两种最近复制的玉米NAC转录因子拟对数在响应Colletotrichum graminicola.感染

背景

NAC转录因子属于一家大型植物特异性转录因子，在单子叶和单萝卜​​物种中拥有100多个家庭成员。迄今为止，大多数研究的NAC蛋白涉及对非生物胁迫的反应

结果

我们发现了两种NAC转录因子，ZMNAC41和ZMNAC100.，都是转录诱导的初始生物营养和随后的坏死营养定植玉米叶片由半生物营养子囊菌真菌C. Graminicola.．ZMNAC41还在感染后诱导转录物C. Graminicola.在主体渗透率上有缺陷的突变体，而诱导ZMNAC100.并没有发生在这种相互作用中。尽管ZMNAC41特异性响应于茉莉（JA）的转录物，ZMNAC100.转录物也被水杨酸类似物2,6-二氯硅酸（INA）诱导。

评价…的系统发育关系ZMNAC41和ZMNAC100.，我们研究了基于最近注释的B73基因组信息的基于最近注释的B73基因组信息的玉米NAC转录因子。我们鉴定了116种玉米NAC转录因子基因，聚集成12个枝条。ZMNAC41和ZMNAC100.两者都属于CLADE G，并且近期基因复制事件似乎已经出现。包括玉米和功能表征拟南芥和水稻NAC转录因子的四种其他与防御相关的NAC转录因子，我们观察到富集在CLADE G中的NAC转录因子的富集。在Silico.在6个与防御相关的玉米NAC转录因子的启动子中，有4个确定了防御诱导的ERF、Myc2、TGA和WRKY转录因子的假定结合元素，而其中一个分析的玉米NAC不包含这些潜在结合位点。

结论

我们的研究提供了一个系统的在Silico.玉米NAC转录因子分析，其中我们提出了编码NAC转录因子的玉米基因的命名法，基于它们的染色体位置。我们进一步鉴定了五种病原体响应玉米NAC转录因子，其涉及近端启动子区中其他防御相关转录因子的推定结合元素，表明所述NAC在玉米防御网络中的涉及。我们的系统发育分析表明，来自所有植物物种的大多数描述的病原体响应NAC蛋白属于CLADE G，并表明它们是文学相关的。

NAC转录因子属于植物特异性转录因子的一个大家族，在不同的组织和不同的发育阶段表达。家族的创始成员N来自矮牵牛和一种TAF1和CUC2从拟南芥，1996年和1997年描述了[1那2，这些基因的首字母缩写被用来为新发现的多基因家族命名。到目前为止,105年南汽基因已经在拟南芥基因组[3.， 138在大米中[4.，玉米的115 [5.]，113在高粱，177名在大豆和148人在杨树，但只有40棵苔藓和穗子苔藓（尖刺苔藓）5.那6.］．

该组转录因子的特征是在N-末端存在NAC结构域的存在[2]，由160个氨基酸组成，在成员之间高度保守，由5个亚域a - E [3.］．该区域作为DNA结合的平台，以及与其他NAC蛋白的同源或异源二聚[7.那8.］．NAC结构域结构的测定揭示了一种新的转录因子折叠;由α-螺旋包围的扭曲β-薄片[9.]最近显示与靶DNA的主要凹槽相互作用[8.］．相反，C末端区域的顺序和长度是可变的，并且用作转录激活剂[10那11[转录压缩机[12］．

NAC转录因子调节植物中各种过程。NACS在植物器官在射击顶端商品中植物器官发展的监管作用[2那13，腋生分生组织[14，子叶[1]，侧面根[11那12]，Xylem [15那16或次级细胞壁[17那18已经得到了深入的研究。此外，已有研究表明，NAC转录因子家族的许多成员协调响应非生物胁迫。osnac5和osnac6.从大米被证明是由寒冷，干旱和高盐度诱导的，并且彼此相互作用，并用第三米NAC转录因子相互作用Snac1.诱导应激响应基因的表达。因此，水稻植物过表达OsNAC5那OsNAC6那OsNAC10那OsNAC45, SNAC1和Snac2.比野生型水稻更能抵抗高盐环境[19-22］．的表达OsNAC63高盐胁迫和渗透胁迫对水稻根系也有强烈的诱导作用。拟南芥植物过表达OsNAC63表现出盐度诱导基因的组成型上调，并产生对这些应激条件中的两者更耐受的种子[23］．

