胞质硫脲酶CTU2的拟南芥对trna转录后硫代化至关重要并影响根系发育

背景

在原核生物和真核生物中已经描述了大量的转移rna (trna)的转录后修饰。已知它们会影响它们的稳定性、周转率和化学/物理性质。trna的一个特定子集在摆动位置含有硫代尿苷残基，以提高密码子-反密码子相互作用和翻译准确性。参与tRNA硫代化的蛋白质与原核生物的硫转移反应和真核生物的泛素化过程相似。在植物中，一些参与这一过程的蛋白质已经被鉴定出来，并显示出与其非植物对等物的高度同源性。对于其他蛋白质，由于蛋白质序列的低保守性，植物同源物的鉴定不太清楚。

结果

本文描述了第二种细胞质硫脲基酶蛋白CTU2的鉴定拟南芥．CTU2对tRNA硫代化至关重要，并与先前鉴定的拟南芥CTU1同源物ROL5相互作用。CTU2无所不在表达，但其活性似乎在根组织中特别重要。一个ctu2敲除突变体显示出根发育的改变。

结论

CTU2的分析为拟南芥中tRNA硫代化的蛋白网络增加了一个新的组成部分。CTU2对tRNA硫代化至关重要ctu2突变体无法进行tRNA修饰。鉴定的拟南芥CTU2是第一个经过实验验证的植物CTU2型蛋白，考虑到这些蛋白在植物和非植物物种之间的有限保守性，这一点很重要。基于拟南芥蛋白序列，现在可以很容易地鉴定其他植物物种的ctu2型蛋白。

翻译机制的准确性取决于转移rna (trna)的反密码子识别密码子的保真度。trna是由70-80个核苷酸组成的短RNA分子，形成明确的二级结构。已经描述了一百多种不同的rna修饰，这些修饰可能会影响它们的化学、代谢和稳定性[1]。在trna中，这种修饰可以影响密码子-反密码子复合物的形成。Lys、Glu和Gln的trna的摆动碱基(U34)上的尿嘧啶普遍被修饰为5-甲基-2-硫脲衍生物，提高了密码子读取的准确性[2]。U34硫基化的过程已经在多种生物体中得到了很好的研究，它涉及到许多蛋白质，这些蛋白质激活并最终将硫转移到U34上。在酵母中，E1连接酶样蛋白Uba4p(人类中的MOCS3)激活并硫化Urm1p(人类中的Urm1)，这是一种泛素相关修饰物(URM)蛋白，在c端甘氨酸产生硫代羧酸盐。然后，硫通过两种细胞质硫脲酶蛋白(ctu) Ncs6p和Ncs2p(在人类中分别为Ctu1和Ctu2)的活性进一步转移到靶trna的尿苷残基上[3.- - - - - -6]）.两种CTU蛋白相互作用并共享共同的基序，但只有CTU1能够结合trna。这些蛋白质中的atp结合基序pp -环表明硫转移是一个消耗能量的反应[7]。

这个过程使人想起原核生物中的硫转移反应[8但也与真核生物的泛素化系统有相似之处。在酵母和人类细胞系中，URM蛋白也被证明参与蛋白质结合，特别是在氧化应激条件下。然而，这一过程的生物学意义仍有待确定[6，9]。硫转移和蛋白质结合机制的明显保存表明这些系统之间存在进化关系[10]。参与tRNA硫代化的位点的另一个有趣的方面是，它们经常被确定为TOR(雷帕霉素靶蛋白)网络的修饰因子[11，12]，真核生物细胞生长的主要控制者[13]。由于对翻译活性的调控是TOR通路的靶标，很有可能由于缺乏tRNA硫代化而影响翻译准确性[2通过反馈机制对TOR通路产生影响。

在植物中，包括trna硫代化在内的硫转移反应的研究在以下方面得到了最好的研究拟南芥．E1连接酶样蛋白CNX5/SIR1被证明对钼酸盐的生物合成很重要[14]。CNX5/SIR1也将硫转移到URM11和URM12上，这是酵母和人类URM蛋白的拟南芥同源物[15，16]。ROL5代表拟南芥的CTU1同源物，它与URM11和URM12结合，并将URM蛋白c端硫代羧酸盐的硫基团转移到trna上。ROL5，URM11和URM12能补充相应的酵母突变体和拟南芥突变体吗ROL5，URM11,URM12基因干扰tRNA硫代化。这些数据表明URM11，URM12,ROL5对各自酵母蛋白的同源物进行编码，并且硫转移过程在拟南芥中是保守的[15- - - - - -17]。的CTU2然而，同源性到目前为止还没有确定。

