两种寄主山松甲虫的单萜合成酶转录组资源及功能特征松果体contorta)及青松(松果体banksiana）

背景

山松甲虫(MPB)Dendroctonus ponderosae)疫症已影响到黑松(松果体contorta)横跨加拿大西部超过1800万公顷的松林，对北方杰克松(松果体banksiana森林)。松树对MPB和相关真菌病原体以及其他害虫的防御涉及到由萜烯合成酶家族(tps)生物合成的油树脂单萜烯。挥发性单萜还作为宿主对MPB的识别线索和MPB信息素的前体。短叶松和黑松萜类生物合成的相关基因在以前是未知的。

结果

我们报告了使用Sanger、Roche 454和Illumina测序技术对黑松和短叶松组装转录组资源的生成和质量评估。组装显示了每个物种大约20,000 - 30,000个基因的转录本，组装分析导致鉴定候选全长戊烯基转移酶，TPS和P450基因的油树脂生物合成。我们克隆并通过重组蛋白在大肠杆菌九种不同的短叶松和八种不同的黑松单叶松。新鉴定的黑松和短叶松单tps包括(+)-α-蒎烯合成酶、(-)-α-蒎烯合成酶、(-)-β-蒎烯合成酶、(+)-3-蒈烯合成酶和(-)-β-茶树烯合成酶。

结论

在缺乏基因组序列的情况下，转录组组装对于在黑松和短叶松中发现防御基因是重要的，正如这里所展示的萜类途径基因。这里描述的功能注释的单萜类化合物的产物谱可以解释在黑松和短叶松中鉴定的主要单萜类代谢产物。

山松甲虫(MPB;Dendroctonus ponderosae霍普金斯大学的流行病已经影响了1800多万公顷的黑松(松果体contorta道格拉斯)在加拿大西部[1，2]。随着流行病的地理范围向东扩展到落基山脉以外，MPB已成为杰克松(jackpine)的威胁。松果体banksiana)，加拿大北方森林的主要松树种。MPB已经成功地在黑松/短叶松杂交带对短叶松进行了殖民[3.]。瓢虫在黑松和杰克松上可能有相似的繁殖成功率和存活率[4，5]。虽然短叶松作为MPB主要寄主的适宜性以及这些树木在MPB爆发期间的生存能力尚不清楚，但MPB寄主范围从长叶松扩展到短叶松林增加了MPB流行对环境影响的风险。

当寄主防御能力减弱或寄主防御能力被MPB和相关真菌的大规模攻击所压倒时，MPB就会在松树上成功定植[6，7]。针叶树采用的几种防御机制之一是产生萜类油树脂，这是一种物理和化学屏障，可以抵御昆虫和病原体的攻击[8- - - - - -10]。油树脂储存在针叶树树皮、木材和针叶的树脂管道中，主要由C₁₀单萜烯和C_20.二萜树脂酸[11- - - - - -13]。单萜烯参与了黑松对成年树皮甲虫、幼虫和甲虫相关真菌的本构和诱导防御反应;然而，单萜烯类化合物防治MPB的效果是可变的，可能取决于甲虫的种群密度[7，14]。在扩散飞行过程中，成虫也利用松单萜烯作为线索来识别合适的寄主树和作为信息素生物合成的前体[15]。昆虫相关真菌也在MPB流行中发挥作用。与mpb相关的松树病原体Grosmannia clavigera具有某些单萜烯的转运和耐受性的分子机制[16]。在文化、g . clavigera可以利用单萜(+)-柠檬烯作为碳源[17]。

在MPB攻击后，黑松对诱导单萜烯积累作出反应[j]。18或接种后g . clavigera(以前也被称为长喙壳属clavigera或Europhium clavigerum) [7，19，20.]。接种真菌后，黑松的存活率与高油树脂分泌水平呈正相关[21]，在低MPB种群密度下，单萜烯含量高的黑松的攻击频率降低[7]。先前的分析发现，(−)-β-茶香烯和(−)-β-蒎烯是黑松中含量最多的油树脂单萜，(+)-3-蒈烯和α-蒎烯也被检测到。7，22- - - - - -25]。据报道，杰克松油树脂的主要单萜为α-蒎烯和3-蒈烯，β-蒎烯、柠檬烯和月桂烯含量较低。26，27]。挥发物排放量的比较表明，黑松释放的β-费蓝烯和β-蒎烯含量较高，而长叶松释放的α-蒎烯和3-蒈烯含量较高。27]。木质部粗提物含有萜烯合成酶(TPS)活性，可合成(−)-β-茶香烯、(+)-3-卡林烯、(−)-β-蒎烯和(−)-沙宾烯，与木质部单萜烯谱一致[j]。28];然而，参与单萜化合物生物合成的黑松和短叶松基因尚不清楚。

tps催化短链二磷酸异戊二烯酯的电离、重排和经常的环化，从而产生植物中发现的数千种不同萜烯的核心结构[29- - - - - -31]。针叶树单萜类化合物使用二磷酸香叶基(GPP)作为底物，通常以立体特异性的方式形成无环、单环或双环单萜烯。单tps可以是单产物酶，也可以是更常见的多产物酶[11，32]。从EST分析和挪威云杉(挪威云杉)tps的全长cDNA鉴定中可以看出，针叶树基因组中含有密切相关的单tps家族。挪威云杉)、锡特卡云杉(p . sitchensis)和白云杉(p . glauca) [32，33]。例如，通过对锡特卡云杉和白云杉的ESTs分析，鉴定了15个单tps并对其功能进行了表征[32]。相比之下，就松树种类而言，据我们所知，只有三种火炬松(p . taeda)的功能表征，其主要产物为(+)-α-蒎烯、(−)-α-蒎烯或(−)-α-松油醇[34]。

