的非同义SNPgydF4y2Baisopentenyl转移酶gydF4y2Ba中国玉米自交系2个基因座与粒重相关(gydF4y2Ba玉米gydF4y2Bal .)gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

粒重是玉米产量的重要组成部分，受数量性状位点控制。细胞分裂素(ck)参与决定作物的籽粒形态和最终产量。gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba该基因在玉米籽粒发育过程中主要表达于基底转移细胞层、胚乳和胚中，编码一种参与CK生物合成的异戊烯基转移酶(IPT)。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

的编码区gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba对目前中国玉米育种项目中使用的175个玉米自交系进行了测序。在这些自交系中仅检测到16个单核苷酸多态性和7个单倍型。核苷酸多样性(gydF4y2BaπgydF4y2Ba)在…之内gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区和窗口的核苷酸多样性值分别为0.347和0.0047，显著低于玉米2号染色体(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。关联图谱揭示了一个核苷酸的变化，从胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区将脯氨酸残基转化为丝氨酸残基，在三种环境下与百粒重(HKW)显著相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05)，解释了4.76%的总表型变异。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba表征表明，ZmIPT2-T消耗的三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)分别是ZmIPT2-C消耗的5.48倍、2.70倍和1.87倍，其二磷酸二甲基烯丙基(dapp) IPT活性高于ZmIPT2-C。人工选择对gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba利用Tajima’s D试验对6个中国玉米种质资源亚群的编码区进行了分析，发现PB亚群(Partner B)中最常见的有利等位基因。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些结果表明gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba在玉米育种过程中，对与粒重有关的基因进行了人工选择。gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2BaIPT活动高于gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCgydF4y2Ba，该粒重有利等位基因可用于分子标记辅助选择，改善中国玉米育种中籽粒产量组成部分。gydF4y2Ba

粮食产量遗传改良对保障粮食安全具有重要意义。许多重要的农艺性状，包括产量，表现出连续的表型变异[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。籽粒产量是一种复杂的数量性状，由籽粒数和粒重等几个因素决定[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。迄今为止，利用不同的定位群体(2012年11月更新的Gramene数据库)，已经在玉米基因组中鉴定出185多个与产量组成相关的数量性状位点(QTL)，包括粒行数(KRN)、粒行数(KNPR)和百粒重(HKW)，这提高了我们对玉米产量遗传基础的认识。因此，籽粒大小和粒重是高产量人工选育的重要指标。例如，QTL与gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba),gydF4y2BaGW5gydF4y2Ba/gydF4y2BaSW5gydF4y2Ba［gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在大米中被选择为颗粒大小。此外，QTL与gydF4y2BaTaGW2gydF4y2Ba-gydF4y2Ba6偶然gydF4y2Ba-gydF4y2Ba6gydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba对于颗粒大小[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),gydF4y2BaTaCKX6gydF4y2Ba-gydF4y2BaD1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在中国小麦种质资源中，已鉴定并人工选择了小麦籽粒重的[2]。从控制玉米籽粒产量相似组成部分的QTL中获得的标记对标记辅助选择非常有用。gydF4y2Ba

一些控制粒重或粒数的基因已被克隆到作物中，其中一些基因被发现与碳氮代谢有关[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]、蛋白质降解[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]和激素代谢[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。所有这些过程都会影响C和n同化物的产生和向种子的输出，从而提高作物产量。C和n的代谢对植物包括生殖发育在内的所有过程都至关重要，但在灌浆过程中尤为重要[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在参与碳代谢的基因中，水稻gydF4y2Ba籽粒不全灌浆1gydF4y2Ba它的功能类似于由gydF4y2Ba微型1gydF4y2Ba在玉米[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，也编码一种细胞壁转化酶，这种酶是早期灌浆过程中碳分配所必需的[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。一个与水稻氮代谢有关的基因，gydF4y2BaOsARGgydF4y2Ba，编码一种精氨酸水解酶，当该酶过度表达时，由于繁殖阶段氮的再动员增加，在氮限制条件下增加每株的粒数[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