在拟南芥中，突变cnx5 / sir1严重影响植物生长，反映了该蛋白在几种硫依赖过程中的地位，如钼酸盐生物合成和tRNA硫代化[14，15]。相比之下,urm11 urm12双,rol5单突变体主要影响根系生长[16]。rol5最初被鉴定为抑制根毛细胞壁形成的突变体lrx1（富含亮氨酸的重复延伸蛋白1) [17，18]。相应地,变异urm11和urm12也会导致抑制lrx1［16]。对这一观察结果的一个可能的解释是，tRNA巯基化缺陷对拟南芥TOR网络的影响。通过靶向TOR激酶的RNAi构建物或使用TOR蛋白活性的特异性抑制剂来干扰TOR信号传导，对根发育的影响与在植物中发现的相似rol5或urm11 urm12突变体(16，17，19- - - - - -21]。

本文通过实验鉴定了拟南芥细胞质硫脲酰化酶CTU2。CTU2在植物中普遍表达，是tRNA硫代化所必需的。蛋白-蛋白相互作用分析显示CTU2与拟南芥CTU1同源物ROL5结合。a的分析ctu2敲除突变体揭示了对根发育的影响，这表明trna的修饰对根发育过程尤为重要。

CTU2在不同物种间的保守性较差

基于蛋白同源性，鉴定出拟南芥潜在的CTU2同源物[TAIR, At4g35910]。拟南芥CTU2与马铃薯等远亲植物(茄属植物tuberosum)及米饭(栽培稻)分别显示43%和55%的同源性，而人类蛋白质显示约20%的相同残基(图1)1)。Dewez等。[7]发现了一些氨基酸基序，这些基序在许多物种的ctu2样蛋白中是保守的，因此可以被认为与蛋白质功能相关。这些序列在植物CTU2同源物中并不完全保守，并且在植物蛋白中保守的序列块超出了那些被确定为重要的序列(图2)1)。PP-loop基序(ctu1样蛋白中的SGGKDS)参与ATP结合[4，7，22]也存在于ctu2型蛋白中，但具有保守度较低的共识序列SGGXXS。

拟南芥CTU2同源物是tRNA硫基化所必需的

由于CTU2同源物的同源性中等，因此需要进一步的实验来证明所鉴定的蛋白是真正的拟南芥CTU2。两个ctu2从公开的种子库Salk系30197和Gabi-kat系686B10-022973中鉴定出突变等位基因，并命名为突变等位基因ctu2-1和ctu2-2,分别。的插入位置确认CTU2通过测定侧翼序列揭示了T-DNA插入ctu2-1在终止序列中，而在ctu2-2line位于起始密码子下游879 bp的第三外显子(图2)2A)评价…的表达ctu2突变等位基因，从野生型和野生型中提取mRNActu2进行突变植株和RT-PCR。只有ctu2-2未发现基因表达ctu2-1等位基因仍然产生PCR产物(图2)2B)ctu2-2等位基因用于进一步的实验。

分析…可能产生的影响ctu2-2tRNA巯基化突变，从野生型和野生型中分离到tRNActu2-2突变体幼苗，并在含有n -丙烯酰胺苯基氯化汞(APM)的聚丙烯酰胺凝胶上分离，该凝胶与硫代trna结合，产生更高分子量的复合物，凝胶中的迁移速度较慢。虽然从野生型中分离的tRNA显示出与硫代tRNA相对应的预期延迟带，但这些延迟tRNA物种在野生型中不存在ctu2-2突变体(图2C, the的补充ctu2-2带有野生型的突变体CTU2克隆产生了重组tRNA巯基化的转基因植株(图2)2B, D)。这表明所研究的基因确实参与了tRNA硫代化。