我们在此报告了使用Sanger, 454和Illumina测序技术获得的短叶松和黑松大转录组序列资源的生成。通过与核心真核基因集进行比较，并通过挖掘涉及萜类生物合成的序列，特别是CYP720B亚家族的戊烯基转移酶(PTs)， tps和细胞色素p450序列，评估FLcDNA发现的质量。这些酶控制链长(PT;(35])、核心结构(tps，[11])和氧化修饰(CYP720B;(36])的萜类化合物。本研究获得了9个短叶松和8个黑松单tps的FLcDNA克隆和功能鉴定。对短叶松和黑松6种组织类型的单萜烯代谢物分析证实，我们鉴定出了一组单萜烯代谢物，占这些树种中单萜烯的大部分。

长叶松和黑松转录组序列和组装的生成

我们使用Sanger, 454 Titanium和Illumina GA或Illumina HiSeq2000平台生成黑松和短叶松的转录组序列(附加文件)1:表1)。为了进行Sanger测序，我们使用了来自一棵黑松和四棵短叶松的伤口处理茎组织的标准化cDNA文库。测序结果显示，黑松有41134个对端序列，短叶松有36334个对端序列。对于454和Illumina测序，文库是从一棵2年树龄的黑松和一棵2年树龄的短叶松的茎组织中构建的，这两棵树都经过了伤口处理和茉莉酸甲酯处理，以诱导防御反应[37]。454 Titanium测序结果显示，黑松和短叶松分别有大约130万和140万个reads。使用Illumina GAII平台对黑松cDNA文库进行测序，得到5850万个对端reads，而使用Illumina HiSeq2000技术对长叶松cDNA进行测序，得到2.023亿个对端reads。

Sanger序列为CAP3序列[38]。4个标准化cDNA文库的平均插入长度在929 ~ 1136 bp之间。黑松和短叶松各包含约10,000个contigs和4,000个singleton，其中14,000个推定的独特基因(附加文件)2表2)。Newbler (Roche)对454个序列进行了组装，得到了黑松的36,923个contigs和杰克松的33,974个contigs，这相当于每个物种大约30,000个独特的基因。三一(39Illumina序列的组装得到了41,567个长叶松和55,416个短叶松的contigs，这也对应了每个物种大约30,000个独特的基因。利用Newbler构建了Sanger序列和454序列的组合，即杂交组合。这些组合分别为黑松和杰克松提供了33,589和31,327个contigs，代表了每个物种大约20,000个推定的独特基因(附加文件)2表2)。

利用CEGMA基因恢复FLcDNA的组装评估

为了评估和比较FLcDNA恢复的装配，首先使用在458个装配上训练的“核心真核基因定位方法”(CEGMA)评估每个装配是否存在高度保守的真核蛋白拟南芥核心蛋白[40]。在黑松和短叶松Sanger序列中，45-46%的CEGMA蛋白匹配为FL，另外37%的CEGMA蛋白存在但不存在FL3.表S3)。84个CEGMA蛋白中有44个在短叶松组装中没有发现，而在黑松组装中也不存在。黑松和短叶松454序列组合几乎完全覆盖了97-98%的CEGMA蛋白，其中70-71%为FL。黑叶松组合中未检测到的11种蛋白中有9种在短叶松组合中也不存在。同样地，黑松和短叶松Illumina序列组合包含接近完美的CEGMA蛋白覆盖率(98-99%)，FL覆盖率略高(分别为76.5%和77.4%)。在黑松Illumina组合中缺失的6个CEGMA蛋白中的5个在短叶松组合中也缺失。黑松和短叶松的Sanger/454杂交组合各含有97%的CEGMA蛋白，其中约70%为FL。在Sanger序列中鉴定的大多数CEGMA基因也存在于454和Illumina序列中。除了一个例外，所有在Illumina序列组合中缺失的CEGMA基因在Sanger和454序列组合中也不存在。

利用萜类途径基因恢复FLcDNA的组装评估

为了评估和比较黑松和短叶松转录组对萜类通路基因FLcDNA发现的效用，每个转录组都与其他物种的已知PTs、tps和cyp450进行了查询。这些搜索鉴定了7个独特的PTs序列，19个独特的tps序列和8个独特的cyp720b序列(共34个独特基因);青松共有9个独特的PTs、21个独特的tps和8个独特的cyp720b基因(共38个独特基因)。然后，我们用质量术语“全长(FL)”、“非全长(非FL)”或“不存在(NP)”评估了这34和38个基因在每个不同组合中的覆盖率(附加文件)4:表S4)。454和454/Sanger序列组合的FL覆盖率最高，34个目标中14个和13个为赤柱松FL, 38个目标中20个为短叶松FL。Illumina序列组合总体覆盖度最高，34个基因中有27个存在于黑松中，38个基因中有32个存在于杰克松中，但这些组合的FL序列覆盖度较低。每个物种的Sanger序列片段包含不到一半的目标基因，黑松的TPS和CYP720B没有FL覆盖，而短叶松只有一个FL TPS和一个FL CYP720B。基于这些结果，我们使用Sanger/454杂交组装获得了PTs、tps和cyp720b的flcdna。Illumina序列将有助于发现这些家族的其他基因，这将需要额外的努力来产生flcdna。

454/Sanger杂交组合PT、TPS和CYP720基因的挖掘

总体而言，黑松Sanger/454杂交组合包含259个cyp450样contigs，其中14个contigs代表CYP720B亚家族。短叶松组织中含有339个cyp450样结构，其中31个CYP720B结构。如上所述，对黑松和短叶松组合的分析分别发现了6个和7个独特的CYP720B推测FL序列。BLAST对PT和TPS序列的搜索结果表明，这些基因中的许多存在于具有几个密切相关变体的组合中。这种密切相关的变异是次生代谢基因家族的典型特征，在序列数据库中很难解析。为了进一步评估密切相关的变异，从较大的序列数据集中分离出所有被鉴定为PTs或tps的序列，并使用Phrap重新组装[41]以获得一组改进的PT和TPS候选物。对黑松Phrap组合的开采鉴定出20个PT序列和62个TPS序列。对短叶松Phrap组合的开采鉴定出27个PT和76个TPS候选物。进一步人工检查TPS候选序列以去除内含子剪接错误或明显序列问题的序列，结果显示，在黑松中有10个FL序列和23个部分TPS序列(总共33个)，在短叶松中有7个FL序列和38个部分TPS序列(总共45个)。PT序列分析鉴定出黑松7个FL和6个部分序列，短叶松9个FL和2个部分序列。

单tps FL cdna的克隆与鉴定

在33个黑松tps和45个短叶松tps中，我们使用BLAST搜索和专家序列评估对先前已知的针叶树单tps进行了单tps子集的搜索，包括Keeling等人描述的那些。32]。di-TPSs的表征最近发表[42]。我们发现了7个赤柱松和10个部分单一tps候选株，5个赤柱松和24个部分单一tps候选株。从质粒中回收FL单tps，用于Sanger测序或cDNA模板PCR。cDNA末端的快速扩增(RACE)导致了更多的FL单tps的克隆。我们克隆了9个黑松和11个短叶松FL单tps cdna用于重组表达大肠杆菌以及TPS酶功能的表征。8个黑松和9个短叶松的TPS蛋白以GPP为底物具有活性，证实了它们是单TPS蛋白。使用neryl二磷酸作为底物的实验只产生微量的单萜产物，而使用farnesyl二磷酸(FPP)或geranylgeranyl二磷酸(GGPP)没有检测到产物形成。

(−)-和(+)-α-蒎烯，(−)-β-茶香烯和(−)-莰烯合酶的功能表征

从黑松[PcTPS-(+)α -蒎烯]和长叶松[PbTPS-(+)α -蒎烯]中分别克隆出92%和88% (+)-α-蒎烯的单tps酶(图2)1、附加文件5表5)。这些蛋白具有98%的氨基酸序列同源性，并且与先前鉴定的火炬松(+)-α-蒎烯合成酶[34]。另外两个候选子松(PbTPS-mono1、PbTPS-mono2)序列同源性为98%，与(+)-α-蒎烯合成酶同源性为90%;然而，这些蛋白对GPP、GGPP和FPP没有活性。每个种属的一个蛋白[PcTPS-(−)αpin1, PbTPS-(−)αpin1]产生77-78%(−)-α-蒎烯和10%(−)-β-蒎烯。这些蛋白在氨基酸序列上98%与火炬松(−)-α-蒎烯合成酶相同[34]。

两个黑松cDNA [PcTPS-(−)βphell1, PcTPS-(−)βphell2]和一个长叶松cDNA [PbTPS-(−)βphell1]彼此具有95-99%的蛋白质序列同源性，与PbTPS-(+)αpin1, PcTPS-(+)αpin1和PtTPS-(+)αpin1的序列同源性为70%。这些酶的主要产物为82-88%(−)-β-茶兰烯(图2)1、附加文件5表5)。第三个黑松候选物[PcTPS-(−)camp/(+)αpin]与长叶松和黑松(−)-β-油霉烯合成酶的同源性为95%，与(+)-α-蒎烯合成酶的同源性为70%，但产生29%(−)-莰烯和26% (+)-α-蒎烯以及其他次要产物(图2)1、附加文件5表5)。

(−)-β-蒎烯、α-松油醇和(+)-3-蒈烯合酶的功能表征

两个黑松单tps候选物[PcTPS-(−)βpin1, PcTPS-mono1]和两个长叶松候选物[PbTPS-(−)βpin1, PbTPS-(−)βpin2]氨基酸序列同源性为96-98%，与火炬松(−)-α-松油醇合成酶序列同源性为91-93%。34]。令人惊讶的是，这四种蛋白质都不产生α-松油醇，而是产生75-81%(−)-β-蒎烯和8-13%(−)-α-蒎烯(图)1、附加文件5表5)。第二个黑松候选蛋白(PcTPS-mono1)，无论是作为FL还是缺少假定的质体靶向序列的截断蛋白，都没有显示出与GPP、FPP或GGPP的活性。第三个松蛋白[PbTPS-(−)α/βpin1]与(−)-β-蒎烯合成酶的序列同源性为92-97%，但产生了39%(−)-α-蒎烯和33%(−)-β-蒎烯的混合物。

长叶松(PbTPS-αterp)和黑松(PcTPS-αterp)各有1个候选基因序列同源性为92%，主要产物为α-松油醇。这些蛋白与PtTPS-(−)αterp的序列一致性仅为62% [34]，与白云杉和一种白云杉杂交种的1,8-桉叶油脑合成酶关系最为密切(77%同源性)[32]。令人惊讶的是，对α-松油醇产物的立体化学分析表明，PbTPS-αterp产生44%(+)和56%(−)-对映体的混合物，而PcTPS-αterp只产生(−)-对映体。PbTPS-αterp还能产生17%的松油素-4-醇、10%的香叶醇、9%的松油烯和5%的(−)-柠檬烯，而PcTPS-αterp还能产生32%的1,8-桉树脑、9%的(−)-sabinene和8%的月季烯(图2)2、附加文件5表5)。

两种短叶松候选物(PbTPS(+)3car1, PbTPS(+)3car1)和一种长叶松候选物(PcTPS(+)3car1)产生56-68%(+)-3-蒈烯和约10%的萜烯(图2)1、附加文件5表5)。这些蛋白序列同源性为88 ~ 96%，与挪威云杉、锡特卡云杉和白云杉的(+)-3-蒈合成酶的同源性为69 ~ 79%。32，43，44]。

短叶松和黑松的单萜类成分

为了评估重组单tps蛋白的产物是否存在于松树组织中，我们从3年生长叶松和黑松幼树的顶芽、主枝茎、幼针(主枝)、第一轮间茎、成熟针(第一轮间茎)和根中提取单萜烯并进行分析。在这两种松树中，根中总单萜烯含量最低(图2)3.）.赤松6个组织中有5个组织的单萜烯含量最多，分别为52-58%(−)-β-费蓝烯和20-35%(−)-β-蒎烯，但赤松根的单萜烯含量分别为21%(−)-β-费蓝烯、33%(−)-β-蒎烯和32%(+)-3-蒈烯。所有黑松组织中均含有约3%的(−)-α-蒎烯，黑松的顶芽、茎间和主茎中含有7-8%的(+)-3-蒎烯和不到1%的其他单萜烯，包括(+)-α-蒎烯、(+)-β-蒎烯、月桂烯、松皮烯以及柠檬烯和莰烯的同分异构体(图1)3.）.

短叶松主茎和茎间组织中含有26-29%(+)-3-蒎烯、21% (+)-α-蒎烯和18%(−)-β-蒎烯、8-10%(−)-α-蒎烯、7%(−)-柠檬烯、4-5%醋酸龙脑酯和2%(−)-β-茶树烯、月桂烯和萜烯的复杂单萜烯混合物。短叶松针叶单萜含量为15-24%(−)-β-蒎烯，14-18%醋酸龙脑酯，6-15%(−)-α-蒎烯，(+)-α-蒎烯，(+)-3-蒈烯，(−)-β-茶树烯，(−)-柠檬烯。长叶松顶芽中含有27%(+)-3-蒎烯、20%(−)-β-蒎烯、6%醋酸龙脑酯、7% (+)-α-蒎烯以及11%(−)-α-蒎烯和(−)-柠檬烯(图)3.）.

黑松和短叶松单tps的系统发育

一个相邻的系统发育将所有的短叶松和黑松的单tps都置于TPS-d1家族中([32];数字4、附加文件6表6)。许多短叶松和黑松的单tps与其他针叶树种的功能相关的单tps组合在一起。例如，短叶松和黑松(+)-3-蒈烯合成酶与云杉(+)-3-蒈烯合成酶组合在一起[32，43，44]和Pseudotsuga menziesii松油烯合成酶[45]。同样，松(−)-α-蒎烯合成酶(图2)1;额外的文件6表S6;(34])与产生(−)-α-蒎烯和(−)-β-蒎烯的云杉和冷杉酶最接近[32，33，46]。相反，黑松和杰克松(−)-β-蒎烯合成酶与火炬松(−)-α-松油醇合成酶归为一类[34]，与云杉(−)-β-茶香烯合酶关系最为密切[32]，而短叶松和黑松α-松油醇合成酶与云杉酶聚集在一起，产生(−)-芳樟醇和1,8-桉树脑(图2)2, (32，33])。长叶松和黑松(−)-β-油霉烯合成酶与松(+)-α-蒎烯合成酶组合在一起(图2)1;额外的文件1:表S1;(34])，并与其他先前表征的针叶树(−)-β-伞烯合成酶分开分类[32]。

萜类代谢基因的FL转录本鉴定

我们介绍了利用Sanger、454和Illumina技术生成的转录组序列资源，以实现短叶松和黑松的基因发现。生成了不同的程序集来评估重建FL转录本的能力。先前的工作确定Newbler是从454个非模式生物序列中获得FL转录本的理想方法[47]。我们还使用Trinity汇编器来处理Illumina序列。tBLASTn使用CEGMA对装配件进行搜索[40]作为FL转录恢复的一般评估是有用的。Illumina序列的较短长度似乎并不是一个劣势，而且似乎被覆盖的深度所补偿，这使我们能够在两种松树中恢复大部分带有FL转录本的CEGMA基因。

针叶树转录组分析的一个主要挑战是多基因家族成员的FL序列的正确组装，其中密切相关的成员具有不同的功能，并且具有次生代谢的特征。TPS和P450基因，如针叶树的TPS-d和CYP720B基因，就是这种多基因家族的例子[31，32，36]。作为一种发现和解析大型基因家族成员(如针叶树tps)的策略，我们在初始大规模后对目标基因进行重组新创转录组组装。我们之前已经使用这种方法作为转录组组装和基因发现管道的一部分，并在已知的针叶树di-TPS中进行了验证，并成功发现了香脂杉树(冷杉属balsamea) [48]、黑松和杰克松[42]。

单萜类化合物是黑松和短叶松单萜类代谢产物的主要成分

在不同器官和组织类型中占优势的单萜化合物是(−)-β-茶香烯和(−)-β-蒎烯3.）.与这些谱相一致的是，从黑松中鉴定出了2个(−)-β-伞烯合酶和1个(−)-β-蒎烯合酶。另外，从黑松中还鉴定出了产生(+)-α-蒎烯、(−)-α-蒎烯、(−)-莰烯、(+)-3-蒈烯和α-松油醇的单tps。短叶松中含量最多的单萜是(+)-α-蒎烯、(−)-α-蒎烯、(−)-β-蒎烯和(+)-3-蒈烯。我们确定了负责这些代谢物的生物合成的单tps，以及产生(−)-β-茶树烯和α-松油醇的合成酶。在所有测试的杰克松组织中也存在适量的醋酸龙脑酯和(−)-柠檬烯。然而，负责生产这些化合物的合成酶尚未被确定。在其他针叶树中，已从大杉木中鉴定出产生(−)-柠檬烯的单tps [46]，挪威云杉[33]和锡特卡云杉[49]。肝草粗酶提取物(Conocephalum conicum)催化GPP转化为二磷酸龙脑基[50]，可能是醋酸龙脑酯的前体。一个负责生物合成(+)-龙脑二磷酸酯的基因在鼠尾草officinalis(51]。然而，参与醋酸龙脑酯生物合成的基因尚未在任何针叶树物种中被鉴定出来。在黑松和短叶松中检测到的产生剩余单萜烯的tps序列，包括(−)-柠檬烯和龙脑酯，可能以部分转录本的形式存在于我们的组装中。其他方法，如靶向RACE，可能需要获得FL cdna进行功能表征。在jackpine和lodgepole pine的部分或未表征的单tps样基因中，也可能存在使用二甲基丙烯基二磷酸作为底物产生半萜烯的tps松果体sabiniana(52]。这种可能性将在未来的工作中得到检验。利用黑松和短叶松的转录组资源，最近有报道发现了一组双功能和单功能的di- tps [42]。总之，这些双tps和单tps在这里描述占大部分的油松和杰克松的油树脂防御化合物。

从短叶松中发现了两个(+)-3-蒈烯合成酶，从黑松中发现了一个(+)-3-蒈烯合成酶，这可能表明(+)-3-蒈烯合成酶的拷贝数变化导致了这些树木(+)-3-蒈烯含量的差异，类似于西卡云杉(+)-3-蒈烯表型的拷贝数变化[44]。先前的研究已经确定(+)-3-蒈烯在防御油松(松果体tabuliformis)对付红松节油甲虫(Dendroctonus史书上)及其相关真菌(Leptographium procerum) [53]。此外，(+)-3-芳烃与锡特卡云杉对白松象鼻虫的抗性有关[44，54]。短叶松各组织类型的(+)-3-芳烃含量均高于黑松对应组织的含量，与前人对短叶松和黑松挥发物排放量和油树脂含量的比较结果一致[j]。27]。黑松的单萜含量，包括(+)-3-蒈烯，具有很强的遗传意义。55]和地理[25]成分，并对MPB宿主定植有重要影响[14]。

短叶松和黑松单tps功能多样性研究

基因复制后的亚功能化和新功能化可能是大型针叶树TPS基因家族的起源[j]。31- - - - - -33，56]。本研究中鉴定的17个单萜类化合物为针叶树物种单萜烯多样性的分子基础提供了额外的见解。短叶松和黑松的单tps基因是含有针叶树单tps的TPS-d1家族的成员[31- - - - - -33]。许多松树的单tps，包括负责(+)-3-芳烃和(−)-α-蒎烯生物合成的基因，在系统发育上与火炬松、大冷杉和云杉的单tps功能相似。这种跨物种的功能保护表明，相当多的基因复制和功能化发生在松、冷杉和云杉的物种形成之前。

长叶松和黑松(+)-α-蒎烯合成酶和(−)-β-茶香烯合成酶与前文描述的火炬松(+)-α-蒎烯合成酶归为一类[34作为一个独特的和明显的松果体TPS-d家族中的特定分支(图2)4）.短叶松和黑松(−)-β-黄檀烯合酶分别属于锡特卡云杉[32]和大杉木(−)-β-茶香烯合成酶[57]强调了针叶树中(−)-β-茶树烯生物合成的多重起源。以产生(+)-α-蒎烯为主要产物的基因在针叶树属中还未被发现松果体这表明，这种功能可能是在与云杉和冷杉分离后，在松树谱系中进化而来的。

从长叶松和黑松中提取的3个蛋白序列与先前鉴定的火炬松(−)-α-松油醇合成酶具有91-93%的同源性。基于序列的同一性，人们可能已经预测到短叶松和黑松的蛋白质会相似地产生α-松油醇。令人惊讶的是，这些蛋白产生75-81%(−)-β-蒎烯而不产生α-松油醇。先前的报告表明，一些氨基酸的取代足以改变从大杉木中提取的单tps的产物谱[58，59]。短叶松、黑松和火炬松的这些功能蛋白序列高度一致，说明了针叶松单tps的功能可塑性。

在这里，我们展示了在Sanger、454和Illumina测序平台上生成的大鼠松和短叶松的转录组资源。除了使用高度保守的植物和真核基因进行组装的质量评估外，我们还成功地专注于FLcDNA的恢复和密切相关的序列的解析，这些序列是针叶树防御和次生代谢大基因家族的特征。专家组织的组装和注释在这里研究的两种松树物种中鉴定了大量的萜类途径基因。与之密切相关的短叶松和黑松具有独特的单萜烯谱，在与MPB和MPB相关真菌以及其他害虫的相互作用中起防御和标记化学作用。本文所鉴定的单萜类化合物的多样性和不同的功能解释了不同组织中许多主要和次要的单萜类化合物，同时也指出了有待发现的萜类生物合成酶。所鉴定的基因为进一步研究这些化合物及其种内和种间变异和动态在短叶松和黑松对MPB的防御中的作用提供了基础。

松木组织的来源、处理及RNA提取

在桑格测序中，六岁的洛奇波勒松(松果体contorta)树是由BC省林业和牧场部提供的。在英属哥伦比亚大学温哥华校区外，树木被种在花盆里。一年青松(松果体banksiana)从“Prince Albert West”种子中获得，并在阿尔伯塔大学的生长室中保存。分别在采伐前1、2、4、8天用刀片机械伤伤1棵长白松的主材和顶3个叶间轮以及4棵短叶松的顶3个叶间轮。在收获时，从树上砍下茎段，手工将树皮与木质部分离，并除去针叶。树皮和木质部立即分别在液氮中冷冻，保存在- 80°C。

为了进行454和Illumina测序和代谢物分析，我们在不列颠哥伦比亚大学将短叶松(克隆ID PSB 410 1 + 0)和黑松(克隆ID PLI 144)幼苗保持在户外。为了提取RNA，在诱导防御基因表达之前，将每个物种的4棵2岁树苗移入温室，在24°C和每天16小时的光照下维持两周。每棵树的茎沿整根茎切开2 ~ 3cm，在树的地上部分喷洒0.1%茉莉酸甲酯50 ml。每棵树的四分之一茎(树皮和木质部)在处理后2小时、6小时、24小时和48小时收获，并在提取RNA之前汇总每个个体的四个时间点。为了进行代谢物分析，在收获前将每个物种的5棵3岁树苗移入温室两周。从每棵树上采集组织样本，并在- 80°C快速冷冻并保存，直到处理，但在冷冻前将树皮和木质部组织切成1厘米的切片。

RNA隔离

对于Sanger测序，从单个黑松的四个茎段中提取分离的树皮和木质部组织的总RNA，如前所述[60]。对于杰克松，根据Pavy等人的方法，从每个单独的树皮和木质部组织样本中提取总RNA。[qh]61并汇集在一起。在RACE、全长cDNA克隆和454模板及Illumina测序中，提取单株杰克松和黑松的RNA，并按照前面的描述将其转化为cDNA [44]。

cDNA文库构建及转录组测序

为了构建Sanger cDNA文库，使用Oligotex mRNA Kit (Qiagen;http://www.qiagen.com)，用RiboGreen (Invitrogen;http://www.invitrogen.com）.利用Creator SMART cDNA文库构建试剂盒(Clontech;http://www.clontech.com)和trim - direct cDNA归一化试剂盒(Evrogen;http://www.evrogen.com）.以长叶松总RNA 225 ~ 1500 ng或poly(A) 106 ~ 1300 μg制备第一链cDNA。⁺红松RNA, SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)， cds - 3m引物(Evrogen)和SMART IV寡核苷酸(Clontech)。用Phusion Hot Start DNA Polymerase (Finnzymes)，http://www.finnzymes.fi）.cDNA用双工特异性核酸酶进行归一化，并按照Trimmer-Direct协议进行扩增。然后用你以后1、通过凝胶过滤分离的大小，cDNA大于约。500 bp连接到pDNR-LIB (Clontech)。然后将结扎物转化为ElectroMAX DH10B T1抗噬菌体电态细胞(Invitrogen)，滴定并提交Michael Smith基因组科学中心进行排列和测序。使用M13正向和反向引物完成Sanger测序(配对端读)。对于黑松，从树皮和木质部cDNA文库中分别测序了10000个cDNA克隆。对长江松的树皮文库和木质部文库分别进行了15550个和6528个cDNA克隆测序。

