LR67.和LR34抗锈病基因有很多共同之处——它们赋予小麦对多种病原体的广谱抗性

背景

成人植物锈病基因LR67.和LR34对小麦的多种真菌病原体进行竞争非特异性抗性。诱导的，对两个基因的表征敏感突变体。

结果

鉴定了三类LR34突变体，其是部分易感，完全易感或超易感的条纹锈蚀和叶锈。突变变化对预测的LR34蛋白的可能影响与响应生锈感染的差异相关。回收了四种独立的LR67突变体，其易受条纹锈，叶锈和茎生锈病原体，包括一种可能的超易感LR67突变体。

结论

LR34突变体的详细研究显示，对多种病原体的抗性反应的微妙变化与预测蛋白质中的突变变化相关。恢复独立的LR67突变体表明为此LR34，一个单独的基因LR67.位点可能赋予对多种病原体的抗性。Lr67突变体的感染表型与Lr34突变体的感染表型相似。

小麦中已知许多防锈基因，但只有少数提供耐用，种族对多种病原体的耐抗性[1］．这些基因中应用最广泛、特征最好的，Lr34,赋予耐用，成人植物抵抗（APR）造成的叶锈PUCCINIA TRITICINA，条纹锈病造成的PUCCINIA Striformis.f.sp。tritici和粉状霉菌造成的Blumeria Graminis.[2-5.］．Lr34对每种病原体的抗性是部分的，而第二种表型，即叶尖坏死，包括旗叶的叶尖坏死，也是该基因的特征[6.］．最近，LR67.有哪些特征与之相似LR34因为它也导致叶尖坏死，并提供部分、广谱的成体植物对叶锈病和条锈病的抗性[7.那8.］．基于这种表型相似性LR67.预计还能提供持久的抗锈性，尽管这仍然是不确定的，因为该基因还没有被部署在长期的时间和不同的种质和环境。

当LR34和LR67.从地塑料转移到叶子锈蚀小麦品种“撒切尔”中，叶锈的回流线也获得了抗杆锈病（P. Graminis.f.sp。tritici）在幼苗和成年植物阶段9.那10］．幼苗试验表明，与种族非特异性反应相比，这种茎干抗性可能是特异性的LR34和LR67.到叶锈病和条锈病。进一步的研究表明，非连锁基因座与LR34使撒切尔及其衍生物能够表达茎锈病抗性[11-14］．

在这项研究中，小麦线撒切尔用作常见的遗传背景，用于鉴定和比较突变表型LR34和LR67.基因分别。以前的六个分析LR34小麦线R16058中的突变体，撒切尔的近似同学线LR34，证实了一个编码atp结合盒转运蛋白的单基因与此有关LR34耐叶锈，条纹锈病和茎锈病[15］．我们又分离了两个RL6058LR34突变体和与六种先前鉴定的突变体结合，进行了对现场条件下对条纹锈病和茎生锈感染的反应的详细表征，并在受控条件下生长时幼苗阶段的叶片生锈。四个撒切尔LR67.突变体也被鉴定，也显示出一系列的锈病侵染表型相似的那些LR34突变体，进一步支持这两个基因之间的机械相似性。

Lr34突变体表型特征

6个叠氮化钠诱导的Lr34突变体(2B, 2F, 2G, 3E, 4C, 4E)对叶锈病、条锈病和茎锈病敏感[15］．这些突变体携带独立的单核苷酸取代，导致拼接不正确LR34由该基因编码的ABC转运蛋白的预测氨基酸序列的转录本或变化(表)1)．这些突变体也失去了与野生型基因相关的叶尖坏死表型。在澳大利亚科比提的三个野外季节中，研究了这些突变体对条锈病的响应。与完全敏感的Thatcher (90S)和抗性野生型RL6058 (TR-5MR)相比，突变体4C表现出部分抗性损失(60-70 MS)。突变体2F在旗叶上出现脓疱的时间比撒切尔或其他突变体早，其余突变体与撒切尔在视觉上无明显区别。

在第三场季节（4G和3F）中包含两种额外的突变体（4G和3F），并从所有八个突变体中取样标志叶组织，以量化在开花间累积的条纹锈生物量。使用凝集素小麦胚芽凝集素（WGA）定量真菌生物量，其特异性结合甲壳素，处理荧光素异硫氰酸酯（FITC）和叶组织，使得在每个样品中检测到的荧光水平相当于存在的甲壳素的量[16］．几丁质测定结果通过抗野生型R16058积累3.5倍，确认了突变体4c的现场观察，所述突变体4c含有3.5倍的含量超过3.5倍，但只有一半的肉蛋白作为易感atcher父母（图1)．

类似地，突变体4G显示出在该领域中锈蚀的部分易感性，含有相对于父母基因型的甲壳素积累的中间水平。该领域的视觉观察没​​有区分突变体2G从易感茅草母细胞中，观察到甲壳素积累的30％降低，这可能反映了几丁质测定对经验视觉观察的敏感性。相反，突变体2F累积比所有其他突变体系更累积几丁质生物质，并且易受影响的茅草母父母一致，这与具有增强的条纹锈病感染的敏感性。其余突变体累积了易感父母与超易感2F突变体之间的几丁质水平，反映了易感线之间的真菌感染的增加变异性。

在澳大利亚的两个季节，在这些突变线中也观察到对茎生锈的抗茎锈病的丧失。RL6058具有高度抗性（TR），而撒切尔部分易受茎生锈（40-50mmm）。突变体与撒切尔类似于茎生锈的反应，而突变体之间的明显差异。

在低温条件下生长的幼苗中检查了这些突变体对叶锈感染的反应[17］．在3个时间点观察突变体的宏观锈病表型，并进行目视评分。3个突变体(2B, 3E和4E)完全易感，并对易感的撒切尔亲本做出类似的反应(图2)．两个突变体，2g和4c，中间表型比撒切尔更抗性，但比野生型母体R16058更敏感。突变体2F产生的脓疱比撒切尔，与该突变体的超易感表型一致，在现场条件下与条纹生锈。

为了更详细地检查和量化突变体之间的差异，在用WGA-FITC染色真菌结构后微观地研究了叶锈的感染过程[18］．基于感染菌丝面积的三个单独的实验中排名突变体，其在接种后10天在随机选择的感染部位开发的感染菌座（表2)．平均叶片生锈感染部位在2g和4c叶中较大，与野生型R16058相比，但小于茅草和完全敏感的突变体2b，3e和4e。这些观察结果与视觉上记录的2G和4C的中间响应一致。突变体2F中的感染遗址最大，两次实验中大于撒切尔。来自同一M2家族的抗性SIB的感染部位区域类似于野生型，确认2F的观察表型主要是由于内部发现的突变LR34基因，不太可能是累积背景突变的结果（数据未显示）。虽然锈病感染现场区域之间存在变化，但在三个实验中，部分和完全易感类别的排名保持不变。突变体2F和完全敏感突变体之间的显着差异是由于对感染部位观察到的较大的内部方差。在线内变异性可能也有助于在完全易感类别内的排名变化。

总之，显微镜和宏观研究的叶片锈病均根据使用现场观察和真菌生物量定量获得的条纹锈病的结果，与这些突变体一致，这些突变体符合其对这些病原体的易感性水平的遗传差异。然而，响应茎生锈的感染而没有观察到突变体之间的可检测差异。

将表型差异与DNA序列突变联系起来

单核苷酸转变事件（g至a或c至t），存在叠氮化钠诱变的特征LR34在八个突变体中的每一个中推定的ABC转运蛋白基因（表1和图3.） [15］．鉴定出三种突变体。4个突变体(2B, 3E, 3F和4E)编码无义突变LR34ORF并预测用于产生截短的并且可能是非功能性蛋白质。对这些突变体的条纹生锈和叶片生锈感染的反应与易感atcher父母无法区分。三种突变体（2g，4c和4g）编码的畸形突变，导致蛋白质的预测的第一或第二核苷酸结合结构域的高度保守氨基酸内的单一变化（图4.)．所有三个突变体表明，与父母线相比，标志叶中条纹锈巢蛋白的中间积累，而突变体2g和4c的幼苗也是部分易受叶锈的影响。超易感突变体2F在内含子22的3'剪接部位编码突变，导致编码预测的野生型蛋白质和缺乏外显子23的替代转录物的转录物（图3.)，编码一个部分跨膜结构域的蛋白(图4.)．除了显示在幼苗阶段的叶片生锈的增强育虫敏感性外，该突变体更容易造成条纹锈蚀，并积累了旗叶中的最高水平的条纹锈生物量。

LR67突变体的分离和表征

从M2家族中分离到4个感病突变体，对RL6077 (LR67.)叠氮化钠种子。这些推测的突变体在田间作为M3和M4行进行了后代试验，以确认抗条锈病的损失。M4行标记在两个位点上，突变体M2255 (70-80MS)比撒切尔(40-60MS)更容易发生条锈病(图4)5.)．几丁质定量也表明，M2255开花时旗叶中条锈病的积累比其他突变体多(图)1)．其他突变体M1723、M2006和M2257的敏感性水平与Thatcher相似，但M2006和M1723的旗叶条锈病含量低于Thatcher。