CTU2与ctu1同源物ROL5相互作用

在几种生物体中进行的不同实验证据表明，tRNA硫代化过程涉及ctu1型和ctu2型蛋白的相互作用[4，5，7]。ctu1型蛋白是tRNA硫代化所必需的，在拟南芥中由ROL5［17]。为了进一步证明所鉴定的拟南芥蛋白确实是CTU2，我们在酵母-双杂交实验中测试了与ROL5的相互作用。酵母细胞的转化ROL5和CTU2诱饵和猎物载体的cdna分别显示酵母细胞在适当的选择性培养基上生长，表明两种蛋白相互作用。此外，还观察到较强的β-半乳糖苷酶活性，证实了酵母中报告系统的激活。在含有载体的对照实验中CTU2或ROL5第二个空质粒在选择性条件下没有显示酵母的任何生长，除了CTU2或ROL5单独的自激活(图2)3.)。因此，与拟南芥的CTU1-和CTU2同源物一样，ROL5和拟议的CTU2发生蛋白-蛋白相互作用。

CTU2是否无处不在地表达并影响根架构

的表达模式CTU2,一个子:格斯构建融合构建体并转化为野生型拟南芥。在几个独立的转基因品系中对GUS活性进行了监测。在幼苗期，所有组织(根、下胚轴、莲座叶和子叶)都观察到GUS活性导致蓝色染色。同样在成年植物中，GUS染色在所有组织中都被发现(图2)4)。因此,CTU2似乎在所有组织中均匀表达，这与微阵列数据一致[23，24]。

为探讨CTU2在植物发育中的重要作用ctu2-2分析突变体的异常形态表型。幼苗在垂直方向的MS琼脂板上生长8天，与野生型相比，突变体的侧根形成减少，因此侧根密度减少(图2)5A).与野生型互补的突变系CTU2构造显示恢复到野生型侧根形成，证实ctu2-2突变导致了这种发育缺陷。因为对侧根发育的相同影响在tRNA硫代缺乏中被观察到urm11 urm12双突变体[16]， tRNA硫代缺乏rol5突变体也进行了分析。侧根形成的量化显示侧根密度降低rol5变种人甚至比在ctu2-2线(图5A)。阻断tRNA硫代化的不同突变的相似效果表明，根发育对这类tRNA修饰的变化特别敏感。

的rol5突变体最初被确定为根毛形成突变体的抑制因子lrx1［17，18]。来测试是否ctu2-2会有同样的效果吗lrx1,一个lrx1 ctu2-2产生双突变体。野生型幼苗发育正常根毛，而野生型幼苗发育正常根毛lrx1突变苗表现出先前报道的变形表型[17，18]。的lrx1 ctu2-2而双突变苗则发育出野生型样的根毛(图2)5B).不同品系的表型外显率非常高且一致。因此，也是ctu2-2突变的作用是抑制lrx1．

细菌和真核生物的trna被各种修饰改变[25]。识别Lys、Glu和Gln密码子分裂密码子盒的trna摆动位置上的尿嘧啶被普遍修饰为5-甲基-2-硫脲衍生物(xm)⁵年代²U);含有5-甲氧基羰基甲基-2-硫脲(mcm)的真核生物胞质trna⁵年代²U) (26]。硫基化过程需要许多蛋白质，这些蛋白质在不同的生物中被发现，比如酵母，秀丽隐杆线虫和人类。这些蛋白包括e1样连接酶、泛素相关修饰物和两个细胞质硫脲酰化酶(CTU)蛋白[3.- - - - - -5，7]。本文描述了第二细胞质硫脲基酶CTU2的实验鉴定。虽然根据氨基酸序列同源性可以很容易地识别出所涉及蛋白质的其他植物同源物，[14- - - - - -17]，真核生物中ctu2型蛋白的同源性水平相当低，因此需要实验证据来正确标注拟南芥同源性。拟南芥与酵母或人类的蛋白只有20%的同源性，这大大低于ctu1型蛋白之间的同源性。这些蛋白在酵母和拟南芥中(分别为Ncs6p和ROL5)具有54%相同的残基[17]。这种蛋白质序列保守性的差异表明，ctu2型蛋白比ctu1型蛋白经历了更强的分化进化。低序列同源性可能表明氨基酸的初始取代必须通过二次突变来补偿以维持蛋白质的功能，尽管低序列同源性，但导致不变的构象特征[27，28]。另外，ctu2型蛋白的功能可能在不影响其内在活性的情况下耐受蛋白质的更多变化。尽管序列同源性有限，但鉴定的蛋白质极有可能是CTU2，因为它是tRNA硫代化所必需的，并与ctu1型蛋白ROL5相互作用。CTU1-和ctu2型蛋白的相互作用已经在一些物种中得到证实[4，5]。在在体外在实验中，CTU1-CTU2复合物已被证明足以进行tRNA硫代化，即使在非常低的水平[7]。在活的有机体内然而，巯基化trna的生物学显著量的积累需要该途径的其他蛋白质成分。

