录本丰度的qRT-PCR测量相比，微阵列分析没有识别这些基因(gydF4y2Ba朋友gydF4y2Ba，gydF4y2BaAT1gydF4y2Ba，gydF4y2BaDH29gydF4y2Ba和gydF4y2BaMYB8gydF4y2Ba)在MYC2-VIGS植物中与EV-VIGS植物中有差异调控，因为这些基因在微阵列实验中没有通过严格的统计标准来选择至少下调2倍的基因。尼古丁生物合成基因仅在根中表达，因此不能在用于微阵列的叶子样品中进行评估。gydF4y2Ba

沉默的gydF4y2Banamyc2.gydF4y2Ba大大影响了gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba代谢物gydF4y2Ba

myc2介导的草食动物转录组的变化是否转化为更广泛的防御次级代谢物，除了生物碱已经被靶向分析方法证实?采用高效液相色谱/ESI-TOF-MS无偏倚代谢组学分析方法，对EV和MYC2-VIGS植物叶片中提取的代谢物进行分析gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba。原始数据被标准化，日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba- 使用XCMS和摄像机包进行格式化和预处理，如方法部分中所述。为了在未经阶级标签考虑我们样品中的总变异性的方向，我们使用了无监督的方法（主成分分析，PCA）并观察到EV和Myc2-Vigs样品通过PCA分离为两个簇，表明基因型代谢物水平的特异性差异（图gydF4y2Ba10gydF4y2BaA).对PC1(解释了总变异性的51.7%)和PC2(解释了总变异性的27.5%)有强烈贡献的特征在加载图(图)中描述gydF4y2Ba10gydF4y2BaB).当我们筛选不同基因型的代谢特征(2或2以上的fold changes)时，我们确定了897个特征;其中741个差异显著(gydF4y2BatgydF4y2BaEV和Myc2-Vigs工厂之间的最低阈值为0.05或更小（附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2）。可以从热图中可视化规则的整体模式（图gydF4y2Ba10gydF4y2Bac）使用显着的代谢特征（病房聚类算法和Pearson距离测量）在MetaboAnalyst 2.0上生成。总共有712个代谢物特征，均折叠变化和gydF4y2BatgydF4y2Ba- 确定阈值（分别为2倍或更多，分别为P <0.05），并且在火山图上绘制最重要的特征（由紫点表示）（图gydF4y2Ba10gydF4y2BaD，附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba：表S2）。其中一些特征（M / z 163.123,132.082,163.039）以前作为参与食草动物的植物防御所涉及的代谢物的分子片段gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．然而，对剩余特征的识别和注释仍然是未来实验的重大挑战。总之，我们的代谢组学分析证明了MYC2在植物代谢组调控中的重要性，当这些代谢组学特征被注释时，将有可能精确地绘制MYC2在植物防御和发育反应中的调控作用。gydF4y2Ba

在许多植物物种中，来自食草动物的攻击会引发一系列复杂的转录和代谢反应，从而提高植物的防御能力。植物防御的有效性取决于调节反应时间和持续时间的效率。在这项研究中，我们发现了一个MYC2 TFgydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba并利用转录组学和代谢组学方法描述其调控作用。在转录方面，我们发现当MYC2沉默时，许多参与植物发育或防御反应的基因，包括转录因子的表达都会受到影响gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。这是由代谢组数据支持的，所述代谢物数据在沉默之后鉴定了大量差分分子特征。最重要的是，如前所述gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba和gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba，我们表明Namyc2规范了gydF4y2Ba在足底gydF4y2Ba尼古丁在gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba叶子。MYC2并不强烈影响其他ja依赖的代谢物，如HGL-DTGs和蛋白酶抑制剂的积累，这一事实表明另一种MYC TF可能参与了这一过程。gydF4y2Ba

尽管不同植物物种之间的植物防御反应的基本组分保护，但在响应结果中存在大量变化，这些反应结果突出了下游监管微调的物种差异[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．例如，与属成员之间相当相似的特征形成对比gydF4y2Ba尼古利亚娜gydF4y2Ba在Myc2的尼古丁生物合成的调节中[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba] （数字gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，让MYC2安静下来gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba没有完全相同的影响gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba；我们没有观察到MYC2在激活JA生物合成的正反馈回路或通过激活JAZ抑制因子抑制jasmonate反应的负反馈中的作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

此外，并非所有JA依赖的防御代谢物（例如HGL-DTGS）受到MYC2的调节gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba。实际上，与防御代谢物的多样性相比gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba， MYC2的调节功能相当有限。这一相当有限的作用表明bHLH转录因子家族的其他成员可能参与了不受MYC2调控的防御反应的调控。最近发现了更多的MYC2转录因子gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]，gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba] 和gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba［gydF4y2Ba59gydF4y2Ba的重叠或不同功能支持这一猜想。gydF4y2Ba

事实上，我们在二倍体中发现了一个额外的myc2样基因(KC906192)gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba与NaMYC2的蛋白序列同源性为72.3%。在系统发育分析中，MYC2样蛋白单独聚集在茄科植物的MYC2分支中，包括gydF4y2Ban .烟草gydF4y2BaMYC2a MYC2b。当我们简要地考察gydF4y2BaMYC2-likegydF4y2Ba基因gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba，有趣的是，在MYC2-like-VIGS植物中观察到防御反应增强(数据未显示)。这与NaMYC2的沉默形成了强烈的对比gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba基因gydF4y2BaBhlh1.gydF4y2Ba和gydF4y2Babhlh2.gydF4y2Ba；［gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)，但同意vigs诱导的沉默gydF4y2Ban benthamianagydF4y2BabHLH3(图中不包括在系统发育树中的基因片段gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），在沉默中增加了尼古丁含量gydF4y2Ban benthamianagydF4y2Ba植物植物植物植物在MEJA的应用后[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．因此，一些MYC2样基因可能作为ja诱导反应的抑制因子，通过与激活型MYC2基因竞争启动子结合位点，有助于对食草动物的防御进行微调。如前所述，JA-Ile积累的瞬态特征[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，严格控制JA信号可能是植物应对环境中多种生物胁迫的关键。中额外的MYC2 TFs的鉴定和表征gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba和其他植物物种可能提供了一个更完整的ja调控防御反应的机制图。gydF4y2Ba

考虑到不同物种中MYC2转录因子结合位点的高度保护[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，我们相信未来的研究在确定这些TFS的结合位点对于了解其功能至关重要。当鉴定这些结合位点时，可以更容易地确定额外的MyC2依赖性基因或响应草药，疾病，环境压力或发育的其他转录因子。识别Myc2 TFS的互动伴侣会很有意思gydF4y2BaNgydF4y2Ba。gydF4y2Baattenuata.gydF4y2Ba并表征交互机制，以了解信号传导组件的发展方式。在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba， MYC2的转录调控需要与重要的调控元件相互作用，包括中介复合物蛋白成员(如MED25)、染色质打开蛋白(如GCN5)、组蛋白乙酰转移酶家族成员和splay (SYD) [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．这些组分的同源物的鉴定与表征gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba可能会测试不同植物家族中信号传导过程的通用性。gydF4y2Ba

植物生长和治疗gydF4y2Ba

N.Attenuata.gydF4y2Ba在美国犹他州大盆地沙漠地区采集种子，经过31代自交系后进行实验。Krügel等人对种子萌发和植物生长条件进行了描述[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．为了模拟草食动物，我们将EV和MYC2-VIGS (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba用锯齿状织物图案轮和伤口的植物用20μL稀释（1：5，水中）处理gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba口腔分泌物（WOS），同时从未治疗的植物收集了对照。评估专家食草动物的表现（gydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba）在转化的植物上，在EV和转化的植物上喂食新孵化的新生儿（gydF4y2BangydF4y2Ba= 20）每4天测量它们的质量。gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默gydF4y2Ba