的效果LR67.还记录了对茎生锈的抗性。RL6077（5MR-10MR）在现场条件下生产的脓疱比中等耐/易感atcher线（30-40 mrms）（图6.)．突变体M1723，M2006和M2257是适度抗性/易受影响的，并且与撒切尔类似，但更容易受到条纹锈的M2255也比其他突变体更容易干锈（60ms）（图6.)．的LR67.供体系PI 250413完全容易受到茎锈（90s）的影响，表明这一点LR67.撒切尔回交衍生物RL6077的抗茎锈病作用是由于二者相互作用的结果LR67.在该基因型中存在其他基因。LR67突变体也易于叶锈，尽管田间感染比条纹锈蚀和茎锈更可变。在RL6077在低温下在低温下生长时，几次尝试诱导对幼苗叶片生锈的抵抗反应。与RL6058相比，RL6077在这些条件下完全易于叶锈。叶尖坏死与LR67.这些突变线也缺乏。

LR34与LR67的比较

等基因的抗性反应LR34和LR67.对条锈病和茎锈病的抗性相似，但在一些田间试验中Lr34抗性略强。以前的研究也报道了田间叶锈病抗性由LR34更有效LR67.[7.那19］．条纹锈病感染的反应显示LR34和LR67突变体之间的差异。突变内部LR34基因产生部分，完全和超易感突变体。在LR67突变体中也回收了一种超易感突变体，并且真菌生物量的定量表明，也可能发现部分易感突变体，但它们的表型与现场条件下的其他突变体难以区分。之间的重要区别LR34和LR67.在低温条件下生长的RL6077幼苗对叶锈病缺乏抗性。在田间条件下，这两个基因都具有抗条锈病、叶锈病和茎锈病的能力。独立的Lr34突变体提供了一个假定的ABC转运体基因负责的证据[15］．由于无法通过突变来分离对不同病原体的抗性，我们假设一个由LR67.还负责抗RL6077中的三种生锈病原体。

不同的突变LR34基因与不同程度的条纹锈和叶锈病有关。编码预测蛋白质的第一或第二核苷酸结合结构域中的单个氨基酸取代的突变体仅显示出抗性的部分损失，表明蛋白质的运输活性受到损害但未被废除，与预测完全损失蛋白质的完全敏感突变体相反功能。预期产生严重截短或非官能蛋白的突变体与茅草蜂敏感，其编码预测的全长蛋白，其仅由来自LR34的两个氨基酸残基变化[15］．这些数据意味着由撒切尔等位基因编码的蛋白质可能是非功能性的，并且不赋予正常植物生长和发育所需的基础抗性水平。假设需要进一步调查，鉴于撒切尔与实验中的完全易感线之间的感染程度的变异程度。超易感2F突变体编码含有在第二跨膜结构域中缺失的LR34蛋白，其可以充当“显性负”突变体，其干扰有助于基础免疫的其他相关转运蛋白。

对Lr34和Lr67突变体的分析证实了之前的报道，这些基因以一种非特异性的方式对多种病原体产生抗性。鉴于叠氮化钠产生点突变，突变分析LR67.与赋予与该基因座相关的所有抗性表型的单个基因一致。虽然转移LR34或LR67.进入易感麦背景导致耐叶锈病和条纹锈病的抗性，这些基因不赋予自己有效的茎耐锈。例如，含小麦线LR34如中国春天，Terenzio和Sumai 3易受茎生锈的影响。但是，转移LR34进入撒切尔可以通过相互作用导致有效的茎锈病的表达LR34随着撒切尔基因的解释。有良好的证据表明“增强效果”LR34对茎锈病的抗性是小种特异性的，这表明该基因对叶锈病和条锈病的作用方式不同于小种非特异性的反应[11那12那14］．这项研究证实了这一点LR67.也与撒切尔的茎锈病抗性增强有关。供体系LR67.PI 250413为茎锈病易感LR67.类似于LR34表型在其中也与撒切尔中的未链接基因相互作用以表达茎锈蚀性[19］．这还有待确定是否LR67.对茎锈病的反应也是种族特异性的，如果它需要撒切尔基因LR34用于抵抗。

如果这些基因结合在一起，它们会为三种锈病病原体提供额外的保护吗?一个假定的LR34/LR67.先前开发和筛选用于防锈性的线（90rn2491）不太可能携带LR67.在这条线后用新开发的标记进行基因分型LR67.[19，Spielmeyer，未发表]。需要开发出新的种质以评估基因组合的抗性响应。鉴于表型相似之处，有可能LR34和LR67.编码具有相似功能的蛋白质，携带编码功能冗余蛋白的基因组合的基因系可能不会比单基因系表现更好。Lr67突变与因果突变之间表型差异的比较有待于基因的分离。

突变体的分离和特征LR67.和LR34在一个共同的遗传背景下的基因使详细的研究对三种锈病病原体的抗性反应。通过定量野外样品中的几丁质水平，宏观观察和在控制条件下生长的幼苗的显微镜分析，在野外目视地评估突变体。在相对较小的M2群体中分离这两个基因的部分和超易感突变体是有趣的，并可能在未来的研究中提供预测蛋白的功能和与基础抗性成分的相互作用。我们期待市场的发展LR67.尚未认识到与之相互作用的atcher-衍生的基因LR34和LR67.为了赋予茎锈蚀，将为APR基因增添更多价值，并在未来的品种中提供更大的防锈保护。

植物材料

通过转移通过P. Dyck（Agcanada）开发了近代源性线LR34来自中国长白羊PI 58548和LR67.从Pakistani Landrace PI 250413到6几代人进入易感茅草背景，分别生产RL6068和RL6607。

控制条件下的锈病感染和表型

在低温条件下筛选叶片锈蚀，接种一周的幼苗p . triticina本病理型104-1,2,3，（6），（7），11，在20℃和高湿度下孵育24小时，然后移动到设置在10℃恒温和16小时的光周期的生长柜中。

在现场条件下进行生锈感染和表型

在2007年，2008年，2008年，2009年和2012年，在Cobbitty（澳大利亚）的锈浴中，父母线和易感atcher对照是在2007年，2008年，2009年和2012年的副托儿所的复制领域行生长。条纹锈Pucciniia striiformis.f . sp。tritici134 E16 A +和104 E137 A- +17为叶锈病p . triticina病理型104-1,2,3，（6），（7），9,11;104-1,2,3，（6），（7），11,13;10-1,3,7,9,10,12;76-3,5,9,10 + LR37和茎锈P. Graminis.f.sp。tritici逐步释放到晚期干伸长阶段的肝脏98-1,2,3,5,6和34-1,2,7 + SR38。改性的COBB刻度用于对TR =痕量抗性的疾病反应来评分MR =中度抗性，MS =适度易感，S =易感[20.］．LR67突变体，父母线和对照是在2010年在2010年在Cobbitty的复制场行中进行的后代测试，其中它们被评分为条纹锈蚀和叶锈蚀。2011年，LR67突变体在Cobbitty的复制行中评估了条纹锈，叶锈和茎锈蚀，并再次用于澳大利亚堪培拉的实验部位的条纹铁锈抗性（自然感染）。2012年，LR67突变体在澳大利亚Cobbitty的两个地点再次逐步划分。

突变体的分离

将RL6058和RL6077种子在4℃水中预浸12小时，然后在pH 3.0的7mm叠氮化钠氧合溶液中处理2小时。谷物漂洗后种在地里。田间条件下，每个亲本约有1000 M2单穗行抗条锈病评分。在澳大利亚科比提和堪培拉的锈病苗圃中，从假定突变体和抗性亲本中收集种子，并对每个突变体的后代进行了数个季节的条锈病、叶锈病和茎锈病抗性测试。

锈病侵染部位的显微学和测量

小麦叶(主要1^圣叶片)接种叶锈病，10天后用WGA-FITC制备并染色，如[18］．在蓝光下用x10倍放大拍摄产生感染菌丝的感染部位区域。使用AnalySIS生命科学专业程序(Olympus, Mt. Waverley, Australia)，对一个实验中的每条线随机选择约30-40个感染点拍照，并从照片图像计算感染点区域。数据的统计分析采用Kruskal-Wallis单因素方差分析和Tukey两两均数差异检验。

小麦胚芽凝集素蛋白（WAC）测定

从20-30株植物，在开花中收获旗叶，在复制的野外行中生长，这些田径用条纹锈蚀（见上文）。将组织切成大约2cm长的区段，并在亚采样1-2克组织中混合在一起以进行丁蛋白测定。如[16］．简而言之，将组织区段在1M KOH中高压灭菌，然后在50mM Tris pH 7.0中中和。然后通过超声处理均化组织，并以终浓度为200mg / ml重悬。用WGA-FITC染色20mg样品，然后用50mM Tris pH 7.0缓冲液洗涤三次组织。最终将样品重新悬浮在100uL中，并使用Wallac Victor 1420 Multilabel计数器（Perkin和Elmer寿命）测量的荧光，其中485nm吸附和535nm发射波长和1.0秒的测量时间。对所有样品进行至少三次重复。

我们感谢Melanie女士提升，用于执行几壳素测定和Keshab Kandel先生用于种植和维护现场实验。

从属关系

1. CSIRO工厂，1600，堪培拉，ACT, 2601，澳大利亚

   Wolfgang Spielmeyer，Rohit Mago＆Michael Ayliffe

2. 悉尼大学植物育种研究所，私人袋4011，新南威尔士州，2567，澳大利亚

   科林利林斯

相应的作者

对应于Wolfgang Spielmeyer．

利益争夺

没有确定财务或非财务竞争利益。

作者的贡献

WS构思并设计了实验。RM和CW有助于分离突变体。MA开发了测量锈病感染部位的方法，并开发并进行了几丁质测定。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇基于知识共享署名许可协议(http://creativeCommons.org/licenses/by/2.0.）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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