CTU2似乎在大多数组织中表达，如果不是所有组织。这一结论得到了转基因植物的支持CTU2：格斯通过基因表达谱分析平台，如genevestiator [23]或浏览GenExpress可视化工具[24表明在所有组织中都有适度的表达。尽管普遍存在tRNA硫代化，但明显的突变表型ctu2-2局限于根组织。这可能与植物生长的实验室条件有关，或者与该组织对tRNA修饰变化的敏感性增加有关。

tRNA硫代化对发育过程的影响

特定trna摆动位置的硫基化对有效翻译很重要，因为它限制了碱基配对能力，防止了其他近同源密码子的误读，并影响了密码子-反密码子相互作用的热稳定性[qh]29- - - - - -31]。这种tRNA修饰缺陷的酵母和蠕虫突变体表现出温度敏感的生长表型[7]。相比之下，在某些类型的人类癌症中观察到，CTU1活性的增加与细胞生长的增加是同步的[32]。因此，tRNA硫代化水平可以对细胞活力产生实质性影响。

在酵母中，通过突变阻断tRNA硫代化Ncs6，Ncs2,或Urm1引起生长特性的变化，导致酵母细胞不能诱导假菌丝生长，而假菌丝生长是对营养受限条件的一种常见反应，目的是提高营养吸收效率[12，33]。在植物中，tRNA硫代突变ctu2-2，urm11 urm12,rol5表现出侧根密度的减少，也会影响根毛的发育，例如抑制lrx1根毛表型中lrx1 ctu2-2，Lrx1 urm11 urm12,lrx1 rol5突变体([16，17)。与酵母中的假菌丝类似，植物根系对营养吸收很重要，这表明tRNA硫代化的变化会影响非常不同生物的功能相关分化过程。不是巧合，这种相似性可能在TOR通路中有共同的基础，TOR通路感知营养可用性和生长因子，并通过影响翻译、线粒体活性或细胞骨架动力学等因素使细胞生长适应普遍条件[34]。缺乏tRNA巯基化会影响翻译活性，这可能会反馈到TOR网络[11，12]，导致发育上的改变。事实上，在拟南芥中，通过不同的方式抑制TOR信号会导致根发育减少和抑制lrx1根毛表型为rol5，urm11 urm12,ctu2-2［17，19- - - - - -21，35]。

本工作描述了CTU2蛋白的实验验证拟南芥第二种细胞质硫脲酶。拟南芥CTU1-和CTU2型蛋白之间发生蛋白-蛋白相互作用，CTU2蛋白对tRNA硫代化至关重要，这一发现进一步支持了tRNA硫代化所涉及的蛋白质机制在真核生物中是保守的。trna的硫代化不仅在生理上很重要，而且与细胞生长控制有关。因此，在未来的实验中，通过调节参与tRNA修饰的基因的表达水平来评估修饰植物生长特性和胁迫反应的潜力将是有趣的。

植物材料、生长条件和分子标记

使用的所有拟南芥系都在哥伦比亚背景中。的lrx1-1和rol5-1本研究中使用的等位基因先前已被描述[17，36]。的ctu2-1和ctu2-2等位基因分别为T-DNA插入系Salk_30197和Gabi-kat系686B10-022973。种子灭菌和植物生长按[37]。

对于突变植物的选择lrx1-1等位基因由Diet等人描述的标记检测。[36]。T-DNA插入ctu2-1用基因特异性引物检测CTU2_F.1TATGATGGATCAATGACTACTGAAG和T-DNA特异性引物SALK_LbGCGTGGACCGCTTGCTGCAACT。为ctu2-2，基因特异性引物CTU2_1050FCTCGTGTTTGTCTCCACCTGCTAA和T-DNA特异性引物Gabi_LB使用CCCATTTGGACGTGAATGTAGACAC。的CTU2输入野生型副本ctu2-1被引物放大了吗CTU2_F.1TATGATGGATCAATGACTACTGAAG和CTU2_R.1GTAGATGCTTCATTCAATTGCTC;其中之一ctu2-2被引物放大了吗CTU2_1050FCTCGTGTTTGTCTCCACCTGCTAA和CTU2_1777RCTGCCCTGCCCAGAATATGTGACG。

DNA结构

的补充ctu2-2等位基因，基因克隆CTU2用引物从哥伦比亚野生型基因组DNA中扩增出2.1 kb的启动子和0.75 kb的终止子序列CTU2_promFTGGCATACCGACTTACTAGCTTG和CTU2_TermRTCTCACCATTCTAAAGCTTTGATC并在pGEM-T easy (Promega)中克隆。正确克隆的插入被用不并克隆到植物转化载体pBART中[38]，与第27部分相同[39但它包含了一种用于植物选择的抗卡那霉素而非抗巴斯塔基因。为CTU2：格斯融合结构CTU2将启动子克隆到植物转化载体pGPTV-Bar中[40]。

对于酵母-双杂交实验，aCTU2利用引物从哥伦比亚号中扩增cDNAXba我_At4g35910_1FTCTAGAATGGCTTGTAATTCCTCAGG和Bam嗨_At4g35910_1R GGATCCTTAGACAACCTCTTCATCGT并克隆到pGAD-HA中Xba我和Bam嗨。的ROL5从先前扩增的cDNA克隆中扩增出cDNA克隆[17用引物Kpn我_At2g44270_1、GGTACCATGGAGGCCAAGAACAAGAAAGCAG和Sma我_At2g44270_1R CCCGGGTTAGAAATCCAGAGATCCACATTG并插入pLEXA_N(双系统)切割用Kpn我和Sma我。

植物转化和GUS染色

植物转化按照描述[41]，用20 mg/L的Basta选择转基因苗进行传代。GUS染色对5个独立的转基因系T2代进行GUS染色，在50 mM Na-phosphate pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100和1 mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β- d -葡萄糖醛酸中，37℃，4小时。

tRNA的提取和分析

拟南芥幼苗在半强度MS板上垂直生长14天[37]。每次提取大约使用250株幼苗。幼苗在液氮中研磨，用8 mL酸性苯酚(Sigma)、0.8 mL氯仿提取2次，用4 mL酸性苯酚、0.4 mL氯仿提取1次。提取后，按照制造商的说明，用MACHEREY NAGEL公司的AX100柱纯化tRNA。为了进行分析，纯化的tRNA在添加n -丙烯酰胺苯基氯化汞(APM)的丙烯酰胺凝胶上分离，方法改编自Björk等人。2]。

rt - pcr

野生型哥伦比亚和ctu2-2突变苗按所述生长[37]垂直放置7天。整个幼苗在液氮中冷冻，研磨，并使用SV总RNA分离系统试剂盒(Promega)提取总RNA。使用i_script试剂盒(Biorad)用900 ng总RNA进行逆转录。然后用cDNA合成反应体积的十分之一使用引物对进行RT-PCRACTIN2FAATGAGCTTCGTATTGCTCC和ACTIN2RGCACAGTGTGAGACACACC,CTU2_rt_forCTCGTGTTTGTCTCCACCTGCTAA和CTU2＿rt_revTAGACAACCTCTTCATCGTCCAAG。的ACTIN2PCR做了25个循环CTU2具有34个扩增周期的pcr。

根表型分析

采用徕卡LZ M125立体显微镜进行表型观察和GUS活性分析。竖直方向生长8天后取侧根发育数据点。采用t检验评估侧根形成差异的统计学意义。对每个品系的30多株根毛表型进行了分析。表型变异非常小，即每个基因型表现出高度一致的根毛表型。

酵母菌株和生长条件

酵母-双杂交实验酵母的转化和生长是按照制造商的说明(Dualsystems)进行的。

加入数据

本研究所用基因的加入号如下:CTU2: At4g35910;LRX1: At1g12040;ROL5: At2g44270。

MP和FJ对数据的获取做出了重大贡献，并参与了手稿的撰写。CR设计了该项目，参与了数据采集并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

我们感谢Anja Meury Bechtel提供的出色技术援助和S. Leidel博士提供的APM。这项工作得到了瑞士国家科学基金会拨款号122157和138472的支持。

作者指出

1. Florian约翰

   现在地址:Thermo Scientific, Wohlen, Switzerland

从属关系

1. 瑞士Zollikerstr 107 Zollikerstr 107大学植物生物学研究所，Zollikerstr 107, z rich, 8008

   马蒂亚斯·菲利普，弗洛里安·约翰和克里斯托弗·林利

相应的作者

对应到Christoph Ringli．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

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