病毒诱导基因沉默（Vigs）系统，在Saedler和Baldwin中描述了[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba，瞬时沉默MYC2转录因子。简单地说，我们扩增了~ 250bp的片段gydF4y2BaN.Attenuata Myc2.gydF4y2Ba使用特定的引物（附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:表S3)，将它们克隆到PgydF4y2Ba^{TV00gydF4y2Ba}向量。我们通过测序验证了该克隆，并转化了GV3101菌株gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba用未转化的质粒（pgydF4y2Ba^{TV00gydF4y2Ba}或含有插入物的质粒(pgydF4y2Ba^{TV-MYC2gydF4y2Ba}））并在26℃下孵育两天。在渗透的那天，所有构建和P的过夜文化gydF4y2Ba^{BINTRAgydF4y2Ba}和P.gydF4y2Ba^{TVPDSgydF4y2Ba}接种于含抗生素(卡那霉素50 mg/L)的yeh培养基中，28°C孵育5 h。当OD值为0.6 ~ 0.8时，离心(1125gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 5分钟)，将颗粒重悬在等摩尔混合(5mm)的氯化镁中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和MES并制备1：1用辅助菌株P的每个构造混合gydF4y2Ba^{BINTRAgydF4y2Ba}。使用1毫升注射器，我们将悬浮液渗透到25岁的五叶中gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba将植株置于22℃、16 h/天、8 h/夜光照条件下保存2 d。我们用渗透了p的控制装置来监测消声的传播gydF4y2Ba^{TVPDSgydF4y2Ba}而沉默的效率则通过qRT-PCR检测转录本的丰度来确定。gydF4y2Ba

微阵列分析gydF4y2Ba

我们对EV和Myc2-Vigs植物的完全细长的叶子（gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)用WOS处理1h，收集并在液氮中研磨叶片，提取RNA用于微阵列分析，如Gillardoni等[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．杂交和阵列处理后，我们标准化（有75个gydF4y2Ba^thgydF4y2Ba分别列的百分位数)和日志gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba- 从“GPROCESSEDSIGNAL”柱获得的原始表达值并使用微阵列的意义（SAM;gydF4y2Bahttp://www-stat.stanford.edu/~tibs/sam/gydF4y2Ba）在Excel（Microsoft）上包装。对于分析，我们分别将最小折叠变化，三角形和中位数FDR（％）值设置为2,0.69和15.8（％）。与EV植物相比显着不同的基因使用Blast2Go注释[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，并按照TAIR分类进行分组。微阵列数据保存在GEO中，登录号为GSE45608。gydF4y2Ba

转录丰度测量gydF4y2Ba

我们从未处理或wos处理的EV和MYC2-VIGS植物的冷冻叶片材料中提取总RNA (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5）使用制造商推荐的Trizol试剂（Invitrogen）。在使用寡核苷酸（DT）合成cDNA之前，我们用DNA酶（RQ1 rnase-pryga; promega）治疗总RNA。gydF4y2Ba_18gydF4y2Ba上标II逆转录酶(Invitrogen)。利用SYBR Green I (Eurogentec)的qPCR core kit检测Mx3005P Multiplex qPCR (Stratagene)上的转录本丰度。相对转录本丰度的测定是通过比较样品的荧光信号和从WOS处理1 h的样品中制备的稀释cDNA序列，并在同一平板上检测。然后用每个样品分别测定的EF-1α转录本的平均丰度对信号进行归一化。用于qRT-PCR的引物列于附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：表S3。由于BHLH TF系列中多个成员的蛋白质编码序列存在相当大的相似性，因此在生物系统中可能意味着这些调节剂的显着功能冗余。因此，我们仔细设计了我们的引物在基因的3'非转化末端中，以特别是Namyc2转录因子（附加文件）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S2）。gydF4y2Ba

植物激素分析gydF4y2Ba

全面扩大的EV和Myc2-Vigs植物（gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)经WOS处理1 h或2 h，收集并在液氮中研磨，在−80°C下保存至使用。我们在1ml乙酸乙酯中均质约200mg粉末(含200ng /mL D)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba-ja和40 ng / ml dgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba阿坝,DgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba-SA和JA-gydF4y2Ba^13gydF4y2BaCgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba- 内标准），离心20分钟（16,100gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C)，将上清转移到新管中。用0.5 mL乙酸乙酯重新提取微丸，结合上清液，在真空浓缩器(Eppendorf)上蒸发乙酸乙酯，再用0.5 mL 70%甲醇重新悬浮于水中(v/v)。然后，我们将重新悬浮的样品离心10分钟(16,100 g, 4°C)，并使用ProntoSIL®色谱柱(C18;5 μm, 50 × 2mm;Bischoff)连接到柱前(C18;4 × 2mm, Phenomenex)。Woldemariam等人描述了详细的测量条件[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

次生代谢物的分析gydF4y2Ba

为了进行靶向防御次生代谢产物(尼古丁、总17-羟基香叶香叶醇二萜苷[HGL-DTGs]、咖啡基腐胺、二咖啡基亚精胺、绿原酸和芦丁)分析，我们处理了EV和MYC2-VIGS (gydF4y2BangydF4y2Ba= 5）与24,48或72小时的植物，收集并研磨液氮中的样品。收集对照样品而无需治疗。提取约100mg粉末并分析配备有光电二极管阵列检测器的HPLC，如先前在OnkokeSung等人中描述。［gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

诸多代谢组学分析gydF4y2Ba

为进行无偏倚的代谢组学分析，从叶(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)的EV和gydF4y2BaMYC2gydF4y2Ba沉默gydF4y2BaN.Attenuata.gydF4y2Ba幼仔取食植物4 dgydF4y2BaM.Sexta.gydF4y2Ba并在HPLC 1100系列系统(安捷伦，帕洛阿尔托，美国)与MicroToF质谱仪(布鲁克达尔托尼克，不来梅，德国)耦合分析。Gaquerel等人描述了优化的分析程序[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．简单地说，采用XCMS(和CAMERA)软件包进行峰值拾取、峰值检测和RT校正，采用以下参数:centWave方法;ppm = 20;snthresh = 10;峰值宽度= 5 ~ 18 s;minfrac = 0.5;minsamp = 1;bw = 10;mzwid = 0.01;睡眠= 0.001。 To fill missing features, we used the FillPeaks function from XCMS. We exported the pre-processed data to Excel, filtered those features with RTs < 60 seconds and m/z < 80 and analyzed the processed data on Metaboanalyst 2.0 following the procedure described before [82gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

我们使用STATVIEW(5.0版本;SAS Institute, Cary, NC, USA)软件对所有统计检验进行alpha水平0.05的统计分析。gydF4y2Ba

我们感谢德国学术交流服务(DAAD)和国际马克斯·普朗克研究学院(IMPRS)的财政支持。Son Truong Dinh也得到了越南农业和农村发展部和马克斯·普朗克协会的支持。gydF4y2Ba

Namyc2 Genbank登录号：KC832837gydF4y2Ba

Namyc2样GenBank登录号：KC906192gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 伊凡galigydF4y2Ba

   地址：冈山大学植物科学与资源研究所，2-20-1，Kurashiki，日本710-0046gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Max Planck化学生态学研究所的分子生态学系，HansKnöllStraße8，Jena，D-07745，德国gydF4y2Ba

   Melkamu G Woldemariam, Son Truong Dinh, Youngjoo Oh, Emmanuel Gaquerel和Ian T BaldwingydF4y2Ba

通讯作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba伊凡galigydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者证实没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

MGW(设计实验;进行实验;分析数据;写手稿);性病(进行实验);哟(进行实验);如(设计实验;分析数据);国际旅游展的(设计实验;写的手稿; provided financial support); IG (designed experiments; wrote manuscript). All authors read and approved the final manuscript.

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba