4个成熟基因的遗传变异影响大豆的光周期不敏感和phya调控的花后反应

背景

短日照作物，如水稻和大豆，要适应高纬度地区，光周期的缺乏或对光周期的低敏感性是必要的。大豆光周期不敏感受两个遗传系统控制，涉及三个重要的成熟基因:E1的两个大豆同源物的抑制因子拟南芥开花位点T（GmFT2a和GmFT5a),E3和E4这是光敏色素A基因。为了阐明大豆光周期不敏感的不同机制，我们评估了4个成熟基因(E1通过E4)及其与花后反应的关系。

结果

我们在最初被认为具有显性的材料中发现了两个新的功能失调等位基因E3等位基因根据已知的DNA标记。的E3轨迹，连同E1和E4，包含多个功能失调的等位基因。共鉴定出15个多位点基因型，并根据等位基因的功能将其划分为6个基因型组。其中，e1-as/e3/E4基因型组需要一个额外的新基因(不同于E1，E3,E4)来调节光周期不敏感。尽管花前光期不敏感，但不同多位点基因型材料对花后光期的响应存在差异。品种携带E3或E4花后性状，如繁殖期和花后茎的生长对光周期敏感。光敏色素a调控生长习性决定基因的表达dt₁的同源词拟南芥顶花在长日照条件下，花诱导植物茎尖分生组织的营养活动持续存在。

结论

大豆光周期不敏感的遗传机制多种多样。至少有三种由不同等位基因组合组成的多位点基因型E1，E3,E4使大豆品种在花前对光周期不敏感，但在花后营养发育和生殖发育中对光周期的响应不同。的巴基因E3和E4是花前和花后光周期响应的主要控制因子。本研究结果提高了我们对大豆花前光期不敏感遗传多样性和花后光期反应机制的认识。

光周期敏感性是作物适应不同纬度环境的重要性状。特别是，短日照(SD)作物，如水稻和大豆，对光周期的缺乏或低敏感性是适应高纬度的必要条件。在大豆(大豆(l))，九个主要基因，E1通过E8和J，到目前为止，有报道称它们可以控制开花和成熟的时间(详见[1])。光周期不敏感至少由两个遗传系统控制，其中三个成熟位点的功能失调等位基因E1，E3,E4——参与其中。一种控制系统归因于双隐性基因型E3和E4［2- - - - - -6]，分别编码光敏色素A (PHYA)蛋白GmPHYA3和GmPHYA2 [7，8]。与GmPHYA1一起，由同源拷贝编码E4，这两种PHYA蛋白在不同光照条件下的花诱导和去黄化反应中具有冗余或互补的功能[7，8]。E3和E4不同红-远红(R:FR)量子比对长日(LD)条件下不同的开花响应[2- - - - - -5，9]。E3控制对高或低R:FR比的光的响应;植物纯合子为隐性e3等位基因可以在高R:FR比荧光灯产生的LD条件下启动开花[2，9]。E4参与对低R:FR比光的响应;植物为纯合子e3等位基因需要一个隐性的e4低R:FR比白炽灯产生的LD下开花的等位基因[3.，4，9]。的e4等位基因本身不能导致对日光和白炽灯照射下的LD不敏感E3遗传背景[4，5]。PHYA蛋白不仅是一种有效的FR传感器，而且在高光子辐照度的R光下充当R光感受器[10，11]，直接或通过与其他光感受器的相互作用参与各种发育过程(参见[12])。的E3和E4因此，基因可能以非加性的方式参与PHYA功能的不同方面，这些功能由单个基因控制巴基因拟南芥。另一个巴大豆基因;GmphyA1，已被建议使用冗余功能E4在FR光下下胚轴去黄化反应和花诱导[7]。由于缺乏引起表型差异的遗传变异，其功能GmphyA1尚未确定。

在目前已报道的主要基因和qtl中E1对大豆开花时间影响最显著的基因[1])。Cober等。[9]利用早熟品种Harosoy及其近等基因系(NILs)E1，E3和E4以揭示它们对不同R:FR比ld的光周期响应。他们发现一个NILE1/e3/e4对R-富集LD条件不敏感，但对低R:FR比为0.9的FR-富集LD条件仍保持敏感性e1-as(最初设计为e1，但以[13) /e3/e4在很宽的R:FR比值范围内失去了灵敏度[9]。这个结果表明E1对开花有明显的抑制作用，特别是在低R:FR比的LD条件下。

位置克隆显示，E1编码一种蛋白质，该蛋白质含有一个推定的二部核定位信号和一个与B3结构域相关的区域，B3结构域是植物转录因子中发现的一个高度保守的结构域[13]。丰富的E1转录本受光周期调控E3和E4与两个大豆同源基因负相关拟南芥开花位点T，GmFT2a和GmFT5a［14]。E1无论基因型如何，在SD条件下表达均被抑制，在LD条件下表达均被诱导E3或E4但对于那些双隐性基因的人来说则不然e3e3e4e4基因型(13]。此外,E1在转基因T2大豆植株中过表达抑制了2的表达GmFT基因，从而显著延缓开花，这表明E1是gmft的直接抑制因子[13]。综上所述，双隐性基因型导致PHYA功能减弱E3和E4至少部分地，基因座可以通过下调基因的表达来减弱或减弱对光周期的敏感性E1。

另一个控制大豆光周期不敏感的系统是通过参与功能失调的等位基因来发挥作用的E1轨迹本身。日本地方品种“Sakamotowase”的光周期不敏感被认为是由与PHYA功能障碍不同的遗传机制控制的，因为这种地方品种在PHYA上有一个显性功能等位基因E4轨迹(6]。利用基因型为。的光周期敏感型哈罗索NIL杂交组合进行数量性状位点定位e1-as/e3/E4结果表明，Sakamotowase的光周期不敏感主要由一个等位基因或一个与该等位基因紧密相连的基因控制E1尽管在连锁组L (Glyma19)中检测到一个较小的QTL [15]。分析E1Sakamotowase的序列显示它含有一个功能失调的等位基因，e1-fs，由于单个碱基缺失导致过早终止密码子产生功能缺失的截断蛋白[13]。相比之下，隐性等位基因e1-as在假定的核定位信号中具有非同义替换，导致E1蛋白在细胞核中的定位特异性降低，从而降低E1抑制基因表达的能力GmFT基因(13]。这些发现有力地表明，Sakamotowase光周期不敏感的分子基础是，至少在一定程度上，由于基因上的一个功能失调的等位基因导致E1功能的完全缺乏E1轨迹本身。功能失调等位基因e1-fs因此，可能提供单独或与其他未知基因一起，在存在下控制光周期不敏感的另一种机制E4在大豆。

大豆的光周期响应不仅涉及花前生长(如开花时间)，还涉及花后营养和生殖生长(如荚果灌浆期、顶生花序发育和叶片衰老);光照条件增加了光周期敏感品种的生殖期，延缓了叶片衰老和种子成熟[j]。16- - - - - -18]。Han等。[16研究表明，一个光周期敏感品种的花后生长受到R光的影响，而在黑暗时期受到FR光的影响，这表明光敏色素控制了花后生长的光周期响应。然而，对花后光周期敏感性的遗传和生理基础的认识还很不全面。

大豆成熟基因不仅控制开花时间，而且还控制成熟时间。19- - - - - -21]。在不同的连锁群中，已经发现了几个控制生殖期特征的qtl，如成熟时间和荚果填充时间[qh]22- - - - - -26]。然而，只有少数几个qtl被确定为花后光周期响应。Cheng等。[25在LD条件下发现了两个控制花期后持续时间的qtl。这两个qtl，似乎对应于E3和E8［27]基因，也参与控制开花时间[25]。

为了研究大豆光周期不敏感的多种机制，并寻找与此过程有关的新的遗传因素，我们首先使用等位基因特异性DNA标记对4个成熟基因(E1通过E4)，用于从不同地理区域引进的光周期不敏感品种和选种系。我们还测试了这些不同基因型与花前和花后光周期反应的关系。本文报道了大豆通过多种机制独立、重复地获得光周期不敏感性状。此外,E3和E4，连同…E1，不仅在大豆花的形成过程中起着重要的作用，而且在花后的光周期反应中也起着重要的作用，如成熟和茎终止。

光周期不敏感对开花的影响

在我们之前的研究中[6，15]，我们根据开花时间的差异(R1期[28])在人工诱导的LD和自然日长(ND)条件之间。哈罗豆是一种光敏早熟不确定品种，其成熟基因型为e1-as/e2/E3/E4，和显性dt₁基因(5]。在2年的研究期间，该品种在日本札幌(43º06´N, 141º35´E)的ND条件下，平均播后57天开花，但直到人工诱导条件结束(62 ~ 65 DAS)时才开花。类似地，Harosoy NILs表示e3(H -e3)或e4(H -e4)直到人工诱导的LD条件结束时才形成任何花蕾，并且在ND条件下的开花时间略早于Harosoy;H-的平均花期为46 DASe3H-为53 DASe4。相比之下，Harosoy对两者都是NILe3和e4(H -e3/e4)在ND和LD下均在40 DAS开花，该品系产生的荚果长度为2厘米或更长(R4至R5期[28])在人工诱导LD状态结束时。本研究中使用的53个光周期不敏感材料在LD条件下均在ND条件下开花后5天内开花。

利用等位基因特异性DNA标记进行基因型分类

四种成熟基因的分子基础(E1通过E4)已确定[7，8，13，29]。为了确定这4个位点上的等位基因结构，我们使用先前报道的等位基因特异性DNA标记对53个光周期不敏感材料中的4个基因进行了基因分型[7，13，29- - - - - -31]。

四个等位基因已经在E1轨迹(13]。这些等位基因包括两个无效等位基因:一个缺乏一个容纳整个基因的130 kb区域(e1-nl)，而另一种则有单碱基缺失，导致移码突变，产生过早的终止密码子(e1-fs)。传统的隐性等位基因e1(此处指定为e1-as根据[13])不同于显性等位基因(E1)通过假定的核定位信号中的单个氨基酸取代;这种取代消除了蛋白质的核定位。53个国家中有8个国家(7个日本和1个中国)拥有E1等位基因，33个e1-as， 11人e1-nl;只有日本本土的“坂本濑”才有e1-fs等位基因(附加文件1)。

两个等位基因E2基因，大豆同源物拟南芥GIGANTEA（胃肠道)，已经鉴定出一个功能性显性等位基因(E2)和一个隐性空等位基因(e2) [29]。我们测试的所有53个条目都有e2等位基因(附加文件1)。

2个和6个等位基因先前在E3和E4基因座，包括一个(e3)及五个(e4-SORE-1，e4-kam，e4-oto，e4-tsu,e4-kes)的空等位基因E3和E4分别[7，8，31]。在53个入选者中，有20个是E3等位基因，其余33份均有e3等位基因。15人加入了E4，剩下的38份材料有四种功能失调等位基因之一:e4-SORE1(20),e4-kam(2),e4-oto(1)e4-kes(15)(附加文件1)。只有22份材料为双隐性纯合子E3和E4而27份材料具有两个显性等位基因中的一个，4份材料具有两个显性等位基因中的一个。

基因序列E1，E3,E4基因

利用等位基因特异性标记对这4个成熟基因进行基因分型，结果表明，尽管它们对光周期不敏感，但31个材料在光周期的一个或两个位点上都有显性等位基因E3和E4位点。这一结果表明，一种新的等位基因或基因可能参与了这一性状的控制。然后我们对至少有一个显性基因的遗传序列进行排序E1，E3,或E4检查这些等位基因是否真正起作用。的编码区未检测到序列变异E1在八项加入中E1/e3/e4基因型;所有的序列都与已发表的显性序列相同E1等位基因(13]。序列分析E4同样，基因也没有显示出与已公布序列的偏差[7]。然而，我们发现了两个新的功能失调等位基因E3在最初被评为具有e1/E3/E4或e1/E3/e4基因型(图1一个和1B).这些新等位基因中的一个是无义突变，其中第3外显子第一个密码子的腺嘌呤的3139位从C到T的单核苷酸替换产生了一个停止密码子，取代了编码谷氨酰胺的密码子。另一个新的等位基因在1号外显子上有一个过早的终止密码子，这是由于T在1号外显子1275位插入而引起的移帧而产生的。我们指定了这些功能失调的等位基因e3-ns和e3-fs，并重新命名为常规e3等位基因的e3-tr(截断)，因为它缺少基因的3 '区域，包括外显子4 [8]。

然后，我们开发了等位基因特异性裂解扩增多态性序列(CAPS)或衍生的CAPS (dCAPS)标记来可靠地识别这些功能失调的等位基因(图2)1C)。e3-fs经处理后可将其与其他等位基因区分开来啤酒它将突变位点两侧758 bp或759 bp的扩增产物切割成552 bp和206 bp的片段E3，e3-ns,e3-tr而不是等位基因e3-fs(图1C)。e3-ns经处理后可将其与其他等位基因区分开来Mfe1，唯一地消化163 bp扩增e3-ns产物为140 bp和23 bp的片段。大多数的加入，最初被认为包含了E3有功能失调的等位基因，从而产生截断的GmPHYA3蛋白。

将53份光周期不敏感材料分为15个多位点基因型，并将等位基因按功能分组，将其分为6个基因型群(e1/e3/e4，e1/E3/e4，e1/e3/E4，e1-as/e3/e4，e1-as/e3/E4,E1/e3/e4),e1，e3,e4参见相应位点的功能缺失等位基因(表1)1)。其中，两个基因的功能失调等位基因的组合E3和E453份材料中有36份为显性基因型。在17个加入的国家中E3或E4等位基因，10个e1-fs或e1-nl在E1轨迹。其余7份材料等位基因组合为e1-as/e3/E4与H-相同的基因型e3，它对富含fr的光源所产生的长时间白昼很敏感[9，15]，例如我们在当前研究中使用的白炽灯。

总的来说，所有53个光周期不敏感的材料在两个位点上都有一个隐性等位基因E3或E4轨迹。当这些基因座中的一个有显性等位基因时E1轨迹总是会丧失功能e1-fs或e1-问等位基因或半异形e1-作为等位基因。

花后光期敏感性与E3和E4

我们测试的53份材料在开花时间方面被认为是光周期不敏感的，因为ND和LD条件下开花日期的差异很小(即5天或更短)。然而，这些品种在开花后的营养和生殖生长特征(如繁殖期和花后茎的生长)上存在显著差异(图2)2和3.)。双向方差分析，其中以年份相互作用的联合均方作为误差均方，显示出高度显著的(P< 0.001)，两种性状在不同品种、日长条件及其相互作用之间存在差异。

成熟日期(阶段R8 [28])在测试的53个条目中，有36个在LD期间延迟超过5天。这种延迟伴随着豆荚发育缓慢或花期延长(或两者兼而有之)，这是由于在LD期间主茎和分枝的顶端分生组织持续的营养活动。ND和LD条件下生殖期的差异，以从R1到R8的天数来评估，从-2到29天不等，并随着材料的多位点基因型而变化(图2)2;用蓝条和小红条表示[在LD下增加]或开条表示[在LD下减少])。的加入e3/e4基因型菌株的成熟延迟最长为12 d，平均为4.2 d。相比之下，17个品种中有14个品种的生育期在LD期间比ND延长了12天以上E3或E4等位基因，平均为19.1天。基因型组的生育期差异在种群和年平均上分别为21.8、14.3和23.7天e1（e1-nl）/E3/e4，e1（e1-nl/e1-fs）/e3/E4,e1-as/e3/E4，分别(图4)。这个结果表明E3和E4不仅参与了开花时间的光周期控制，而且参与了荚果成熟时间的光周期控制。

日照长度也影响大豆开花后茎的终止(图2)3.)。大豆的茎终止已知至少由两个基因控制，dt₁和Dt2，其中前者的影响更大[32]。的dt₁Gene是…的同源词拟南芥顶花（TFL1)，GmTFL1b［33，34]。四个功能失调等位基因(dt1-ab，dt1-bb，dt1-tb,dt1-ta)已在该地点确定;所有这些突变等位基因产生含有单氨基酸取代的蛋白质[34]。利用等位基因特异性标记进行基因分型发现，53份材料中有41份具有该基因dt₁等位基因，12个有dt1-bb或dt1-tb等位基因(附加文件1)。

确定型品种通常在开花后不久终止茎的生长，而不确定型品种则继续茎的生长，直到茎尖分生组织(SAM)的营养生长结束[33]。不出所料，我们的12个确定的条目dt1-bb或dt1-tb在ND和LD期间，等位基因在主茎上产生的节点数几乎相同(图2)3.;用粉色条和小红色条或开放条表示)。相比之下，41不确定dt₁嫁接期间的植株比嫁接期间产生更多的节点，且嫁接与嫁接之间主茎上节点数的差异随多位点基因型的不同而不同(图2)3.;用蓝条配小红条或开条表示)。不确定植株间的差异小于2.4(平均0.8)个节点e3/e4基因型和独立于E1基因型(图3.);即在ND和LD条件下，茎在开花后不久就终止生长。相比之下，加入了E4等位基因在LD期间比ND期间倾向于产生更多的节点，这种反应似乎依赖于基因型(e1或e1-as)。E1轨迹(图3.和4)。具有e1（e1-nl)等位基因e1/e3/E4)茎的终止生长在ND和LD之间相似;ND与LD在不同品种和年份间的节点数差异平均为1.5个节点(图2)4)。相比之下，拥有e1-as等位基因(e1-as/e3/E4)在LD期间产生的节点至少比ND期间多3.4个(平均5.7个)。因此，大豆花后光期生长，以成熟和茎终止来评估，在不同的供试材料和成熟基因型之间存在差异。

花后茎断和荚果发育的控制E3和E4

Han等。[16研究表明，一个光周期敏感品种的花后生长受到光反应的影响，这种光反应可以由暴露在R光下引起，并在黑暗时期被随后的FR光照射逆转。这表明光敏色素参与了大豆花后发育的光周期响应。为了证实在田间试验中观察到的不同成熟基因型花后生长对光周期的不同响应，我们分析了豆荚发育、茎终止和基因型的表达模式dt₁花椰菜(E3/E4/dt₁)和它的nile3，e4,dt₁。我们按照方法部分的描述，在这些品系中诱导开花;在非诱导诱导的LD条件下，SD处理至出苗后12天(DAE)足以启动和维持哈罗索的开花[14]。大豆成熟基因;E3和E4，详细描述了不同R:FR比对长日的反应[5，9]。因此，我们使用两种不同光源的LD条件，富r光和富fr光，来区分E3和E4。Harosoy及其NILs为e3，e4,dt₁（dt1-bb)几乎同时开花(转化为LD条件后11 ~ 13天;数字5C, D)在两种光照条件下。哈罗索的茎生长终止于第6 ~ 8节dt₁(H -dt₁);不确定线比H-产生更多的节点dt₁到试验结束(开花后30天)，不同的成熟基因型产生的节数不同(图2)5A)，与H-相比dt₁， Harosoy和H-e4富r光条件下平均多产7.5 ~ 6.4个节点，富fr光条件下平均多产5.9 ~ 6.5个节点。H -e3/e4和H -e3比Harosoy和H-提早终止茎的生长e4在这两种情况下。此外，茎生长终止早于H-e3/e4比H-e3富fr光条件下，H-e3/e4产生的节点数几乎与H-相同dt₁。

豆荚发育的模式与茎生长的结果略有不同(图2)5B).在r光富集条件下，Harosoy, H-e4， H——dt₁直到开花后30天才产生超过3.0厘米的豆荚，尽管它们几乎与H-e3和H -e3/e4。相反，H-e3和H -e3/e4在富r光条件下，平均荚果长度为5.3 cm和3.9 cm。富fr光条件下，H-e3和H -e3/e4分别产生4.1个和4.5个豆荚，而哈罗索只产生少量豆荚(0.5个)和H-e4没有豆荚;H -dt₁平均产生2.6个豆荚(图2)5B). H-的荚果发育dt₁这可能表明富r光条件比富r光条件对开花后荚果发育的控制作用更大。

dt₁在确定的大豆植株中，这种表达随着花的诱导而迅速降低，而在不确定的植株中，这种表达在开花开始后会维持一段时间[33]。这里我们发现的表达式dt₁无论基因型如何，在SD条件下生长的12日龄植株茎尖的R和fr含量都很低E3和E4位点(图5C和5D;参见0天数据)。此外，H-dt₁在生长后期仍然很低。相反，不定线(除了H-e3/e4的迅速增长dt₁转化为LD(19日龄植株)后7天的表达量;图中7天5C和5D).此后，Harosoy和H-e4维护dt₁在r -light富集条件下转化为LD后21天，表达量相对较高(图2)5C),但dt₁富fr光条件下，14天后表达量迅速下降(图2)5H - D)e3与Harosoy和H- ?相似，但表达水平略低e4富fr光条件下(图25D)dt₁在r -light富集条件下，转录本在转化为LD后14天迅速减少(图2)5C).与Harosoy相反，H-e3， H——e4，dt₁低表达(与H-相似)dt₁) in H-e3/e4贯穿所有生长阶段。因此，这些结果表明dt₁表情是由两个人控制的巴的基因,E3和E4，对于控制花后生长，虽然有直接的因果关系dt₁表达和两者巴基因应该在进一步的研究中得到解决。这个概念与phya调节的信号转导是一致的dt₁表达，这是意料之中的dt₁与SORLIP1序列相同的启动子区域(序列在光诱导启动子1中被过度表达)独联体元(33])。的独联体元素序列dt₁是最常见的独联体-元素在SORLIPs在拟南芥受FR光诱导或抑制的基因[35]。

大豆的光周期不敏感性主要由三个主要遗传群决定

在本研究中，我们利用等位基因特异性DNA标记对53个光周期不敏感大豆品种的4个成熟基因和1个生长习惯基因进行了基因型评估，并将每个隐性等位基因与其他等位基因区分开来。这些材料是从各个高纬度地理区域引进的。我们的第一个目标是确定四个主要成熟基因座(E1通过E4)和光周期灵敏度。我们的第二个目标是揭示在这些不同的遗传资源中控制光周期不敏感的任何新的遗传因素。根据光周期不敏感品种和选育品系各位点等位基因的功能，将其分为3个基因型组:光周期不敏感品种和选育品系e3/e4集团;包含e1（e1-问或e1-fs)或E3或E4;和e1-as/e3/E4组。

测试的53份光周期不敏感材料均存在该功能失能等位基因E2轨迹。的E2基因是大豆的同源物拟南芥GIGANTEA（胃肠道) [29]。在拟南芥，胃肠道调节英国《金融时报》通过多种机制表达:1)GI与FLAVIN-BINDING、KELCH REPEAT、F BOX蛋白1结合，导致一个关键的降解有限公司抑制因子(循环DOF因子1)，表达上调君士坦斯（有限公司)，以及随后的激活英国《金融时报》表达式[36，37];2) GI调控miRNA172的表达水平，miRNA172的靶标编码英国《金融时报》，如TARGET OF EAT 1和SCHLAFMUTZE [38，39];3) GI调节了各种基因的稳定性或启动子可及性英国《金融时报》阻遏蛋白(40]，包括短暂的植物期[41]、TEMPRANILLO (TEM) 1和TEM2 [42因此，基因的功能失调等位基因E2在这些大豆材料中，光周期不敏感可能需要基因座。

三个基因型组中的一个由具有双隐性基因型(e3/e4)。E3和E4位点。这些品种约占受测大豆光周期不敏感品种的70%(53个品种中的36个)，这表明PHYA功能障碍是大豆光周期不敏感的最常见机制。

另一个基因型组由功能失调的成员组成e1等位基因(e1-nl或e1-fs)与任何一个显性词结合使用E3或E4等位基因。这组含有Sakamotowase，它有e1-fs产生无功能E1蛋白的等位基因，如通过瞬时表达试验所揭示的[13]。此外，该品系光周期不敏感的主要QTL与E1轨迹(15]。这些观察结果表明，Sakamotowase的光周期不敏感可归因于E1功能的完全缺乏。另一个功能失调的等位基因，e1-nl，它缺乏完整的E1基因(13]，在我们测试的光周期不敏感的条目中出现的频率相当高(53行中有11行)。功能失调的等位基因e1-fs和e1-nl可能在消除或削弱由E3或E4等位基因。需要进一步的研究来确定这些功能失调的等位基因是否E1基因座可以单独导致光周期不敏感的存在E3或E4等位基因。

其余基因型组为等位基因组合为e1-as/e3/E4。Harosoy NIL表示e3也有相同的等位基因组合。然而，该NIL对使用富fr光源(就像我们在当前研究中使用白炽灯产生的光源)产生的LD条件很敏感，尽管它对富r LD条件没有反应[4- - - - - -6，9]。因此，等位基因的组合e1-as/e3/E4不足以产生光周期不敏感。可以想象，一个新的基因-不同于功能失调的等位基因E1，E3,E4基因座-可能参与了富fr LD条件下该基因型材料光周期不敏感的调控。GmphyA1的同源物E4，是这种光周期不敏感控制器的可能候选者:GmphyA1被建议以一种冗余的方式发挥作用E4富fr LD条件下下胚轴去黄化反应和开花的等位基因[j]7，9]。功能失调的等位基因E4基因座对植物形态发生有不利影响，例如在FR光下受损的去黄化反应[7]和在LD条件下产生较长的节间E4等位基因(43使植物容易倒伏。因此，支配词的使用E4等位基因对光周期不敏感品种的抗倒伏能力有一定的贡献，但也可能是其他因素造成的。因此，应从代表不同遗传机制的等位基因中选择合适的等位基因组合，使大豆品种适应目标环境条件。

多个功能失调的等位基因都被检测到E1，E3,E4位点(13，31]，包括两个新的等位基因E3轨迹[本研究]。我们之前的研究表明，基因中有5个功能缺失等位基因E4基因座最近独立地起源于东亚不同的大豆地方品种[31，44]。这些结果表明，大豆的光周期不敏感是通过独立产生的等位基因的多个组合而产生的E1，E3,E4位点。

两个巴的基因,E3和E4，控制大豆花后反应

本研究的另一个发现是，开花后的营养和生殖生长特征，如成熟和茎终止，受到由基因调控的光周期响应的影响E3和E4位点。因此，我们的发现与先前关于光周期感知与开花后反应之间关系的观察结果非常一致[16- - - - - -18]以及光敏色素在花后反应中的作用[16]。结果表明，不同光周期不敏感多位点基因型的大豆材料对花后光周期的响应不同。尽管它们的光周期对开花时间不敏感，但有E3或E4LD条件下等位基因的成熟时间比ND条件下至少晚10天(图2)2和4)。此外，在不确定的等位基因组合中，LD期间SAM的营养活性持续到生育后期e1/E3或e1-作为/E4产生比ND条件下生长的更多的节点(图2)3.和4)。这些行为与中国的加入形成鲜明对比e3/e4组，其中，独立于等位基因的类型或基因型在E1在这两种条件下，相对于ND, LD的成熟没有明显的延迟，茎的生长也同样终止(图2)4)。

我们观察到的不同成熟基因型花后营养和生殖生长的不同光周期响应通过分析哈罗索及其NILs进一步得到证实e3，e4,dt₁。用SD诱导12个DAE的NILs植株在随后的LD条件下表现出不同的茎和荚果生长。特别是，nilE3等位基因保留了花诱导植物SAM的营养活性，在LD条件下抑制开花后的荚果发育e3在两种光照条件下，等位基因在开花后不久终止茎的生长，产生较少的节点和发育的豆荚5一个和5B).我们还发现了轻微的影响e4只有在遗传背景下e3在光照方案下，在16小时的白天时段之后，只使用富含fr的灯提供4小时的额外白天(图2)5A).我们目前的研究结果强烈表明，大豆花后的光周期响应是由E3和E4基因。

大豆花前和花后光周期响应的基因调控网络

我们将目前的研究结果总结为一个包含三个成熟基因(E1，E3,E4)，一个决定性的习惯基因(dt₁)，二GmFTs (GmFT2a和GmFT5a)，在LD条件下调控大豆花前和花后的光周期响应(图2)6)。在对光周期敏感的植物中E1或e1-作为等位基因和显性等位基因E3或E4轨迹(或两者)(图6A)，我们认为富fr LD不会诱导开花[3.- - - - - -5，9因为……E1和e1-作为等位基因抑制的基因表达GmFT2a和GmFT5a［13]。当这些植物暴露于短时间的SD时，开花是诱导的，即使在转移到非诱导LD后也会持续开花，但由于一个未知因素(Y)的影响，随后的种子成熟被推迟，SAM的营养活性被保留以产生更多的节点dt₁表达式。因子Y和dt₁是由PHYA控制的E3或E4轨迹(图6一个)。

我们认为，在光周期不敏感的植物开花e3/e4组，在E3和E4基因座，是通过上调诱导的GmFT在没有…的情况下E1表达式[13]。开花的e3/e4随后是正常的种子成熟和茎终止，可能是由于Y和的下调dt₁，分别(图6B)e3和e4LD与ND的比较(图1)2和4)可归因于存在的副本巴不同位点的基因(GmphyA1) [7]或其他感光细胞。

相反，在光周期不敏感的植物中，有一个功能巴基因要么E3或E4因此，我们认为，在LD条件下，开花可能是由位于该位点的功能缺失等位基因诱导的E1轨迹e1/e3/E4- - - - - -e1/E3/e4组(图6C)或未知的遗传因素(X)e1-作为/e3/E4组(图6D)与…相反e3/e4在LD下，由于一个功能调控，这两组的种子成熟同样延迟巴基因(E3或E4)。然而，这两组之间的茎生长在LD下不同:茎生长终止较早e1/e3/E4- - - - - -e1/E3/e4组比e1-作为/e3/E4集团(数据3.和4)。在e1-作为/e3/E4植物,PHYA-mediateddt₁在LD下的表达可以保持SAM上的营养活性，从而产生更多的节点，这是哈罗索花后的反应及其NILs所表明的e3或e4在LD中(图5)。

这些模型提出了两个关于大豆开花后生长的问题。首先，如何E1开花后基因影响茎的生长?除了对开花和成熟的影响外，它的作用E1形态发生中的基因尚未确定，尽管它确实影响各种形态性状、产量和其他性状，如耐低温性[45，46]。的E1和e1-作为等位基因抑制的表达GmFT2a和GmFT5a，这些都在我们的控制之下巴基因(13]，而丧失功能的等位基因e1-fs和e1-问不。在拟南芥， FT蛋白结合开花基因座D(开花基因座D, FD)，促进开花基因座D的表达APETALA1和多叶的，花分生组织基因[47- - - - - -49];在[50，这反过来又抑制了TFL1转录并终止茎的生长[51，52]。因此，等位基因的不同作用E1基因座对花后茎生长的影响可能不是直接的，而是通过抑制的间接影响GmFT表达式。

另一个问题是开花本身是否是大豆种子发育的直接触发因素。我们在本研究中获得的结果表明，phya介导的光周期反应可能通过一个尚不清楚的因素直接或间接地调节种子成熟:只有当两个巴在LD下开花后的种子成熟是否没有任何明显的延迟6)。因此，进一步的研究应该探索促进种子发育的关键因素(如我们模型中的Y)。比较sd生长植物和恢复到营养模式的植物在种子发育早期的表达谱，有助于我们进一步了解大豆种子发育的分子基础。

本研究揭示了大豆光周期不敏感的多种遗传机制。至少有三种多位点基因型，包括不同的等位基因组合E1，E3,E4基因座可以赋予开花前的光期不敏感性。这些基因型在花后生殖发育过程中对光周期的响应不同，表明光周期参与了植物的生长发育巴基因E3和E4。我们的研究结果进一步表明开花本身不一定是种子发育的直接触发因素。E1，E3,E4控制花前和花后发育的光周期响应，直接影响大豆最终种子产量。

植物材料

我们用53个光周期不敏感的大豆(大豆)在当前研究(附加文件1)。其中包括日本北部9个(北海道6个，东北地区3个)，中国东北29个，俄罗斯远东8个，乌克兰4个，波兰3个。Harosoy (PI548573)及其NILs用于e3(PI547716;H -e3)，e4(PI591435;H -e4),这两个e3和e4(PI546043;H -e3/e4),dt₁(PI547687;H -dt₁)作为对照来描述花前和花后的光周期不敏感。

光周期灵敏度的评价

光周期敏感性是根据第一朵花开放日期(R1期)的差异来评估的。27])在人工诱导的LD条件下和ND条件下生长的植株之间存在差异。实验于2011年和2012年在日本札幌北海道大学(43°06′n, 141°35′e)室外照明的试验田进行。2011年6月1日和2012年5月29日，分别在纸盆(2号，Nippon Tensai toougyo, Obihiro, Japan)中播种，并将10 d龄的幼苗移栽到LD和ND田。LD条件是使用500-W白炽灯，每隔4 m放置在离土壤表面2 m的地方。0300 ~ 0600和1830 ~ 2300分别开灯，直到处理结束(8月2日)。在白炽灯照射下，R:FR(660:730)量子比为0.72，冠层表面平均光合光子通量为1 μmol光子秒¹米²，使用量子传感器(型号LI-1800C, Li-Cor, Lincoln, NE)在夜间测量。每隔一天检查一次植物，以确定R1和R8阶段[27]。主茎上的节数按R8计数。

利用等位基因特异性DNA标记进行基因分型

我们对四个成熟基因(E1通过E4)和生长习惯基因(dt₁)，使用等位基因特异性DNA标记E1［13]，E2［29]，E3［30.]，E4［7，31),而dt₁（dt1-bb) [33]。我们使用了可用的序列信息[34来开发DNA标记dt1-ab和dt1-tb;我们没有开发出DNA标记dt1-ta因为它的稀有性[34]。引物序列，DNA标记类型，使用的限制性内切酶，以及每个标记的合成片段大小显示在附加文件中2。按照前面的描述从三叶草叶片中提取总基因组DNA [53]。每个PCR反应用30 ng基因组DNA作为模板ExTaq聚合酶(TaKaRa，大津，日本);扩增条件为94°C 30秒，56 ~ 60°C(取决于使用的引物)30秒，72°C 30 ~ 90秒。PCR产物或根据需要用适当的限制性内切酶酶切的产物在1% ~ 3% (w/v)琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙啶染色，并在紫外线下观察。

序列分析

具有至少一个显性等位基因的E1，E3,或E4测序。一个525bp的区域E1， 4个571 ~ 2350 bp的区域分别覆盖了基因的4个外显子E32384 bp和3506 bp的两个重叠片段覆盖了整个片段GmphyA2编码序列E4使用KOD FX (Toyobo Life Science, Osaka, Japan)从基因组DNA中扩增。扩增片段使用ExoSAP-IT酶试剂盒(GE Life Sciences Japan, Tokyo, Japan)纯化。纯化的PCR产物作为模板，使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒和ABI PRISM 3100 Avant遗传分析仪(Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan)根据制造商的说明进行正向和反向测序反应。

新型DNA标记的研究进展E3丧失等位基因

我们使用突变位点两侧的序列来开发等位基因特异性的CAPS和dCAPS DNA标记。每个突变的靶区通过使用ExTaq每个突变都有特异引物的聚合酶。PCR产物用合适的限制性内切酶酶切(附加文件)2)，用1%或2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙啶染色，在紫外光下观察。

生长习性决定基因的表达分析dt₁

的时程相关表达式dt₁（GmTFL1b)基因拟南芥顶花（TFL1)的同源性，分析了哈罗索的茎尖及其NILsdt₁，e3,e4。植物生长在恒温25℃、平均光子通量300 μmol光子m的生长室内²年代¹，由荧光灯和白炽灯组合提供的R:FR比为1.2。白天长度设定为12小时至12点，之后为20小时。使用不同的光源进行了两个独立的实验。具体而言，在实验1中，在黎明后使用R:FR为1.2的荧光灯和白炽灯组合作为光源照明16小时，然后再使用相同的光源照明4小时;实验二是在黎明后同时使用R:FR比为1.2的荧光灯和白炽灯16小时，然后再使用白炽灯照明4小时。在两个实验中，从12 DAE开始，每7天从4株单株上采集4个授时子时间的茎尖。样品立即在液态氮中冷冻₂-80°C保存。

转录水平dt₁采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定。将1 μL cDNA合成反应、5 μL 1.2 μM引物预混料、10 μL SYBR预混料混合制备qRT-PCR混合物ExTaqPerfect Real Time (TaKaRa, Otsu, Japan)和水，最终体积为20 μL。使用CFX96实时系统(BIO-RAD Laboratories Japan, Tokyo, Japan)进行分析。引物分别为5′- aggcaacaacagatgccacat -3′和5′- ggcaaaaccagcagccactt -3′GmTFL1b（dt₁)和5 ' -GAGAAGAGTATCCGGATAGG-3 '和5 ' -GAGCTTGAGTGTTCGGAAAC-3 'β微管蛋白。PCR循环条件为95°C 3 min, 95°C 10秒，58°C 20秒，72°C 20秒，78°C 2秒，循环40次。78°C孵育前后荧光定量，监测引物二聚体的形成。没有逆转录酶的反应混合物作为对照，以确认RNA样品中没有基因组DNA污染物导致扩增。在所有的PCR实验中，通过qRT-PCR的熔融曲线分析和PCR产物的凝胶电泳都证实了单个DNA物种的扩增。细胞的mRNA水平GmTFL1b归一化为β微管蛋白。

加入数据

本文的序列数据可以在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中找到，序列号为AB766210e3-fs GmphyA3等位基因)和AB766211(基因的外显子3)e3-ns GmphyA3等位基因)。

QTL:

数量性状位点

零:

Near-isogenic线

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

存在:

实时定量PCR

帽子:

裂解扩增多态性序列

dCAPS:

派生的帽

巴:

光敏色素的

英国《金融时报》:

开花地点

GI:

GIGANTEA

有限公司:

君士坦斯

TFL1:

终端FLOWER1

山姆:

茎尖分生组织

DAS:

播种后几天。

作者非常感谢dr。AY Ala(俄罗斯全俄大豆研究所)、G Konieczny(波兰波兹南农业大学)、VI Sichkar(乌克兰植物育种和遗传研究所)、VG Mikhailov和O Hrabovsky(乌克兰农业科学院农业研究所)和ER Cober(加拿大农业和农业食品部)为我们提供了大豆品种和试验品系的种子。本工作部分得到了日本文部科学省(23380001)给J Abe的科学研究资助;国家科学基金(批准号:30971813、31071445)和中国科学院“百人计划”(批准号:30971813、31071445)资助。KZCX2-YW-BR-11);国家自然科学基金资助项目(批准号:no. 81111@qq.com);(31071445)和中国科学院“百人计划”资助项目。

从属关系

1. 北海道大学农业研究所，日本札幌060-8589

   许美兰，金泽明，山田哲也，安部俊

2. 国立农业生物科学研究所，筑波，茨城市，305-8602，日本

   Yasutaka Tsubokura, Satoshi Watanabe & Kyuya Harada

3. 中国科学院东北地理与农业生态研究所，黑龙江哈尔滨150040

   徐泽恒，刘宝辉，孔繁江，夏正军

相应的作者

对应到6月安。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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