此外，通过泛素/蛋白酶体途径的蛋白质降解负调控细胞分裂和籽粒产量。另一个基因,gydF4y2Ba粒重gydF4y2Ba2 (gydF4y2BaGW2gydF4y2Ba)，它编码一种环型E3泛素连接酶，在泛素介导的降解中起作用，并丢失gydF4y2BaGW2gydF4y2Ba功能可以提高稻谷的宽度、重量和产量[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外,gydF4y2BaZmGW2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCHR4gydF4y2Ba，其作用方式与gydF4y2BaGW2gydF4y2Ba，亦与玉米的粒宽及粒重有关[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。虽然它们对产量有潜在的积极影响，但也应监测这些位点上的等位基因，以避免引入种质对产量可能产生的负面影响。gydF4y2Ba

在植物激素方面，油菜素内酯(BRs)和细胞分裂素(ck)在控制作物产量方面发挥着重要作用。BRs刺激蔗糖和其他糖向胚乳和胚胎的运输。表达玉米、水稻或gydF4y2Ba拟南芥CgydF4y2Ba-gydF4y2Ba22gydF4y2Ba茎、叶和根中参与BR合成的羟化酶对种子重有明显的影响[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。在水稻中，CK在花序分生组织中的积累增加了每穗的粒数。水稻基因gydF4y2BaGn1agydF4y2Ba编码一种氧化酶/脱氢酶(OsCKX2)，在降解CKs中起作用。其编码区11-bp的缺失产生了一个过早的停止密码子，减少了gydF4y2BaOsCKX2gydF4y2Ba导致谷物数量增加[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在小麦、gydF4y2BaTaCKX6gydF4y2Ba-gydF4y2BaD1gydF4y2Ba是水稻的同源物gydF4y2BaOsCKX2gydF4y2Ba，通过连锁作图和关联分析，与千粒重显著相关[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。因此，CK调控途径可能在粮食产量中起着至关重要的作用。gydF4y2Ba

也有证据表明，碳汇在平衡源汇关系方面发挥了作用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。因此，外源施用ck增加了玉米在热胁迫下的结实率和产量稳定性[j]。gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。在植物中，CKs受异戊烯基转移酶(IPT)和氧化酶/脱氢酶的共同调控。通过IPT10发现生物合成酶IPT1 [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]和降解酶CKX1至CKX12 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba使人们更好地理解了ck在玉米籽粒发育中的作用。在gydF4y2Ba进行gydF4y2Ba，gydF4y2BaIPT1gydF4y2Ba和gydF4y2BaIPT10gydF4y2Ba丰富且在所有器官中均有组成性表达，但其他IPT转录本表现出不同的空间和时间表达模式[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba在花梗、胚乳和胚胎中特异表达[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba二磷酸二甲基丙烯基(dapp):三磷酸腺苷(ATP)/二磷酸腺苷(ADP) IPT由一个966 bp的无内含子编码区组成，IPT活性的底物首选ATP和ADP而非单磷酸腺苷(AMP) [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

到目前为止，等位基因多样性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba影响玉米粒重的最有利等位基因尚未见报道。本研究的目的是:(1)检验gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba175个中国玉米自交系;(2)检验基因多态性之间的相关性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba以及包括KRN、KNPR和HKW在内的各种产量组成部分，并进一步确定粮食产量组成部分的有利等位基因;(3)表征不同等位基因蛋白产物的IPT活性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba;(4)调查有利条件的选择gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba中国玉米育种中决定粒重的等位基因。gydF4y2Ba

表型数据gydF4y2Ba

各品系的表型值KRN为7.81 ~ 18.62 g(平均为12.80)，KNRP为8.26 ~ 34.67 g(平均为22.40)，HKW为12.35 ~ 47.60 g(平均为28.36)，见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。KRN与KNPR呈显著正相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.01)，而HKW与KNPR呈负相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。方差分析表明，这175个玉米品系的KRN、KNPR和HKW表型差异显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)。每样地遗传率分别为KRN的86.58%、KNRP的84.27%和HKW的86.12%。gydF4y2Ba

核苷酸的多样性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区gydF4y2Ba

共鉴定出16个单核苷酸多态性(snp)gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区，平均每60 bp有1个SNP，其中6个变异导致氨基酸替换(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2BaA)。基于这16个snp，在我们的关联面板中检测到7个单倍型，命名为Hap_1到Hap_7(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2BaB).共有75个(42.9%)自交系携带Hap_1，而携带Hap_2的自交系分别为10个、31个、22个、9个、10个和18个。幸福的港湾gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba在SNP28 (C-T)等位基因，但其他单倍型携带gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCgydF4y2Ba等位基因。窗帘gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba表现出较低的多样性，为0.347，显著低于175个玉米自交系(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。大多数的多态性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba分布于360 ~ 590 bp， (gydF4y2BaPgydF4y2Ba>(图0.005)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。Xie等揭示的玉米亚群[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，兰开斯特(Lan)和吕达(Lvda)红穗轴(LRC)亚群的多样性水平较高gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区，与所有自交系的平均值相比(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

KRN、KNPR与HKW的关联分析gydF4y2Ba

关联分析显示，在所有三个测试环境中，SNP28与HKW显著相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05)，解释了2007年新疆HKW表型变异的5.42%、2008年北京表型变异的3.41%和2008年新疆表型变异的5.46%。在一个或两个环境中检测到HKW与SNP195、SNP413和SNP591的显著关联(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而，在北京地区仅发现SNP413与KNPR相关(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05)，无SNP与KRN显著相关(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。自交系含有gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba等位基因(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05)，籽粒重大于携带gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCgydF4y2Ba等位基因，如2007年新疆和2008年北京的数据所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba值支持了观察到的HKW与SNP28之间关联的强度，并提高了鉴定该基因的信心gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba作为玉米粒重最有利的等位基因。gydF4y2Ba

ZmIPT2的表征gydF4y2Ba

ZmIPT2-T和ZmIPT2-C蛋白等位基因具有相同的pI和脂肪指数。然而，SNP28从胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)的转变将脯氨酸转化为丝氨酸，导致整个ZmIPT2蛋白的亲水性从- 0.006降低到- 0.008，使用卤肉分析。IPT编码区与p环NTPase超家族一致，该超家族是所有位置28至480的ntp结合蛋白的特征，其e值(即给定位分数的蛋白质序列偶然出现的概率)为1.3e-06 (NCBI blastp数据库)gydF4y2Ba1gydF4y2BaA). SWISS-MODEL预测的三维结构(变为gydF4y2Bahttp://swissmodel.expasy.org/gydF4y2Ba)表明ZmIPT2-T和ZmIPT2-C的空间结构不同，这是由于两种蛋白之间的疏水性差异造成的(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些变化可能影响底物与酶的结合，这是由氢键介导的[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。这种突变和由此产生的物理化学性质的差异表明，IPT活性可能在不同的蛋白质产物之间有所不同gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba和gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCgydF4y2Ba等位基因。gydF4y2Ba

进一步确认这两种ZmIPT2产物的CK生物合成功能gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba构建原核表达载体，将ZmIPT2表达纯化为c端his标记的重组蛋白。在Talon®柱上纯化的ZmIPT2-T和ZmIPT2-C纯度达到95-100%，经过PAGE(附加文件)考马斯氏染色定量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然后用纯化蛋白测定DMAPP:ATP、DMAPP:ADP和DMAPP:AMP转移酶活性。数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba如图所示，纯化后的ZmIPT2蛋白与DMAPP和底物(ATP、ADP和AMP)孵育后的反应混合物得到的图谱。从反应后iPMP的量可以看出，ZmIPT2- t将AMP转化为iPMP的效率高于ZmIPT2- c(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2BaZmIPT2-T和ZmIPT2-C的平均AMP消耗量分别为0.20 μmol和0.07 μmol(附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。以ATP或ADP为底物也得到了类似的结果(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2BaA, B). ZmIPT2-T比ZmIPT2-C消耗更多的ADP和ATP，平均分别为270.2%和548.4%。此外，ZmIPT2-T比AMP消耗更多的ATP和ADP，平均分别是AMP消耗量的7.38倍和13.61倍(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。这些结果表明，蛋白质产物gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba该等位基因具有较高的IPT酶活性，更倾向于ADP作为底物，因此对产量的影响更有利。gydF4y2Ba

区域内的选择gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba轨迹gydF4y2Ba

共有4282个snp [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]分析了在选择和育种过程中2号染色体这一区域发生的选择效应。对π和田岛D的估计gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba窗口显示，所有玉米2号染色体的这些参数值都低于平均值(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。田岛的D测试gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区和基因组窗口在这6个玉米亚群中发现了不同的人工选择效应，其中PB亚群的人工选择效应最大(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。值得注意的是，PB亚群81%的自交系携带有利等位基因gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba(表gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。这些结果表明，人工选择发生在基因区gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba在玉米育种期间。gydF4y2Ba

粮食产量是由少数基因控制的复杂性状gydF4y2Ba

籽粒产量是玉米最重要、最复杂的性状之一。尽管对玉米产量相关性状的遗传基础进行了许多研究，但由于在关联研究中发现的单个基因只能解释一小部分表型变异，因此鉴定出的产量候选基因的有利等位基因很少。在这项研究中，SNP28在gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba在三种环境中，编码区与核重显著相关，解释了4.76%的表型变异。相对较小的等位基因效应也发现了一个多态性gydF4y2BaZmGS3gydF4y2Ba，解释了北京地区6.29%的变异和海南地区7.73%的变异[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]和另一个SNP, S40在gydF4y2BaZmGW2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCHR4gydF4y2Ba区域，占三种环境变化的不到10% [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。因此，大量有利等位基因的鉴定和金字塔化将是实现玉米高产分子标记辅助育种的关键。gydF4y2Ba

复杂性状的关联映射gydF4y2Ba

作为解剖复杂性状和鉴定有利等位基因或单倍型的有效方法，关联图谱已被广泛应用于许多玉米性状，包括开花时间[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]、叶状建筑[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]、株高[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]和抗病性[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。通过候选基因关联作图，已经鉴定出许多基因的优秀等位变异，如gydF4y2BacrtRB1gydF4y2Ba在玉米籽粒中合成β-类胡萝卜素[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba];gydF4y2BaDwarf8gydF4y2Ba玉米开花时间[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba];gydF4y2BaZmGW2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCHR4gydF4y2Ba［gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),gydF4y2BaZmGS3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，与玉米籽粒大小和重量有关;gydF4y2BaTaGW2gydF4y2Ba，这与小麦粒重和成熟度有关[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba];以及其他与水稻淀粉合成有关的基因[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

ck对粮食产量的贡献gydF4y2Ba

植物激素控制着发育的许多方面，与其他激素一样，ck影响许多植物生理和生化过程，包括控制延迟衰老的过程[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]，抑制生长素诱导的根尖优势[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]，氮有效性信号[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]，细胞的分裂和分化[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]，下沉强度[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。IPT蛋白在玉米中由一个多基因家族编码，它参与了ck的合成[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，大米[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]，大豆[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]，牵牛花[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，跳[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]和豌豆[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。现在，利用关联作图方法在玉米中发现了一个有利的IPT等位基因，该等位基因导致籽粒重量增加(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

植物CK含量受两个基因家族的共同调控，包括异戊烯基转移酶和氧化酶/脱氢酶。在水稻中，表达减少gydF4y2BaOsCKX2gydF4y2Ba编码氧化酶/脱氢酶的基因，由于CK在花序分生组织中的积累，导致每穗粒数增加。gydF4y2BaOsCKX2gydF4y2Ba在雌蕊中表达强烈，在花序和种子中表达中等水平，在其他器官中表达较低[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2BaTaCKX6gydF4y2Ba-gydF4y2BaD1gydF4y2Ba稻子的小麦同源物gydF4y2BaOsCKX2gydF4y2Ba，通过连锁映射和关联分析与HGW相关。gydF4y2BaTaCKX6gydF4y2Ba＿gydF4y2BaD1gydF4y2Ba在种子和雌蕊中表达量高，在其他器官中表达量低[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。一项研究表明gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba在花梗、胚乳和胚胎中特异表达，在玉米籽粒发育的CK生物合成中起主要作用[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。然而，在本研究中，在三种实验环境之一(北京)中，仅发现SNP413与KNPR显著相关，未发现与KRN相关的SNP(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。CKs协同诱导细胞外转化酶和己糖转运蛋白活性，它们在功能上偶联以向沉组织提供碳水化合物[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。在本研究中，从C到T的单核苷酸替换gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba编码区与核权显著相关。这表明，通过增加同化物从源到库的流动或增加库容量，调控生殖器官的CK代谢可能是进一步提高作物籽粒产量的有效途径。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2BaZmIPT2酶的表征表明，相对于AMP，它更倾向于ADP和ATP作为DMAPP IPT活性的底物(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，与先前的研究结果一致[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。与其他10个玉米ZmIPTs相比，ZmIPT2发生了6个氨基酸取代，没有一个是保守的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，表明ZmIPT2及其特定的表达模式是保守的，对内核的发育至关重要。有趣的是，与有利等位基因相关的突变，gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba，在gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba结果发现，在保守的IPT结构域中，丝氨酸被脯氨酸取代，导致ZmIPT2-T酶比ZmIPT2-C酶消耗更多的ATP、ADP和AMP(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba、附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。因此，选择分子标记SNP28应该通过增加IPT酶活性来积极影响玉米籽粒发育，从而提高产量。gydF4y2Ba

核苷酸多样性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba跨越六个子组gydF4y2Ba

的编码区gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba对175个中国玉米自交系进行了测序。功能基因的编码区由于其对其他类型分子的特异性和亲和力，往往相对保守。因此，在自然选择下，有益的变异往往逐渐固定，而有害的变异往往被消除[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。生物多样性水平较低gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba与合并组相比，PB亚组和BSSS亚组(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，这表明要么种质基仍然非常狭窄，要么在这些亚群中该位点发生了强烈的正选择。根据家系分析，PB亚群17个自交系主要来源于美国杂交种P78599。而蓝亚群的多样性最大gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba跨所有这些近交系的编码区域(表3)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba;数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。一项研究使用随机分布在基因组中的145个SSR位点，确定该亚群具有最丰富的遗传多样性[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在育种过程中对粮食产量的选择gydF4y2Ba

据推测，自然选择倾向于种子较小的野生祖先，每株种子数量较多，成熟时间较早，地理分布较广[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。然而，在大多数育种计划中，高产量与更大的颗粒尺寸和重量相关联一直是人工选择的目标。例如，基因gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba),gydF4y2BaGW5gydF4y2Ba/gydF4y2BaSW5gydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba已被证明与水稻晶粒大小的进化有关。与水稻不同，在小麦和玉米中，人工选择与种子或籽粒大小几乎一致的增加有关。等位基因gydF4y2BaTaGW2gydF4y2Ba-gydF4y2Ba6偶然gydF4y2Ba-gydF4y2Ba6gydF4y2Ba-gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，在正选择下，其出现频率从1950年代的50.0%增加到目前的77.42% [gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。在特定位点的强选择下，驯化有可能大幅增加LD和减少多样性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

本研究对参数π和田岛D的估计表明，人工选择发生在gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba轨迹(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。然而，在这里研究的7个单倍型中，只有Hap_1携带gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba等位基因(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，在三个实验环境中的两个环境中，这个有利等位基因与籽粒重量增加有关(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，表明高粒重的正向选择。同样，整个基因组的核苷酸多样性减少了95.7%gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba位点发生在携带A等位基因的水稻材料中gydF4y2BaGS3gydF4y2Ba［gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。目前的研究发现gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba该等位基因在6个玉米亚群中分布不均匀，在PB亚群中出现频率最高，其中81%的被试株系含有该有利等位基因(表2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。Tajima’s D值在PB亚组中也最低(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，表明明显的正向选择压力发生在gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba这个亚群的基因座。有利等位基因的选择gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba为了提高玉米产量，应在每个亚组内继续进行。gydF4y2Ba

有利等位基因，gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba在中国玉米种质中，与粒重有关。显示ZmIPT2-TgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba具有比以ADP、ATP或AMP为底物的ZmIPT2-C更高的IPT活性。人工选择gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2BaTajima’s D试验在6个中国玉米种质亚群中检测到基因座，在PB亚群中发现最常见的有利等位基因。该有利等位基因可用于分子标记辅助选择，改善我国玉米育种中籽粒产量组成部分。gydF4y2Ba

实验设计和统计分析gydF4y2Ba

本研究共使用了175个玉米自交系，将其细分为6个亚群[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，包括29个来自美国BSSS和Reid种质的BSSS系;55个PA(伙伴A)系来自中国的现代美国杂交种;21个美国现代杂交种在中国衍生的PB (Partner B，具有明显的PA杂种优势)系;美国Lancaster Sure Crop种质资源18个Lan系27个LRC系来自中国地方品种绿达红雄牛;25个SPT系源自中国本土品种泗坪头。所有品系分别于2007年和2008年在新疆和2008年在北京种植，以测量籽粒产量组成，包括氮素、氮素比和HKW。采用随机完全区组设计，每个位置每系20株，每行4.5 m，间隔0.6 m，重复3次。进行了正常的玉米农业实践。成熟时，所有的穗均人工收割，干燥至水分13%。 KRN was scored as number of rows per ear, KNPR was scored as total kernels in a row per ear, and HKW was measured on 100 randomly selected kernels per ear. The average phenotypic values of each plot over three replications in each environment were used for final analysis.

KRN、KNPR和HKW的描述性统计和方差分析(ANOVA)使用SAS软件9.13版中的PROC GLM程序进行(版权©2009 SAS Institute Inc.， 2009)。SAS和所有其他SAS Institute Inc.产品或服务名称均为SAS Institute Inc.(位于美国北卡罗来纳州卡里)的注册商标或商标。采用SAS程序PROC CORR对三个性状之间的关系进行量化。广义遗传力的估计基于图asgydF4y2BahgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba=σgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/(σgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba+σgydF4y2Ba_glgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/gydF4y2BangydF4y2Ba+σgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/gydF4y2BanrgydF4y2Ba)，其中σgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba遗传方差，σgydF4y2Ba_glgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba是基因型与环境的相互作用，gydF4y2BaσgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^2gydF4y2Ba是误差方差，gydF4y2BargydF4y2Ba是复制的数量，和gydF4y2BangydF4y2Ba是位置的个数。对gydF4y2BaσgydF4y2Ba_ggydF4y2Ba^2gydF4y2Ba，gydF4y2BaσgydF4y2Ba_glgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba,gydF4y2BaσgydF4y2Ba_egydF4y2Ba^2gydF4y2Ba由方差分析得出[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

DNA分离、PCR扩增及测序gydF4y2Ba

采用CTAB法从玉米叶片中提取基因组DNA [gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。引物ZmIPT2-5′(5′-ATCATCAAGACAATGGAGCACGGTG-3′)和ZmIPT2-3′(5′- cgtccgctagctacttatgcatag -3′)基于已发表的ZmIPT2 cDNA序列(登录号EU263126)设计。gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba从175个自交系中扩增基因组序列gydF4y2BaμgydF4y2BaL反应混合物，含20 ng基因组DNA，每个dNTP 0.2 mM, 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba每个引物M, 2 × GC缓冲液(2 mM MggydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba})和2.5 U TransTaq高保真DNA聚合酶(Transgen生物技术公司，北京，中国)。采用触地PCR: 94°C 2 min(1个循环)，94°C 30 s, 65°C 45 s, 72°C 90 s(5个循环，每循环退火温度降低1°C)， 94°C 30 s, 60°C 45 s, 72°C 1 min 30 s(30个循环);72℃反应7 min，然后在4℃保持反应。产品由中国农业科学院作物科学研究所作物基因资源与遗传改良国家重点设施公共实验室测序(ABI3730)。gydF4y2Ba

育种过程中的核苷酸多样性与选择gydF4y2Ba

使用DnaSP Version 4.00软件分析所有品系的DNA序列[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。滑动窗口分析核苷酸多样性，窗口大小设置为100 bp，步骤设置为25 bp。的参数gydF4y2BaπgydF4y2Ba估计为样本中所有可能的序列对之间核苷酸差异的平均比例[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。利用Illumina公司的玉米2号染色体上的4282个单核苷酸多态性进行估计gydF4y2BaπgydF4y2BaTajima 's D使用TASSEL 3.0软件[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

KRN、KNPR和HKW的关联映射gydF4y2Ba

为了排除种群结构对关联作图的影响，利用structure version 2.3和SPAGeDi软件对175个品种的种群结构和亲缘关系信息进行分析，并从先前研究中发现的5000个snp中选择snp，并根据物理位置和次要等位基因频率进行选择。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。三个产量相关性状与大豆核苷酸多样性的关联图谱gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba使用TASSEL 3.0进行编码区分析[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，采用混合线性模型(MLM)控制种群结构(Q)和亲属关系(K)。gydF4y2Ba

ZmIPT2的表征gydF4y2Ba

ZmIPT2蛋白的三维模型采用SWISS-MODEL自动化模式(gydF4y2Bahttp://swissmodel.expasy.org/gydF4y2Ba)。ZmIPT2蛋白的理化性质，包括等电点(pI)、脂肪族指数和亲水性大平均值(GRAVY)。gydF4y2Bahttp://web.expasy.org/protparam/gydF4y2Ba)。这些变化可能影响底物与酶的结合，这是由氢键介导的[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。利用保守域对智能web程序(gydF4y2Bahttp://smart.embl-heidelberg.de/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

表征这两种产物的酶活性gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba对ZmIPT2等位基因(T变异体和C变异体)、原核表达和酶活性测定进行了研究gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。基因片段窝藏gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaTgydF4y2Ba或gydF4y2BaZmIPT2gydF4y2Ba-gydF4y2BaCgydF4y2Ba使用基因特异性引物扩增合适的gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba不gydF4y2Ba1个限制性内切位点分别从‘Ye478’(Hap_1)和‘Guan17’(Hap_2)自交系延伸出(5’-GGCATATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’和5’- ccgcggccgctcatcatgccacggcggtga -3’)。PCR产物用gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba不gydF4y2BaI，然后在这些相同的限制性内切酶位点克隆到pET30b (Novagen, Darmstadt, Germany)。将重组质粒整合到BL21 (DE3)中。gydF4y2BaEgydF4y2Ba。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba(天根生物科技有限公司，北京，中国)培养物在37°C下摇培养至OD值为对数相gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= ~ 0.4。IPT蛋白通过1 mM IPTG在37℃下孵育3小时诱导表达，然后使用HisTALON™重力柱纯化试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.， CN)根据制造商指南进行纯化。十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(PAGE)以确保纯度，并使用Macro-BCA Assay Kit (Gragen Life Science Inc.， CN)测量蛋白质密度。gydF4y2Ba

用纯化蛋白测定DMAPP:ATP、DMAPP:ADP和DMAPP:AMP的IPT活性。每个纯化蛋白(~0.13 mg/ml)在含有12.5 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 37.5 mM KCl, 5 mM MgCl的反应混合物中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 mM dapp (Sigma-Aldrich Co.， St. Louis, USA)，和1 mM ATP (Sigma-Aldrich Co.， St. Louis, USA)， ADP (Sigma-Aldrich Co.， St. Louis, USA)或AMP (Sigma-Aldrich Co.， St. Louis, USA)，在30°C下放置2小时。沸水停止反应5 min，反应产物用反相高效液相色谱(Shimadzu LC-10AT系列高效液相色谱系统，配备SPD-10AVP紫外-可见检测器)分离gydF4y2Ba_18gydF4y2BaodsgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba列(Kromasil)，按以下程序:20毫米KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba线性梯度为0%乙腈，20mmkhgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba20%乙腈，4mmkhgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在280 nm处监测紫外吸光度。gydF4y2Ba

方差分析:gydF4y2Ba

方差分析gydF4y2Ba

br:gydF4y2Ba

BrassinosteroidsgydF4y2Ba

中正:gydF4y2Ba

细胞分裂素gydF4y2Ba

DMAPP:gydF4y2Ba

Dimethylallyl diphospategydF4y2Ba

全球语言监测机构:gydF4y2Ba

一般线性模型gydF4y2Ba

人声:gydF4y2Ba

百粒重gydF4y2Ba

IPT:gydF4y2Ba

Isopentenyl转移酶gydF4y2Ba

KRN:gydF4y2Ba

内核行号gydF4y2Ba

KNPR:gydF4y2Ba

每行内核数gydF4y2Ba

LD:gydF4y2Ba

连锁不平衡gydF4y2Ba

传销:gydF4y2Ba

混合线性模型gydF4y2Ba

QTL:gydF4y2Ba

数量性状位点gydF4y2Ba

SNP:gydF4y2Ba

单核苷酸多态性gydF4y2Ba

07年xj:gydF4y2Ba

2007年新疆位置gydF4y2Ba

08年奉:gydF4y2Ba

2008年北京地点gydF4y2Ba

08年xj:gydF4y2Ba

2008年新疆地点。gydF4y2Ba

本研究得到科技部国家基础研究计划(2011CB100100)和国家高技术研究发展计划(2012AA10A306)资助。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 中国农业科学院作物科学研究所，国家作物基因资源与遗传改良重点设施，北京100081gydF4y2Ba

   翁建峰，刘长林，郝转芳，李明顺，张德贵，慈晓科，李鑫海，张世煌gydF4y2Ba

2. 沈阳农业大学，辽宁沈阳110161gydF4y2Ba

   李波，王宏伟gydF4y2Ba

3. 重庆市农业科学院，重庆409912gydF4y2Ba

   杨小燕gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba辛亥李gydF4y2Ba或gydF4y2BaShihuang张gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

SZ和XL构思和设计了实验。JW和BL进行了实验。JW、BL、CL、XY、HW、ZH、ML、DZ和XC提供了试剂、材料和分析工具。JW, BL和XL撰写了手稿。SZ, XL和JW协调了这项研究。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

翁剑锋、李波对这项工作也有同样的贡献。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba