缺乏vmp1的衣藻表现出严重的细胞形态异常和胞质分裂中断

背景

多功能液泡膜蛋白1 (VMP1)已在六个物种中被研究过。它已被证明在大自噬中是必不可少的，在那里它参与自噬启动。此外，VMP1参与了细胞器的生物发生;内、外、吞噬作用和蛋白质分泌;细胞凋亡;还有细胞粘附。这些作用证明了它在人类胰腺炎、糖尿病和癌症中的作用。

结果

在这项研究中，我们分析了一个来自绿藻的VMP1同源物衣藻reinhardtii．CrVMP1敲除系表现出严重的表型，主要影响细胞分裂以及细胞和细胞器的形态。我们还提供了一些有关其参与巨自噬的证据。

结论

我们的研究为VMP1基因库增加了一个新的角色，即调节细胞质分裂。虽然所观察到的影响的直接性和它们背后的机制仍有待定义，但蛋白质在巨自噬中的参与在1990年衣藻，表明CrVMP1与其动物和原生生物的对应分子具有相同的分子特征。

VMP1(液泡膜蛋白1)是一种跨膜蛋白，在所有真核生物王国中都有同源物，真菌是一个显著的例外。它已被证明位于几个细胞区室:高尔基体[1]、内质网[1，2]，自噬体[3.]，而质膜[4］．它涉及一系列细胞过程:细胞器生物发生、内、外、吞噬作用和蛋白质分泌[2];细胞凋亡(1];粘连(4];也许，最值得注意的是，宏观自噬(以下简称“自噬”);［3.])，以及一种特殊类型的自噬，即酶噬，其中酶原颗粒-含有非活性消化酶的亚细胞结构-被选择性降解[5］．最后但并非最不重要的是，它已被证明在某些人类疾病中发挥关键作用，即胰腺炎[1，6]、糖尿病[7]，以及几种癌症[4，8，9］．VMP1参与的表型和过程正逐渐在分子水平上被阐明:例如，它的质膜定位和细胞粘附能力解释了它在转移癌细胞中的表达降低[4]，因为失去黏附对转移至关重要[10];它在酶噬中的作用有助于在胰腺炎期间保护胰腺细胞不消化自己[5］．

在这项工作中，我们在绿藻中发现了一个VMP1同源体(从今以后命名为CrVMP1)衣藻reinhardtii．的部分静音CrVMP1基因导致严重的表型，主要影响细胞分裂和形态。到目前为止，其他生物中的VMP1突变体从未表现出与这两个细胞方面有关的任何有害影响，这引发了关于蛋白质在各种真核生物王国中作用的进化的好奇问题。

CrVMP1

CrVMP1(Cre06.g272000)是该家族中唯一的成员衣藻reinhardtii基因组——与大多数被研究的生物相似VMP1，与两个公里基因的拟南芥作为一个显著的例外[11］．该蛋白的编码基因位于6号染色体上，在长度、序列和结构上与其六个报道的同源体相似(图2)1A、B)。正如TMHMM所预测的那样，CrVMP1被预测拥有4到6个跨膜结构域[12]， TMPred [13]， minnou [14]和弗比乌斯[15]，以及两个线圈结构域，正如线圈[16]，后者通常表示蛋白质-蛋白质相互作用。此外，在蛋白中心预测了一个111-aa snare相关的高尔基结构域(图1D).至于亚细胞定位的预测，六种不同的算法产生了高度模糊的，有时相互矛盾的结果:几乎每一个可能的细胞间隔作为CrVMP1定位的候选细胞- ER，高尔基体，质膜，类囊体膜和各种液泡(数据未显示)。CrVMP1在其c端有RKXX基序，这使其成为ER定位的有力候选者[17］．

VMP1敲低细胞表现出严重的表型

我们使用人工miRNA [18，19试图保持沉默CrVMP1．两个c . reinhardtii用于沉默的菌株:CC-4350，更广为人知的是cw15 302，一种细胞壁缺乏的菌株，显示出高转化效率;UVM11是CC-4350的衍生物，经过紫外线诱变以增强其表达外源基因的能力[20.］．我们分析了CrVMP1利用qRT-PCR检测我们系的mRNA水平。在转化克隆中，mRNA水平差异很大;我们在实验中使用的所有克隆体都展出了CrVMP1mRNA水平在WT和空载体对照的5-25%之间。

我们首先对突变体进行了微观分析。所有敲除系都显示出一系列显著的、严重的表型(图2而且3.)．突变表型的标志是胞质分裂缺陷。在这些细胞中，分裂以一种异常的方式进行，导致子细胞异常地连接在一起，通常有可见的分裂沟(图2L B, C,我;数字3.D, F, J, K)。

此外，通常同时，细胞表现出异常的细胞器数量。所讨论的细胞器是类芘(图3.C,H)和眼点(图2E, G, H, K;数字3.B,C,E,G)，我们的许多敲除细胞有两个或两个以上的可收缩液泡(相比之下，WT细胞中只有一个pyrenoid和一个眼斑)2C,我;数字3.C, D, E, F;击倒中有两对或两对以上，WT中有一对)和核(图3.L;击倒2次，WT 1次)。用DNA荧光染料4'，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞，然后用荧光显微镜检测后者(图3.L)。双核细胞很难被误认为是正常有丝分裂的WT细胞:细胞核位置异常，细胞完全圆形，没有卵裂沟，最后，图像拍摄的时间点几乎没有细胞有丝分裂，表明双核细胞是前一轮分裂后几个小时的残余。

在亮场显微镜下，每个细胞经常容易发现多个类芘。然而，在epifluorescence显微镜下，许多在brightfield下看起来正常且其类芘数很难从视觉上确定的细胞，通常会通过红色自发荧光叶绿体中心的特征腔显示它们确实含有两个类芘(图3.M)。细胞核、类细胞核、眼斑和cv数量异常再次提示胞质分裂缺陷。

我们的许多突变细胞显示出异常的细胞形状和内部结构。前者的细胞不能保持WT通常的圆形或椭圆形的外部形状c . reinhardtii，而是以令人印象深刻的各种不规则形状出现(图2E, F, I, J, K)。在具有异常内部特征的细胞中，通常的结构和细胞器是WT的标志c . reinhardtii特别是杯状的叶绿体出现了变形和畸形(图2而且3.)．我们假设细胞质分裂缺陷再次是罪魁祸首，因为细胞器发育不良和未分离的子细胞相互压迫导致畸形。然而，这需要进一步调查。

最后，两种额外的表型偶尔出现:一小部分细胞高度空泡化，可能是细胞死亡的迹象(图2B).更罕见的是，细胞充满了大量的球状物，认为任何细胞器都无法识别(图3.后一种表型也出现在WT细胞中，尽管比突变体少得多。

上述表型均出现在菌株CC-4350和UVM11中，前者倾向于严重畸形，后者倾向于较温和的wt样细胞形态，具有双类核和核。在qRT-PCR介导的残留mRNA水平与表型强度之间没有观察到相关性。外显率从未达到100%;观察到显示异常表型的细胞比例有很大差异。我们发现生长条件(温度、光照强度和环境、震动速度、碳源、培养年龄)与外显率没有相关性。虽然CrVMP1可能潜在地参与细胞周期，因此在周期的不同阶段表达不同，但我们没有发现表型强度或表达量的差异CrVMP1定期检测mRNA水平，试图捕捉代表性阶段(数据未显示)。较温和的表型，如双类核和核，有时出现在高达90%的细胞中，而极端畸形显示约20%的外显率(附加文件)1:表S1)。我们假设较低的外显率是一些表型的低可见性、单个细胞的细胞周期阶段的影响以及随机效应的综合结果。

尽管存在细胞动力学缺陷，我们的突变体在生长上并没有明显的迟滞。突变体液体培养略有增长，但不显著，更慢，一段时间后总是达到WT细胞密度(数据未显示)，表明大多数突变细胞最终成功地进行了细胞质分裂。此外，我们的突变体在CV或渗透调节方面没有表现出缺陷，正如vmp1缺陷的黏菌所报道的那样[2］．为了验证这一点，将细胞浸泡在纯水中并孵育数小时，WT和突变体显示出相似的存活率(数据未显示)。顺便说一下，在我们的图像中清晰可见的cv经常帮助我们定位在更严重变形的细胞内，其中的细胞器和细胞极性几乎无法识别(例如，图2B, F,我;数字3.D、E、我)。

电子显微镜显示内部细胞缺陷

接下来，我们将我们的突变体(仅在菌株UVM11中)进行透射电子显微镜(TEM)分析。所得到的图像显示了许多不规则的现象，并与我们的光学显微镜观察相一致:许多细胞显示有缺陷的胞质分裂和怪诞的细胞形态(图4)．许多内部缺陷，大多是在光学显微镜下偶然发现的，在透射电镜下被发现。突变细胞经常有变形和错位的细胞核(图4)．高尔基体异常多:每个细胞3-4个(图5C,E)，相比之下，WT几乎总是一个(尽管很多c . reinhardtii菌株通常表现出两个装置，我们的UVM11细胞很少有)。在许多情况下，高尔基似乎变形了(图5C，最低设备)。突变体线粒体过大，运动区域比WT线粒体大3倍，嵴明显扩张(图5D). WT和突变体中均可见大量液泡;在突变体中，它们几乎总是空的(图4而且5)，相比之下，在WT中，它们通常含有电子致密物质，可能是膜质和细胞质颗粒(图5A).这些含有物质的液泡很可能是自溶酶体，突变体中它们的缺失可能表明自噬存在缺陷。突变体叶绿体形态紊乱畸形，有大量突起(图4）;堆积的类囊体膜(在WT中总是可见于叶绿体内的暗线;数字5A)，在突变体中通常不存在或弱得多。最后，突变体似乎比WT积累了更多的淀粉颗粒，有些颗粒过大(图)4而且5)．为了测试WT和突变体之间的淀粉含量是否确实不同，我们在12小时的光照期结束时(淀粉水平达到峰值)和黑暗期结束时(大多数淀粉被降解)进行了酶淀粉定量。我们观察到WT和突变体在淀粉含量方面没有显著差异(附加文件)2:图S1)。

几种细胞周期和自噬调节因子在VMP1突变体中低表达

鉴于显微表型指向有缺陷的细胞分裂，我们试图检测细胞周期的几个关键调控因子在突变体中的表达。此外，VMP1强烈参与细胞凋亡[1]和人类的自噬[3.]及黏菌[21]导致我们检测了几种自噬标记物的表达，以及参与蛋白质降解的基因。转录水平是异质性的，有几个基因保留了wt样的表达水平，而其他基因在敲低中表现出显著的，有时是极端的下调(图6)．三种细胞周期调控因子RCC1(染色体凝结调控因子)、CYN20-3(亲环蛋白家族)和CYCA1(周期蛋白依赖蛋白激酶调控因子)的mRNA敲低水平均低于WT的15%(图6A).两个基因的产物参与蛋白质降解，形成amp的泛素连接酶UBC4还有天冬氨酸蛋白酶ASP1，在WT的20%以下的突变体中表达(图6C).值得注意的是，突变体中两个关键的自噬相关基因下调:ATG8(称为LC3在哺乳动物中)，其产物是一种已建立的自噬标记c . reinhardtii［22),而ATG6，其人类同源物编码一种蛋白beclin-1，可与人类VMP1相互作用[3.)(图6B).最后，我们检测了孢子囊素的表达，孢子囊素是细胞质分裂后促进女儿细胞孵化的营养细胞壁溶解酶[23］．孢子囊素基因在WT的40-50%的敲低中一致表达(图6B).综上所述，这些结果表明VMP1水平降低导致细胞周期和自噬的几个关键调控因子表达不足，进而导致细胞质分裂缺陷，并初步降低自噬能力。

代谢组学分析揭示了突变体的额外变化

为了更全面地了解突变体中发生的变化，我们对细胞进行了定量代谢组学分析。采用气相色谱-质谱(GC-MS)和超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)测定代谢物。所有分析均显示WT/空载体对照和突变体之间存在显著和一致的差异，由主成分分析判断(附加文件)3.:图S2)。所有检测到的代谢物均用于PCA制备，而以下结果中仅显示了安全标注的代谢物)。GC-MS分析结果显示，与空载体对照相比，13种代谢物显示敲除显著变化(图7A)，而UPLC-MS分析导致许多脂质显示水平变化(图7B;有关数值和统计数据，请参阅附加文件4:表S2)。最值得注意的是突变体中甘油三酰酯(TAG)的明显积累，这是一种无处不在的储存脂类物质。其他脂类的一致性较低，但仍有意义:大多数检测到二酰基甘油三甲基高丝氨酸(DGTS)脂类，它取代磷脂酰胆碱c . reinhardtii而大多数以膜脂为主的双半乳糖基二酰甘油(DGDG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)在WT中的含量均高于突变体。

VMP1曾在植物中被研究过(答:芥；［11])和微生物(d . discoideum；［2])，而现在:在一个两者兼有的物种中。在这项工作中，我们能够赋予这种已经多才多艺的蛋白质一个新的角色。到目前为止，尚未发现VMP1与细胞分裂缺陷有关。与此同时，有相当数量的细胞质分裂突变体衣藻据报道[25］．有些是天然分离物[26]，其他由非特异性突变产生和鉴定[27]，而另一些则是有针对性的沉默的结果[28- - - - - -30.］．在后三个例子中，分别沉默了基底体、细胞骨架和鞭毛的蛋白质。事实上，这三种结构与细胞分裂密切相关;以前被认为是完全不同的鞭挞和劈沟形成过程，正在逐渐失去它们之间的边界，与这些结构相关的蛋白质通常表现出多种作用。在我们的突变体中，关于细胞骨架、基体和鞭毛的推断不多。至于后者，我们的背景衣藻菌株CC-4350和UVM11的鞭毛很短;在显微镜下通常观察不到鞭毛，突变体的鞭毛比WT的鞭毛更多，但我们不可能确定这是由于VMP1缺陷还是由于能见度有限。

我们敲除细胞中的另一个细胞器是眼斑(图2而且3.)．据报道，在WT培养中经常可以看到一些带有两个眼点的细胞。也曾报道过拥有多个眼点的真正突变体(以及眼点异常小的突变体和根本没有眼点的突变体)[31］．我们的突变细胞明显不同:除了拥有多个眼点外，它们几乎总是表现出细胞分裂缺陷(卵裂沟、变形的叶绿体);他们缺乏mlt1⁻典型的:通常在鞭毛基部附近有一个正确放置的眼点和一个额外的、不正常放置的眼点的特征[31］．

电镜观察发现突变体中线粒体增大，叶绿体无序，WT中自溶酶体增多，突变体中无，高尔基体数量过剩，可能畸形，淀粉粒过大(图)4而且5)．后两种现象是相互关联的:当植物的高尔基系统受到抑制或破坏时，植物倾向于积累淀粉[32］．然而，声称这种情况在我们的突变体中是没有根据的:我们的EM图像不允许明确定义高尔基体在我们细胞中的健康与否。也就是说，在我们的突变体中高尔基体数量的增加(图5C,E)再次指向异常。同样适用于淀粉:酶定量显示WT和突变体之间的淀粉含量没有差异(附加文件2:图S1)，我们的EM图像不允许对淀粉颗粒的数量和大小进行统计分析。因此，我们表型的这一方面仍然是轶事，需要进一步研究。VMP1和高尔基体之间的连接衣藻将与前者同系物中的观察结果相对应:在第一个VMP1研究中，VMP1被证明定位于高尔基体[1]， vmp1缺陷黏菌表现出形态学和功能性高尔基缺陷[2］．

VMP1已多次被证明是自噬的诱导物，其起作用的分子机制正逐渐被阐明[33］．研究表明，VMP1是一种多跨膜蛋白，它被锚定在ER膜上，对于自噬体的形成至关重要，因为siRNA-VMP1敲低的细胞即使在诱导自噬的条件下，如饥饿和雷帕霉素处理，也很难形成任何自噬体[3.］．自噬，尽管被广泛研究和讨论——尽管主要是在动物身上——仍然有许多未知;更是如此衣藻，该课题尚处于起步阶段[22］．在我们的研究中，我们初步表明，自噬可能被下调衣藻VMP1敲低细胞(值得注意的是，在我们的实验中，自噬从未被主动诱导。在我们的WT细胞中观察到的自噬现象代表了基础自噬，可能与轻微的、无意识的营养剥夺相结合，作为培养年龄的功能)。关于观察到的自噬标记物的低表达(图6B)，我们感兴趣地确定了VMP1在人类中的相互作用伙伴，beclin-1(在酵母中称为ATG6)，是我们敲除的下调基因之一。VMP1-beclin-1相互作用在人体内被证明是诱导自噬的必要条件[3.］．我们有兴趣测试细胞中beclin-1水平对VMP1水平的调节适应是否导致了前者在我们的突变体中的水平下降。

透射电镜以自溶酶体的形式提供了自噬受损的进一步证据，这些自溶酶体在WT中存在，但在突变体中几乎不存在(图)4而且5)，以及突变体中线粒体严重增大(图5D).研究表明，自噬被抑制会导致大鼠成肌细胞中线粒体的增大[34］．在健康细胞中，线粒体经常发生裂变，但由于未知原因，有一小部分不能这样做。这些较大的、未分裂的线粒体可能被自噬(更准确地说:自噬)机制所排斥，因为自噬体吞噬大细胞器比吞噬小细胞器需要更多的能量。这种情况因自噬受损而加剧，例如发生在场景细胞中或发生在自噬的实验抑制中:通过自噬对较大线粒体的清除进一步减少，很快它们就成为大多数[35］．活性氧含量的增加会导致线粒体的增大和损伤。36从而进一步破坏自噬机制。

从透射电镜图像中可以看到，淀粉的积累也可能是自噬中断的标志:在三种人类遗传疾病中，糖原(淀粉的动物对应物)的异常积累——拉福拉病[37]、庞贝病[38]和达农病[39] -具有有害的病理生理学，在引用的研究中已被证明是自噬受损的结果。最近和相关的，自噬中断/抑制导致淀粉积累在叶片拟南芥而且烟草benthamiana［40］．事实上，当酶定量时，在我们的突变体中没有发现过多的淀粉(附加文件)2:图S1);然而，过大颗粒中淀粉的积累不一定与细胞中淀粉含量的整体增加相对应。我们的最后一个证据反映在我们的脂质组分析结果中(图7B)，据此，我们的突变体中TAGs的积累可能归因于自噬缺陷[41]，根据引用的研究，这是缺陷自噬体减少标签水解的结果。我们在其他类脂类中观察到的变化也可能与自噬有关，特别是在构成自噬体和自溶酶体膜的脂类中。在我们检测到的6种磷脂酰乙醇胺(PE)中，有4种在突变体中减少(2种显著减少，2种轻微减少)，1种不变，1种在突变体中积累。PE是参与自噬体形成初始阶段的主要脂质，它与ATG8结合[42］．然而，从中得出的结论必须是试探性的:尚不清楚自噬体的缺乏或过多如何影响细胞中PE的总体水平;它也不知道其他脂类是自噬体和自溶酶体的主要成分。顺便提一下，PE也被证明是细胞质分裂所必需的:缺乏PE的中国仓鼠卵巢细胞表现出严重的细胞质分裂缺陷[43］．

为了对我们的突变体的自噬能力提供更明确的结论，还需要进一步的实验:ATG8作为自噬标志物更好地用于其Western-blot而不是其qRT-PCR版本;此外，许多原因可以解释TAGs的积累，确实是许多生物的共同应激反应;我们观察到的细胞积累和自噬缺陷之间的直接联系仍然需要建立。在这方面，我们的结果似乎与一些研究相矛盾，这些研究表明大量的TAG和淀粉积累发生在氮剥夺中衣藻伴有非常明显的自噬[44］．如果TAG和淀粉积累与自噬密切相关，为什么我们在自噬受损的细胞中观察到前两种现象?我们假设，在引用和其他研究中报道的影响，确实是氮饥饿的先决条件，这是一种戏剧性的冲击，迫使细胞降解蛋白质，以补充其氨基酸储备，这是通过自噬的方式。基础自噬，比如我们的实验，可能表现不同。如上所述，辛格等人。[41]的研究发现，自噬中断导致大鼠和小鼠体内TAG的积累，相反，诱导自噬导致TAG水平下降。这已经在衣藻同时:应用自噬抑制剂3-甲基ladenine可导致TAG在缺氮细胞和对照细胞中积累[45]，据此，笔者认为TAG在缺氮细胞中的积累可能不是自噬的直接结果。

另一个观察结合了我们的显微镜图像和脂质组分析。我们的一小部分细胞显示高度球状表型(图3.K).这也发生在WT中，但在VMP1敲除中更为频繁。这些细胞非常类似于氮剥夺后的脂体积累细胞，见Goodson等。[46］．据推测，氮的剥夺发生在我们的一小部分培养物中，导致大量脂质体的积累，顺便说一句，这些脂质体主要含有tag(应该注意的是，这种培养物从未用于任何其他实验)。事实上，这种情况在VMP1敲除中更频繁地发生，这加强了我们的分析分析所介导的TAG积累的发现，并再次与Wang等人报告的发现相矛盾，如果我们的细胞中自噬确实受到了损害。[44］．

我们的研究结果与其他生物中VMP1参与自噬的观察结果一致，但也表明迄今为止尚未报道的参与细胞分裂的情况。有趣的是，尽管不同的VMP1同源物之间具有相对较高的序列守恒性，但CrVMP1占据了一个不同于其他六个报道的同源物的系统发育分支(图1C)，似乎它的序列发散是其在衣藻．也就是说，我们突变表型的两个特征，细胞分裂缺陷和自噬缺陷，可能彼此紧密相连。最近的两份报告提供了这种联系。在第一种研究中，抑制自噬导致人类细胞胞质分裂失败、多核化和非整倍体[47］．根据这份报告，细胞使用自噬来维持RhoA的正确水平，RhoA是一种小的GTPase蛋白，对细胞质分裂至关重要。第二篇报告显示，在饥饿、非整倍体、异常有丝分裂和生长不足的条件下，酵母结果中的自噬受到抑制[48］．磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)提供了细胞质分裂和VMP1在自噬中的特定作用之间更直接的联系。这种脂质在自噬体前位点的合成对自噬体的形成至关重要，并由pi3激酶III类酶介导，该酶与VMP1等形成复合物[49］．PI3K-III已被证明可以形成调节胞质分裂的复合物，并且与自噬相关的PI3K-III复合物非常相似。PI3K-III复合物各组分下调导致胞质分裂受损[50，51］．因此，在我们的突变体中，细胞分裂可能是由于自噬受损而被抑制的，其中VMP1缺陷是上述损伤的唯一原因;或者VMP1缺陷以更直接的方式导致胞质分裂缺陷，可能是通过PI3K-III复合物的破坏。到目前为止，VMP1在人类癌症中的强烈参与，这种疾病的标志是细胞分裂出错，已被证明是蛋白质在细胞粘附中的作用的结果[4]和自噬[52，53］．我们的结果可能指向VMP1在细胞分裂中更直接的作用。

在本研究中，我们产生了vmp1缺陷衣藻随后发现了VMP1的新作用和一个参与VMP1的新基因衣藻细胞分裂和自噬。缺乏crvmp1的细胞胞质分裂中断，形态异常。细胞生物学和生化证据表明自噬受损:突变细胞积累甘油三酯并形成膨大的淀粉粒;它们缺乏自溶酶体，但WT细胞有很多;他们显示线粒体增大。此外，突变体在细胞周期调节和自噬中的几个关键基因表达不足。

菌种及培养

的cell-wall-deficientc . reinhardtii菌株CC-4350 (cw15 302)和UVM11 [20.]被用于这项研究。细胞在三乙酸磷酸盐(TAP)培养基中生长[54]，光照强度为85 μmol/m，培养温度为22℃²/秒，同时以125转/分震动，并且，除非另有说明，在持续光照下。用TAP和1.5%琼脂制备生长板。

生成VMP1击倒线

基因沉默由amiRNA执行，如所述[18］．简单地说，通过向在线WMD3工具提交标识符187038生成了以下一对寡核苷酸[55) (http://wmd3.weigelworld.org/): ctagtttgaggtagaggatctttatctcgcaccatggggggggggtgatcagcgctattgagggatcctacctcaag和ctagcttgaggtagaggatccctcaatagcgctgatcaccacccccatggtgccccaccccattgaaagagattcctacctcaaa。寡核苷酸彼此退火，然后连接到pChlamiRNA2和pChlamiRNA3int载体的SpeI酶切位点。利用玻璃微珠将载体线性化，分别转化为CC-4350和UVM11细胞[56］．通过精氨酸增强对CC-4350进行转化子选择，通过帕洛姆霉素对UVM11进行转化子选择。

qRT-PCR检测基因表达

使用通用RNA纯化试剂盒(Roboklon, Berlin, Germany)分离总RNA。cDNA合成使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific, Schwerte, Germany)，使用1 mg总RNA进行。qRT-PCR反应使用SYBR Green主混合(应用生物科学，达姆施塔特，德国)，并在HT 7900循环仪上进行(应用生物科学，达姆施塔特，德国)。泛素和RACK1被同时用作内参基因。相对表达值用2^——ΔΔCt方法(57］．引物使用QuantPrime设计[58］．用于检测的引物VMP1mRNA是TGACGGACTGAGTTGGAAAGGC和GAGCTAGAGGCTTCTTGCGTTG。所有其他引物都列在附加文件中5:表S3。

显微镜

在Olympus (Hamburg, Germany) BX-51型油浸× 100物镜上使用Nomarski光学系统进行光学和荧光显微镜检查。按所述方法准备细胞进行检查[59］．对于透射电子显微镜，衣藻细胞在0.1 M碳酸钙酸钠缓冲液(pH 7.4)中，4℃，2% (v/v)戊二醛固定3 h。然后将样品固定并在1% (w/v) OsO中渗透1小时₄．然后在2% (w/v)醋酸铀酰中染色2小时，在50、75、95和100%乙醇中逐步脱水，然后在100%环氧丙烷中洗涤两次。样品被埋入Spurr的低熔点环氧树脂中。样品在60°C下脱气并固化24小时。切片(50 nm)用Leica UC 6超微显微仪(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)获得，安装在200目的镍网上，用醋酸铀和柠檬酸铅进行反染色，并在80 kV (Zeiss, Oberkochen, Germany)下用能量过滤透射电子显微镜(EFTEM)进行检查。

酶促淀粉定量

淀粉定量方法如下所述[60］．简要:液体衣藻培养物离心，液氮冷冻，80% (v/v)乙醇重悬，超声处理。匀浆加热至80°C，离心，然后冻干。球团用水清洗，然后在0.2 N KOH中重悬，加热至95°C 1小时。加入1 N醋酸，样品离心。将上清液与淀粉葡萄糖苷酶混合，在55℃下孵育过夜。然后根据Stitt等人对葡萄糖进行酶定量。[61］．

代谢组学分析

气相色谱和质谱(GC-MS)分析如所述[62］．简单地说:从每个菌株中提取6个生物重复进行GC-MS分析。使用TargetSearch软件包测定代谢物水平[63］．将代谢物的保留指数(+/−2 s)和光谱(相似度> 85%)与Golm代谢组数据库(GMD [64])。次级代谢物和脂质提取和分析，如所述[65]使用Waters Acquity超高效液相色谱(UPLC)耦合到thermofisher Exactive傅里叶变换质谱仪。使用Xcalibur (thermofisher，不来梅，德国)和Refiner MS (GeneData，巴塞尔，瑞士)对获得的原始色谱图进行处理。峰值标注使用本地开发的GoBioSpace数据库[65］．峰值强度归一化到总离子计数。

我们感谢Eugenia Maximova， Änne Eckart, Antje Bolze和Gudrun Wolter的出色技术援助，以及Tamar Avin-Wittenberg, Michael Schroda, André Scheffel和Sabeeha Merchant的宝贵科学讨论。我们感谢勃兰登堡州投资银行(ILB)的资金支持(项目编号80139585)。

从属关系

1. 生物化学与生物研究所，植物生理学系，Universität波茨坦，波茨坦，德国

   Hezi Tenenboim和Martin Steup

2. 马克斯普朗克分子植物生理学研究所，Am Mühlenberg 1，波茨坦，14476，德国

   Hezi Tenenboim, Julia Smirnova, Lothar Willmitzer和Yariv Brotman

相应的作者

对应到Hezi Tenenboim．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

HT计划并完成了大部分实验，并撰写了手稿。JS做了一些实验。MS, LW和YB监督了这项研究。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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