此外，NAC转录因子参与了植物衰老的调控拟南芥，其中过表达AtNAP导致莲座叶早衰[24而在小麦中，转录水平较低丹尼亚姆延迟衰老发作[25］．此外，拟南芥的NAC转录因子RD26是由干旱和ABA诱导的RD26外源ABA处理对RD26表达不敏感，表明RD26在ABA信号转导中起作用[26］．

在过去的十年中，NAC转录因子也被证明参与了植物防御网络的监管。例如，NAC转录因子ATAF2充当阻遏物PR.基因表达拟南芥[27]，而Ataf1负面调节对坏养殖真菌和细菌病原体的防御反应[28］．此外，ANAC019和ANAC055参与了拟南芥中ja依赖的防御基因表达[29］．OsNAC6和OsNAC19在稻瘟病真菌挑战时诱发水稻M. Grisea.，和过度表达OsNAC6导致增加稻瘟病的抗性[21那30.］．最后,一个土豆南汽在叶片中接种Phytophthora Infestans.[31] 和BnNAC1-1, BnNAC5-1和BnNAC5-7在跳蚤甲虫殖民化期间发现在油菜中诱导基因和sclerotinia sclerotiorum.感染(32］．

到目前为止，有关玉米NAC转录因子的表达谱和可能的功能的数据还很有限．zmnam1.（ZMNAC70.在本报告中)和ZmNAM2（ZMNAC35）在胚胎发育期间在芽顶部分生质中表达，表明它们与拟南芥和喇叭花原例发挥了类似的作用。成绩单ZMNAC4.在开发胚乳时被检测到ZMNAC5和ZMNAC6.，推定的寄生术，在殖民唑中表达[33］．另外两种NAC转录因子的转录物，NRP-1和APN-1在胚乳中发现，成绩单APN-1在发育胚胎中也被检测到[34那35］．一组四种NAC转录因子被证明参与玉米次生细胞壁生物合成:ZMSWN1.那ZMSWN3.那ZMSWN6.和zmswn7.能够补充拟南芥的表型吗snd1 / nst1双突变体，其缺乏木质纤维中的二次细胞壁。这四种玉米NAC转录因子中的每一个的过度表达拟南芥野生型导致次生细胞壁异位沉积，导致卷曲叶表型类似于观察到的SND1.过度抑制植物，表明ZmSNWs是功能性的正轨SND1.[36］．

虽然有证据表明NAC转录因子参与植物防御，但目前还没有玉米的相关数据。因此，我们的目的是描述两个成员不结盟运动我们发现在玉米叶子诱导的基因家族挑战Colletotrichum graminicola.．C. Graminicola.威尔逊[teleomorph (Cesati)Glomerella graminicola.玉米炭疽病，叶枯病和茎腐病是玉米的一种重要的经济病害。Zea Mays.l .)。的C. Graminicola.感染循环从叶片表面开始，其中孢子发芽。在萌发后，专用感染细胞，沉淀物在胚管尖端处分化。孕除孔化并积累兼容性溶质以发展高压杆压力，随后随后转化为机械力以使植物细胞壁用渗透栓刺穿。在宿主组织内，真菌最初产生体积的初级菌丝，其生成生物营养，即不破坏宿主血浆膜。这种生物营养阶段持续约2天。随后，切换到虚张症的生长，涉及改变生活方式和亚酚形态的变化。薄，快速生长的坏养殖菌丝迅速地殖民和杀死宿主细胞，可以宏观地观察到延长坏死病变。最后，病原体在坏死区域的表面上形成acervuli，通过雨飞溅分配给新的宿主组织的特异性地产生分枝瘤的特异性结构。37那38］．

在本研究中，我们提供了玉米NAC转录因子家族的系统命名，为揭示两种NACs在玉米-C. Graminicola.玉米和其他植物的互作和其他防御诱导NAC是进化相关的。

在感染的叶子中诱导了两种玉米NAC转录因子Colletotrichum graminicola.

为了调查哪个宿主基因响应C. Graminicola.在相互作用的不同阶段感染，我们将叶片的转录组与2×10进行了比较了喷涂的^6.在36hpi的生物营养相期间和通过微阵列分析在96 HPI下切换到病症治疗对照叶片的分析治疗的对照叶（参见[39])。在36hPI下，超过313个基因被差异调节（折叠变化> 2），其中在感染的叶片中上调了251个。在该组中，两个基因编码推定的NAC转录因子ZMNAC41和ZMNAC100.被发现，在96 HPI的病重养殖叶片定植期间也诱导。确认微阵列数据，转录水平南汽通过QRT-PCR在2和4 DPI评估基因（图1)．尽管ZMNAC100.转录物诱导4-5倍，ZMNAC41是诱导7倍。由于喷雾接种只导致表皮细胞的一小部分感染，两者都诱导北亚受感染细胞的转录物可能显着高。为了确定互动的早期时间点的感应动力学，我们评估了ZM.NAC41和ZM.与喷射接种叶片相比，浸渍叶片中的NAC100转录物量在受感染组织的比例更高（参见方法部分）。我们雇用了两者C. Graminicola.野生型(WT)株CgM2和突变株CgM2农杆菌肿瘤术-介导转化(ATMT)，其毒力受到不同程度的影响。而突变体AT171的真菌渗透降低了50%，其毒性受影响较小(见[40]），突变体AT416无法有效地渗透宿主组织并在毒力中受到强烈影响（图2一种）。在WT感染的叶子中，ZMNAC41在24hpi的预渗透阶段已经弱诱导，但大量的转录本积累与36hpi的生物营养的建立时间一致(图2b）。ZMNAC41在与所有测试时间点的两个突变体中也被诱导的相互作用，并且表达水平与所用菌株的毒力呈正相关（图2b）。相比之下，表达ZMNAC100.第一次诱导是在WT和AT171突变株以36 hpi的水平成功穿透宿主组织后。相反，突变株AT416未能诱导产生ZMNAC100.基因（图2C).侵染的时间是通过对侵染叶片的显微观察来确定的(数据未显示)。我们的数据表明ZMNAC100.仅在成功渗透后诱导C. Graminicola.这表明这种NAC可能是诱导防御反应的一部分。两者表达水平的相关性北亚真菌毒力的基因表明，它们可能是玉米相互作用中的潜在兼容性因素C. Graminicola.．

ZMNAC41和ZMNAC100.由防御信号和叶片衰老引起

既ZMNAC41和ZMNAC100.应对生物压力,我们评估他们的响应激素参与协调植物防御反应和治疗与茉莉酸或2玉米叶子,6-dichloroisonicotinic酸(INA)、水杨酸的模拟,或乙烯前体1-aminocyclopropane-1-carboxylic-acid (ACC),乙烯的前兆。这两种转录因子在处理10小时后已经被茉莉酸诱导(hat)，并转录ZMNAC100.进一步累积到24帽子（图3.)．而且，转录本的积累ZMNAC100.，但不是那样的ZMNAC41通过外源应用INA增强。这些结果表明ZMNAC41是由JA特异诱导的，两者都不是ZMNAC41也不ZMNAC100.回应乙烯（图3.)．然而，归纳ZMNAC41和ZMNAC100.在与之兼容的互动期间C. Graminicola.是约。是JA和INA诱导的100倍3.)．

许多NAC转录因子在衰老计划期间参与基因调控（通过[41那42)，在此期间，防御相关基因也会被诱导。两者的转录水平，ZMNAC41和ZMNAC100.与幼苗相比，在叶片发育过程中增加，衰老叶中较高约4倍（图4.一种）。

ZMNAC41和ZMNAC100.在盐胁迫下会下调吗

NAC转录因子家庭的一些成员，如OsNAC6被描述为响应于生物和非生物应激而具有重叠的角色[21］．因此，我们对玉米植物进行了干旱或高盐度条件，并评估了两者的转录水平北亚基因。两种转录因子在盐胁迫下均下调ZMNAC100.在干旱胁迫下也下降了(图)4.这些结果表明两者都是ZMNAC41和ZMNAC100.在生物和非生物胁迫条件下明显调节。

在防御反应中还会诱导额外的玉米NAC转录因子

我们进一步分析了其他玉米NACs是否也与防御反应有关。我们的转录组分析显示，ZmNAC15和ZMNAC97.在坏养殖阶段弱诱导C. Graminicola.感染(表1)．从诱导的四种NAC基因C. Graminicola.玉米互动,只有ZMNAC41也响应真菌生物术而上调Ustilago Maydis.[43］．然而，归纳ZMNAC41经过美国maydis仅在12 hpi时观察到，在黑穗病菌的主动防御抑制之前[43］．另外，还有两个NACs，ZMNAC36和ZMNAC38在与之相互作用中被转录压抑美国maydis在4 dpi的肿瘤形成后。

为了确定在两种病理系统中观察到的NAC基因调控背后的调控回路，我们对鉴定的玉米NAC基因上游启动子区域进行了详细研究，以确定是否存在与防御相关转录因子的结合基序，以阐明某些启动子元件是否可以产生特定的应答C. Graminicola.或美国maydis．所有启动子含有核心NAC转录因子结合位点，这些转录因子已预测来自启动子元素分析ANAC019和ANAC092[7.］．用于两种拟南芥NAC的整个NAC结合基序可以在一至五份的所有分析的启动子中发现，表明其他NAC蛋白可以与分析的NACS的促进剂结合为同源或异二聚体（表2)．此外，所有人的启动子ZMNAC97.，含有ERF和TGA转录因子的结合位点，其分别调节靶基因的表达，分别响应乙烯或水杨酸。发现了在许多茉莉酸响应基因的启动子中存在的Myc2结合位点ZmNAC15那ZMNAC38和ZMNAC41，而wrky结合基序在ZmNAC15那ZMNAC36，ZMNAC41和ZMNAC100.．尽管SERF，TGA，MYC2和WRKY结合基序具有相当大的守恒，但是六种分析的NAC基因的启动子在其单独的基序组合物中不同。在起始密码子上游的近端区域500bp中，仅推定的ERF绑定基序仅存在ZmNAC15和ZMNAC38，而所有可能的WRKY结合位点均位于该近端区域。有趣的是,wh-binding motif只在ZMNAC41和ZMNAC100.，在玉米早期互作过程中唯一诱导的成员C. Graminicola.．总之，ZMNAC15，ZMNAC36，ZMNAC38，ZMNAC41和ZMNAC100.基因均包含已知在近端启动子区域内涉及植物防御网络的其他转录因子的潜在结合元素。

玉米NAC转录因子家族分析

启动子元素在六分析的NAC转录因素之间非常保守的事实促使我们探索其进化关系。使用未组装的玉米基因组信息，Shen等。[6.]确定了177个推定玉米南汽基因。由于B73玉米参考基因组的组装可用[44，我们根据B73基因组信息对NAC转录因子家族进行分析。

的保守NAC结构域ZMNAC41和ZMNAC100.作为搜索肽数据库的查询（第5B.60版）存放在http://maizesequence.org．此外，Grassius Grass Regulatory Information Server (http://www.grassius.org/index.html)，对组装好的玉米基因组进行攻击。作为两项调查的结果，已经确定了116个假设的玉米NAC基因(不包括可变剪接变异)，这些基因被重新命名为ZmNAC，并以阿拉伯数字递增，这是由于染色体定位作为后缀(从1号染色体的短臂开始，参见附加文件1：表S1）。在整个推定的NAC蛋白序列上进行多次对准，用于构建系统发育树，这揭示了家庭可以分为12个枝条（图5.)．从整个NAC序列产生的系统发育树（图5.）与仅来自NAC结构域的比定（未示出）获得的那些非常相似，表明NAC结构域允许各个曲折之间的大部分区别。

为每个疏水板产生的共识序列的对准揭示了NAC蛋白的典型域架构。包括NAC结构域的蛋白质的N-末端部分在片状之间储蓄储蓄，而C末端区域即使在相同的车间的成员之间也高度发散（附加文件2:图S1)。如拟南芥和水稻NAC转录因子家族所述[3.那4.]使用来自9和11种不同植物物种的基因组信息，在两次调查中[5.那6.]，在NAC结构域中分别有5个高度保守的子结构域A-E，它们之间被大约10-20个aa隔开(图)6.)．为了鉴定所有植物的亚域A-E的共识序列，所有玉米NAC转录因子的NAC结构域用MEME筛选（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi., (45])。除了Clade A共同的公共图案之外的所有片状（切断P值1∙e^-10)在NAC域中(图7.)．更详细地分析这些常见基序揭示了每个主题的保存在同一地区的植物中比与其他曲线的比较相同。如子域D（图8.），单个NAC片材之间的单个氨基酸残基不同，除了胰岛C和D，它们不能被亚域D区分。NAC亚域A，D和E之间的高相似性是显而易见的，虽然NAC亚域B和C具有分歧。一些NAC蛋白在NAC结构域前面包含额外的图案。例如，CLADE C的四个成员共用了一个领先的主题，而另一个领先的主题存在于其他曲线的六个成员中存在于其他片状的六个成员中。

在蛋白质序列的c端，共有24个不同的基序(截断p值1∙e)^-10）已被识别（图7.和附加文件3.表S2)，其中一些是在下一段所述的某些进化枝和亚进化枝所特有的。分支F的c端与其他分支不同。首先，7个分支成员中有6个包含QYGAPF基序(motif 12)，该基序也存在于6个水稻NACs中(代表[4.[此外，这些构件中存在两种不同种类的长C末端延伸部。此外，基于Subclade G1和Sublade G2中的MOTIF SYDDIQ（MOTIF 10）的基于亚偶联G2中的MOTIF SYDDIQ（MOTIF 10）的存在，Subfamiliy G甚至被分成三个亚基。亚克士。类似地，CLADE E的一个子方法包括六个成员，所有六个成员都携带了包含三个不同图案的长C末端扩展：ARS（图案24），ideLs（图案35）和kiwdwnp（图案21）。此外，来自CLADE C的四个不同亚片的11个成员包含的MOTIF TDW（图案13）和厚度（图案30）。后一种基序也存在于拟南芥和水稻NAC的C末端结构域（并对应于[3.])。最后，50个aa motif MAAESNL (motif 9)对A支的4个成员具有特异性，其同源性在83% (ZmNAC73 vs. ZmNAC75)和99% (ZmNAC74 vs. ZmNAC75)之间，似乎是最近重复的结果。

但是，一些图案是在不同林业地区的成员之间共享的。基序36（CFS）存在于克莱德K和J的五个成员中，在一些拟南芥和水稻NAC（代表主题IX / X中[3.])。此外，MOTIF EGSPT（基序40）对于疏枝F和K的成员是常见的。MOTIF QT（基序23）在胰蛋白酶A，B和E之间共用，而MOTIF HH / QHH（MOTIF 34）对CLADE X的成员是常见的，B，C，D和E.HH / QHH基序也存在于四种稻米NAC（代表图案31中[4.])。一些人的X含有含有的主题，其分别在疏枝A和B中发现，其反映了A和B之间的岩石X的系统发育位置。

CLADE G富集在抗辩相关的NAC转录因子中

蛋白质序列比较表明ZMNAC41和ZMNAC100.密切相关;在NAC域中分享整个序列的78％和87％的相似性。因此，这两个转录因子属于CLADE G，如系统发育分析所揭示的（图5.)．检查玉米的基因复制数据[44进一步揭示了两种NACs从染色体的长臂之间的节段重复产生（NAC41)及8号染色体(NAC100)．我们很想知道其他玉米NACs是否与对真菌病原体的防御反应有关C. Graminicola.和美国maydis（见表1与…有关ZMNAC41和ZMNAC100.．系统发育分析显示ZmNAC15和ZMNAC38也是进化支G的成员，而ZMNAC36和ZMNAC97.分别来自所有其他五种蛋白质（图5.)．包括所有功能性地表征的拟南芥和水稻NACs到玉米NACS的系统发育树中，我们发现四个拟南芥的防御联系NAC也聚集成CLADE G（图9.)．据报道，拟南芥ATAF1参与了对细菌病原体和坏死营养真菌的防御反应[28]，而密切相关的Ataf2被证明调节表达PR.基因[27］．描述了ANAC019和ANAC055涉及依赖JA依赖的防御反应的调节[29］．然而，只有众所周知的两种水稻NAC涉及对生物应激的反应，OsNAC6和OsNAC19，被发现在外面的Clade g（图8.)．综上所述，来自玉米、水稻和拟南芥的12个防御相关NACs中，有8个属于G分支，而其他4个属于不同的家族。据我们目前所知，进化支G似乎富含参与应对生物胁迫的转录因子，这表明进化支G的一个祖先NAC可能比来自该家族不同进化支的NAC蛋白更早获得其防御调节的作用。然而，这一解释受限于相关NAC谱系的功能特征。

NAC蛋白在植物防御响应网络中的参与

在这项研究中，我们表征了两种玉米NAC转录因子;ZMNAC41和ZMNAC100.，这是玉米与C. Graminicola.．积累ZMNAC41转录产物先于真菌侵入宿主组织，表明该转录因子作为基础防御反应的一部分被激活。描述了类似的感应模式HVNAC6.从大麦46]接种后不久在表皮细胞中转录Blumeria茎f . sp。HORDEI.（BGH）。沉默HVNAC6.降低渗透性抗性和乳化物的数量，以反应真菌渗透[46］．删除ATAF1在拟南芥中，一个HVNAC6.正轨，受损的非宿主抗性对BGH，其显示出主要与乳头形成Jensen等人相关联。[46］．根据这些观察，ZMNAC41那HVNAC6.和ATAF1假设在基础防御反应中PAMP识别的早期转录事件。

但是，最高的积累ZMNAC41在成功的渗透C. Graminicola.而其他玉米NAC转录因子的转录，ZMNAC100.，完全诱导于感染穿透后阶段。这些数据进一步表明，本研究中描述的两种转录因子也与感染后期诱导的防御反应有关。诱导的防御反应由茉莉酸、水杨酸和乙烯等植物激素控制。我们发现，本文描述的两种玉米NAC转录因子都对茉莉酸有响应ZMNAC100.也被水杨酸增强，表明这两种转录因子确实参与了植物激素触发的防御反应。同样地，它被证明OsNAC5和OsNAC6虽然两种基因的转录本积累到与干旱和寒冷胁迫时相似的水平，但茉莉酸甲酯对水稻的诱导作用很强[22］．编码NAC转录因子的两种拟南芥基因，ANAC019和ANAC055对茉莉酸甲酯也有响应，且依赖于COI1-和atmyc2。此外，研究与ANAC019 / ANAC055.双敲除和过表达谱揭示了其他ja应答基因的表达，如营养储存蛋白1（VSP1） 和LIPOXYGENASE2（LOX2.)，由ANAC019和ANAC055调控[29，提示这两种NAC转录因子是JA反馈回路的一部分。本研究对6个病原菌诱导的玉米NAC转录因子的启动子元件进行分析，发现6个分析基因中有5个在ATG上游500 bp内对ERF、WRKY、TGA和NAC转录因子的响应元件。这表明这5个NACs参与了控制植物防御反应的转录网络。

植物防御中涉及的大多数NAC转录因子在系统源相关

有趣的是,ATAF1、HvNAC6 ANAC055那ZMNAC41和ZMNAC100.以及其他两种病原菌诱导的玉米NAC转录因子ZmNAC15和ZMNAC38属于NAC CLADE G.通过NURUZZAMAN等人获取我们的数据和最近分析水稻NACS。[47和Zhu等[5.]考虑到，近三分之二的辩护诱导的NAC转录因子属于Clade G.有趣的是，这一思工是三个进化古代亚洲之一，含有大多数苔藓和肝脏NAC代表分析[5.］．Physcomitrella patens.，是最古老的含有NAC转录因子的物种，具有氧化烯合酶(AOS，48)、氧化丙烯环化酶(AOC， [49]）和LipoOxyGenase（LOX，[50])。然而，在这个苔藓中尚未发现茉莉酸盐。然而，它看起来令人诱人的推测，NAC转录因子的第一次获得的功能之一可能是因为超过410万年以来的奥蛋白的感知，这是一个时间估计，这是基于朱等人的分析。[5.］．

Zhu等Zhu等综合动态综合系统发育分析来自9种完全序列的不同进化位置。[5.]揭示了21个NAC分支，其中15个包含玉米同源基因。相反，我们的分析显示了12个NAC支。如果我们在分析中考虑到支C可以被分为两个亚支，支G可以被分为三个亚支，那么我们的分析产生了与Zhu等人相同数量的可识别支[5.］．然而，拟南芥和水稻NAC转录因子分析中描述的分支数量[3.那4.那6.那51]偏离研究来研究。这表明所使用的基因组信息的多样性决定了由于可用数量的蛋白质序列而导致NAC曲线的计算。

在这项研究中，我们已经确定了六种玉米NAC转录因子，通过真菌攻击攻击致攻击在Silico.分析显示，启动子元件的存在支持5个玉米NACs参与防御转录网络。对渗透反应强烈的两个成员C. Graminicola.我们对此进行了更详细的研究，ZMNAC41和ZMNAC100.，主要是JA反应。我们对玉米NAC基因进行了系统分类。在系统发育分析的基础上，我们可以发现，大多数尚未被描述的参与高等植物防御网络的NAC转录因子是单系的。

总之，我们的研究增加了一些关于NAC转录因子在拟南芥，稻米和大麦国防反应中的参与的报告。因此，越来越大的NAC转录因子似乎不仅在调节发育过程和非生物应激反应的调节中，而且还涉及生物应激反应的调节。

植物和真菌材料的培养

玉米植物（Zea Mays.l .)简历。在PFD为400 μE∙m的植物室中培养^－2∙^－1在14 h / 10 h光/暗循环中，如和Colletotrichum graminicola.（CES。）WILS。[Glomerella graminicola.（politis）]如[40］．

感染分析

用于感染实验Colletotrichum graminicola.野生型分离物CgM2C. Graminicola.和atmt产生的致病性突变体[40]。孢子的C. Graminicola.用1ml蒸馏水从2周大的OMA板上洗掉并稀释至2×10的最终浓度^4.(低滴度)或2 × 10^6.（高滴度）孢子/ ml。如文中的具体说明，全面扩大了两周的玉米植物的第四片植物，要么喷洒高滴度的孢子悬浮液（2×10^6.含0.02% (v/v) Tween-20或滴入低效价(2 × 10)的孢子悬浮液中^4.孢子/ ml）24小时。喷雾植物在接下来的24小时内保持在100％相对湿度条件下。用0.02％（v / v）在Milli-Q蒸馏水中喷洒模拟处理的叶子，或分别浸入纯蒸馏水中。如酸紫蛋白染色叶片的显微镜评估[40]，真菌增殖在浸接种叶和喷接种叶中相似，但分生孢子滴度在浸接种叶中低100倍。然而，浸接种使处理后的叶片侵染更加均匀。接种后24、36或44 h采集叶片，立即在液氮中冷冻并进行进一步分析。

激素治疗

用1mM茉莉酸（JA），1.3mm的SA类似物2,6-二氯硅酸（INA）和5mM的乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）进行激素处理。将第四片含有两周的玉米植物浸没在蒸馏水中，并在含有指定的激素浓度的15ml 0.2％乙醇中孵育，或者对模拟对照进行添加。在处理0,10或24小时后收集叶，立即在液氮中冷冻并进行RNA提取。

非生物应力分析

玉米植株在其他日子里定期浇水，达到100%的田间生产能力。3周龄的植株经受干旱和高盐胁迫，保留水分或继续用200ml 200mm氯化钠灌溉。模拟处理的植物像以前一样浇水。胁迫处理一周后，将每株植株的叶片全部收获，汇集起来进行RNA提取。

RNA提取

冷冻植物材料用研钵和杵在液氮中研磨成细粉，按照乔姆钦斯基和萨基所描述的方法提取[52］．

QRT-PCR.

用DNA酶I（Fermentas，ST.Leon-ord，德国）处理1μg总RNA，并根据制造商的方案，通过再转换辅助™H负逆转录酶（FERMENS）进行RT反应，并根据制造商的方案进行40μL的总体积。使用2×Brillight IISybr®GreenQPCR主混合物（Stratagene，Waldbronn，德国）和200nm的上游和下游引物的总体积为20μL，用2×Brillight IISybr®GreenQPCR主混合物（Stratagene，Waldbronn，德国）和200nm的QRT-PCRS进行QRT-PCR。在MX3000P™系统上运行反应，并用MXPRO QPCR软件（Stratagene）分析。相对转录量ZMNAC41用正向引物5'-GATGaAGATGAGTGTCCACGAT-3'和反向引物5'-CCAACCATACGTATTTATACG-3'（产品尺寸-149 BP）进行评估，适用于ZMNAC100.使用正向引物5 ' - tctgagagttgctgtgatggaa -3 '和反向引物5 ' - taacccttacaagactaccagcaac -3 '(产品大小- 134 bp)。两种NACs的表达水平均归一化至转录水平ZMHMG用正向引物5 ' -GCTTGGTCTCCATGCTTCATCTAA-3 '和反向引物5 ' -CGGTGAAACTGAACTGAACACAAC-3 '鉴定，得到130 bp的产物。靶基因转录量归一化为ZMHMG并按照相应的图形图例中所示校准以参考样本。

微阵列分析

对于转录谱分析，Voll等人描述的微阵列数据[39雇用了。

系统发育分析

从玉米序列下载http://www.maizeSequence.org.(发布5b.60)及格拉西乌斯草规管资讯服务器(http://www.grassius.org/index.html)．拟南芥从拟南芥信息资源（TAIR）获得序列（http://www.arabidopsis.org/）从Greenphyldb下载水稻序列（http://greenphyl.cirad.fr/v1/cgi-bin/greenphyl.cgi)．

用程序克乐核序列2.0进行蛋白质序列的多次对准[53]，使用geneipro 5.4.3程序中实现的UPGMA方法构建系统发生树[54]引导评估100的重复。筛选蛋白质序列用于与MEME多个EM用于基序闪光（http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi.） [45］．

统计分析

所有统计分析都是用双尾的未配对学生的T检验进行的（P <0.05）进行

阿坝:

脱盐酸

ACC：

1-氨基环丙烷-1-羧酸 - 酸

在：

拟南芥

ATMT：

农杆菌肿瘤术介导的转化

ERF：

乙烯反应因子

等:

乙烯

HPI：

感染后的小时数

成:

治疗后的小时

在:

2,6-二氯硅酸酸

是:

茉莉酸

南京:

NAM ATAF1和CUC2样转录因子

MEME:

多重Em motif elicitation

myc2：

髓细胞症2

操作系统:

栽培稻

公关:

病因相关

QRT-PCR：

定量逆转录聚合酶链反应

RD26：

脱水反应26

SA：

水杨酸

SND：

二次wall-associatedNAC域名

SWN：

赶时髦的人

TA：

小麦

ZM：

玉蜀黍。

这项工作是由德国科学基金会(DFG)在FOR 666优先计划框架下资助的。

隶属关系

1. 生物化学分工，Friedrich-Alexander-University erlangen-Nuremberg，Staudtstsse 5，Erlangen，D-91058，德国

   Anna-Maria Voitsik＆Lars M Voll

2. 农业和营养科学学院，植物病理学和植物保护，马丁 - 路德大学哈勒 - 维滕贝格，贝蒂 - 赫敏曼。3，Halle，Saale，06120，德国

   Steffen Muench & Holger B Deising

相应的作者

对应到lars m voll.．

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

AMV，HBD和LMV已经概念化了该研究。SM和HBD产生，分离和表征本研究中使用的突变体并进行了微阵列分析。AMV，SM，HBD和LMV解释了微阵列结果。AMV已经进行了尚未提及的实验。AMV和LMV解释了后一种结果并写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

开放获取本文在“生物资源”中央有限公司的许可下公布了这是一个开放式访问条款，分配根据创意公约归因许可证的条款（https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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