对于454和Illumina测序，cDNA文库在麦吉尔大学和QC蒙特利尔的gsamnome qusambec创新中心制备和测序。对于Roche-GS-FLX - Titanium(454)测序，使用Dynabeads mRNA纯化试剂盒(Invitrogen)纯化200 ng mRNA，并使用ZnCl片段化₂缓冲区。利用GS FLX Titanium Series cDNA快速文库制备试剂盒(Roche;http://www.roche.com)，并进行两个半板(单端读取)测序。Illumina测序时，使用mRNA Seq sample Preparation Kit (Illumina;http://www.illumina.com）.使用Illumina Genome Analyzer iiX (Illumina GAII)平台对黑松文库进行1 lane测序(108 bp对端reads)，使用Illumina HiSeq 2000平台对黑松文库进行1 lane测序(100 bp对端reads)。

长叶松和黑松转录组序列的筛选与组装

去除低质量和嵌合reads后，筛选原始Sanger序列的污染物大肠杆菌K12，真菌，各种细菌和古细菌基因组，等等昆虫纲est序列。然后使用Seqclean修剪这些序列，以删除任何剩余的适配器序列。454和Illumina序列使用FastQC目测检测。开发了一个自定义Perl脚本，使用从测序中心获得的454和Illumina的fastq文件来修剪这两种情况下的适配器残留物。Sanger序列用CAP3进行组装[38]。Newbler(版本2.6;Roche)仅用于454和454/Sanger混合装配。Trinity(版本20110519;(39])用于新创Illumina GA/HiSeq序列的组装。

初步鉴定独特基因，CEGMA FL蛋白和FL萜类途径靶点的比较

拟南芥CEGMA肽序列使用TBLASTN查询6帧翻译的转录组序列，e值截止值为1 × 10^-20年。同样，使用MEGABLAST查询FL萜类生物合成途径基因的组装，其截止集的一致性为99%。开发了一个自定义Perl脚本来评估预测文本的连续性。对于CEGMA基因，只有BLAST比对中顶部命中且查询肽覆盖率至少为90%的片段被认为是FL。萜类生物合成途径基因在至少一个组装中被鉴定为FL，或通过RACE获得FL，针对每个组装进行BLAST搜索，以比较这些组装对防御基因发现的效用。最后一组来自黑松的7个PT、19个TPS和8个CYP720B基因，以及来自短叶松的9个PT、21个TPS和8个CYP720B基因被认为是FL基因，并被用于该分析。更严格的95%覆盖率被认为是萜类生物合成基因的FL。

候选tps的cDNA克隆鉴定

对黑松和短叶松454 Newbler组合进行BLAST检索，其中包含107个先前鉴定的单pps、双pps和双pps, 15个先前鉴定的PTs和468个先前鉴定的p450。在Newbler组合中鉴定的每个contigs中包含的reads的e值小于1 × 10⁵到萜类生物合成途径基因，然后用Phrap重新组装[62以获得最终的候选基因列表。

monotps的克隆与鉴定

从用于Sanger测序的cDNA文库中检索FL克隆，从pDNR-LIB克隆到pET28b(+)载体(EMD Chemicals;http://www.emd-chemicals.ca)表达。对于其他克隆，如果需要RACE，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)处理1 μg的总RNA，并将该cDNA用作基因特异性引物的模板(附加文件)7:表S7)和通用底漆混合按制造商的协议。利用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen)将50 ng的长叶松RNA和90 ng的长叶松RNA转化为cDNA，并以基因特异性引物为模板进行克隆7表S7)。利用In-Fusion PCR克隆系统(Clontech)将cDNA克隆直接克隆到pET28b(+)载体上，或亚克隆到pJET1.2 (Fermentas;http://www.fermentas.com)，然后使用In-Fusion克隆亚克隆到pET28b(+)。测序证实FL序列位于pET28b(+)中n端6 × His标记的框架内。重组蛋白在His SpinTrap色谱柱(GE Healthcare)上表达，ni亲和纯化，并按照前面的描述在单个小瓶中进行检测[44，56，63]。用GPP (20 μM)检测含有重组蛋白的细菌颗粒提取物;E，E- FPP (70 μM)和GGPP (40 μM)在适当的缓冲中[32]，进行GC/MS分析。用GPP及其异构体NPP作为底物，提取、纯化和测定具有GPP活性的候选克隆，一式三次。

短叶松和黑松中单萜的提取

从3年生的短叶松和黑松树苗中提取六种不同的组织或器官类型，每种约0.1 g叔-丁基甲基醚(Sigma)含1.2 mM异丁基苯作为内标。在室温下摇一夜后，将1ml提取物转移到一个新鲜的小瓶中，并按前面所述进行处理[54]。每个组织类型重复提取5次生物重复和3次技术重复。6种组织类型分别为:顶芽、主枝树皮与木质部结合、主枝幼针、第一轮间树皮与木质部结合、第一轮间成熟针和根。

单萜烯的GC/MS分析

气相色谱-质谱(GC/MS)分析采用Agilent 6890A系列气相色谱-质谱系统，连接Agilent 5975惰性XL质谱仪(70 eV)和Agilent 7683自动进样器(Agilent Technologies;http://www.agilent.com)，如先前刊物的补充资料所述[44]。所有分析均采用脉冲无分裂注射模式，注射温度为250°C。使用Enhanced MSD Chemstation E.01.00 (Agilent Technologies)对数据进行分析。数据收集采用两种全扫描方式(m / z40-400)和单萜烯选择性离子监测(m / z69、93、121、134、136)模式。单萜类化合物通过质谱、保留时间和质谱库(Wiley7Nist05)进行鉴定。根据已知的异丁基苯浓度计算响应因子，并使用这些值来量化单萜化合物。

酶分析用DB-Wax毛细管柱(J&W 122-7032;内径250 μm，长度30 m，膜厚0.25 μm，初始流量1.0 ml He min^－1)，温度为40°C，保持4分钟。温度每分钟增加3°C^－1至85°C，此时温度升高30°min^－1最终温度为250°C，保持3分钟(总运行时间27分钟)。

采用SGE SolGel-Wax毛细管柱(SGE Analytical Science 054796)，内径250 μm，长30 m，膜厚0.25 μm，初始流量1.1 ml He min^－1）.初始温度为40°C保持4分钟，此时温度以3°C min的速率升高^－1至80°C，再至40°C min^－1最终温度275°C，保持5分钟(总运行时间27.21分钟)。

为了对酶测定产物和组织提取物进行立体化学分析，单萜烯在Cylcodex B毛细管柱(J&W 112-2532;内径250 μm，长度30 m，膜厚0.25 μm，初始流量0.8 ml He min^－1)，初始温度为60°C，保持1分钟。温度以1°C min的速率升高^－1至84℃，然后以50℃min的速率升高^－1最终温度为240°C，保温5分钟(总运行时间为33.12分钟)。

系统发育分析

CLC Main Workbench, Version 6.2;http://www.clcbio.com)用于所有序列分析，包括比对和系统发育分析。系统发育分析和bootstrap值(100个重复)的计算在与CLC bio MUSCLE插件对齐后，使用制造商设置的邻居连接算法进行。

CEGMA:

核心真核基因定位方法

di-TPS:

二萜合酶

FL:

全身的

FPP:

通过二磷酸

GC / MS:

气相色谱质谱法

GGPP:

Geranylgeranyl二磷酸

GPP:

香叶二磷酸

Mono-TPS:

单萜合酶

产:

山松甲虫

NPP:

Neryl二磷酸

P450酶:

细胞色素P450

PT:

Prenyl转移酶

TPS:

萜烯合酶。

我们感谢Karen Reid出色的实验室和项目管理，Niels B. Jensen在数据挖掘方面的协助，BC省癌症机构Michael Smith基因组科学中心(温哥华)，麦吉尔大学和gsamnome qusambec创新中心(蒙特利尔)的转录组测序。这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC对JB和CB的战略资助)、加拿大基因组、不列颠哥伦比亚基因组和阿尔伯塔基因组(Tria项目)的资助。http://www.thetriaproject.ca;到JB、CB、CIK、JEKC、SJMJ)。JB是UBC杰出学者。这项研究得到了西网格和加拿大计算协会提供的计算资源的支持。

数据库提交

本文的序列数据已存入NCBI，登记号如下。Sanger est: NCBI dbEST GT229582-GT270713 (lodgepole pine)和GW738148-GW774480 (jackpine);Illumina ESTs: NCBI SRA BioProject SRP009894;FL单tps: NCBI GenBank登录号:JQ240290-JQ240309。Tria项目由NCBI保护伞BioProject PRJNA169907代表。

从属关系

1. 迈克尔·史密斯实验室，不列颠哥伦比亚大学，2185东广场，温哥华，不列颠哥伦比亚省，加拿大，V6T 1Z4

   Dawn E Hall, Macaire M S Yuen, Sharon Jancsik, Alfonso Lara Quesada, Harpreet K Dullat, Maria Li, Hannah Henderson, Christopher I Keeling和Jörg Bohlmann

2. 加拿大阿尔伯塔大学生物科学系，埃德蒙顿，加拿大，t6g2e9

   Adriana Arango-Velez和Janice EK Cooke

3. 不列颠哥伦比亚省癌症机构基因组科学中心，温哥华，不列颠哥伦比亚省，V5Z 4E6，加拿大

   廖玉玲，罗德里克·T·多克，陈国强和史蒂文·琼斯

4. 不列颠哥伦比亚大学木材科学系，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华2424 Main Mall, V6T 1Z4

   科莱特Breuil

相应的作者

对应到Jorg Bohlmann。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

DEH, MMSY, SJ, ALQ, HKD, ML, HH, CIK进行实验和数据分析。AA-V、JEKC提供了新材料。NYL, TRD, SKC, SJMJ提供生物信息学支持。CB, JB构思了这项研究。DEH, MY, JB分析了结果并撰写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。

转载及权限