农杆菌衍生的细胞分裂素影响烟叶质体形态和淀粉积累

背景

根癌土壤杆菌基于瞬态分析已经成为回答细胞背景下蛋白质定位和基因表达相关问题的常用工具。这些检测的使用假设瞬时转化细胞是在相对真实的生理条件下观察到的，并保持“正常”的亚细胞行为。虽然这一前提被广泛接受，细胞组织和细胞器形态是否改变的问题农杆菌属-浸润细胞尚未被详细检查。亚细胞环境改变的第一个迹象来自于我们的观察，一种常见的实验室菌株GV3101(pMP90)导致频闪频率急剧增加。基质，或“充满基质的小管”从质体表面发出，对各种生物和非生物胁迫敏感。从这一观察开始，我们实验的目标是进一步表征短期细菌感染引起的细胞变化，并确定引起这些变化的因素。

结果

使用一种典型的瞬时测定方法，我们评估了GV3101(pMP90)浸润对植物叶绿体行为和形态的影响烟草benthamiana。我们的实验证实GV3101(pMP90)持续诱导基质并改变质体相对于细胞核的位置。这些效应被发现是细胞分裂素的菌株依赖性分泌及其在植物组织中的积累的结果。研究发现，细菌产生的这种激素依赖于a的存在反式玉米素合成酶基因(tz)位于GV3101(pMP90)的Ti质粒上。细菌来源的细胞分裂素也与可溶性糖水平和淀粉积累的变化有关。

结论

虽然我们选择的重点是如何短暂农杆菌属侵染改变了质体的基本参数，这些对单个细胞器形态和位置的改变，结合测量到的糖和淀粉含量的增加，表明细胞生理学的全局变化。这表明在短暂检测中可见的细胞可能不像以前假设的那样“正常”。我们的研究结果表明，细菌的影响可以通过选择最小化农杆菌属缺乏tz基因，但改变亚细胞组织和细胞碳水化合物状态不能完全避免使用这种策略。

土壤传播的细菌根癌土壤杆菌是各种植物的冠瘿病的病因。毒性的抗质粒农菌株是细菌感染过程中肿瘤诱导所必需的。该质粒的一个独特部分(T-DNA)被切除并通过IV型分泌装置转移到植物细胞中，然后被运送到细胞核中，最终插入植物基因组中。转移的野生型T-DNA编码基因，迫使转化的植物细胞合成植物激素生长素和细胞分裂素以及氨基酸-糖偶联物(opines)。由此产生的植物组织中生长素和细胞分裂素水平的增加诱导细胞增殖，导致肿瘤形成。仅由转化细胞产生的意见被利用农作为碳和氮的来源。产生的意见类型用于对传染性进行分类农菌株如八爪菌、诺帕林菌或agropine型菌株(见[1- - - - - -4])。

去除野生型ti质粒的T-DNA区域产生的细菌菌株不再能够刺激植物细胞中肿瘤的形成或opine的产生。取代野生型的肿瘤诱导型T-DNA，已经设计并利用位于二元T-DNA载体上的修饰T-DNA有效地介导基因向植物细胞的转移(综述于[1，5])。将感兴趣的基因转移到植物基因组而不诱导肿瘤的能力使这种“解除武装”农对植物基因技术有重要价值的菌株(见[2，4，6])。

今天农通常用于生物技术或研究目的产生转基因植物系。然而，建立转基因品系的过程是耗时的，并且对于一些应用来说，不是强制性的。的使用农在瞬时测定提供了一个节省时间的替代产生稳定的转基因植物。在大多数试验中，“解除武装”农含有兴趣结构的悬浮液渗透到叶组织中。暴露于细菌的细胞随后转化为感兴趣的序列，并可以在浸润后几天检测表达。这种植物细胞转化方法通常优于粒子轰击，因为它引入的序列拷贝较少，重排频率较低(参见[7])。基于它们的高转化效率烟草和烟草benthamiana通常用于农介导的瞬时表达。

虽然渗透n .烟草和n benthamiana与“缴械”农造成看似微小的宏观影响[8]，但越来越多的证据表明，即使是“解除武装”的菌株也能被它们识别出来烟草作为病原体的物种，病原体相关的反应可以干扰瞬时基因表达测定[8，9]。虽然这些相互作用的机制尚不清楚，但它清楚地表明，使用农在暂态系统中是有限制的。这种检测的使用是基于这样的假设，即表达感兴趣基因的植物细胞保持真实的亚细胞行为。然而，除了提到的效果农在病原体相关反应方面，细菌对细胞生物学其他方面的影响，如蛋白质定位、细胞器运动和细胞器形态，尚未得到详细的研究或报道。在使用“解除武装”实验室菌株GV3101(pMP90)的标准瞬态分析期间，我们很明显农确实能对细胞器形态有明显的影响吗n benthamiana。具体来说，我们观察到这种菌株的浸润导致从质体表面发出的充满基质的小管(基质)的形成增加，并且似乎改变了质体相对于细胞核的位置[10]。

冲孔直径约为0.1至0.8 μm(参见[11])，长度从几μm到45 μm不等[12]。它们是所有质体类型的共同形态特征，在维管植物和非维管植物(单子叶植物、双子叶植物、苔藓和绿藻)中都有观察到(参见[13])，表明这些结构在Viridiplantae进化。众所周知，间质在某些发育阶段形成，当植物暴露于各种胁迫(生物和非生物)时，这些突起的频率会升高(参见[14])。虽然这表明间质支持植物细胞应对不利条件，但具体的亚细胞功能仍然是推测的。

基于基质形成对胁迫的敏感性，我们将我们最初的观察结果解释为GV3101(pMP90)诱导基质作为短期侵染诱导潜在亚细胞变化的第一个指示农在瞬态分析期间。我们的目标是确定引起观察到的变化的特定启动子，从而更好地理解“解除武装”的菌株如何改变亚细胞环境n benthamiana，同时深入了解频闪形成现象。

我们的研究结果证实GV3101(pMP90)可靠地诱导基质，此外，我们还观察到细菌浸润后质体相对于细胞核位置的变化。GV3101(pMP90)诱导的这些变化是菌株特异性的，并且被发现依赖于ti质粒特异性的存在trans-zeatin合酶基因(tz)。此外，我们证明，在短暂的实验中，细菌产生的细胞分裂素足以改变细胞的生理状态，增加可溶性糖水平和淀粉积累，这可以通过使用替代的“解除武装”菌株来部分避免。

研究…的影响农利用转基因技术对质体行为和形态进行浸润n benthamiana组成性表达嵌合蛋白FNR-EGFP的细胞系，突出了质体间质和间质[15，16]。利用这些稳定的转基因品系的效果农通过荧光显微镜对浸润组织和非浸润组织的比较，可以很容易地估计浸润情况。为了简化对结果的描述，我们为所有使用的细菌菌株分配了首字母缩略词，并将其列在表中1以及它们的抗生素耐药性。

GVR的浸润诱导基质形成和质体重新定位

“缴械”农压力,全球之声3101(pMP90)(缩写-)全球之声) [17]在本研究中被采用，因为它广泛用于基因的瞬时表达n benthamiana。的转换活动农,用二值载体pCP60-35S-DsRed2转化GV，得到GV3101(pMP90)/pCP60-35S-DsRed2(简称-)GVR)。该载体促进了未标记的DsRed2 [10]。浸润3 d后，DsRed2在浸润区以明亮的荧光信号在细胞质和核质中检测到，表明报告基因成功转移和表达农(附加文件1:图S1C)。相比之下，使用相同或更灵敏的显微镜设置，未浸润区域的细胞未显示任何荧光信号(附加文件)1:图SD和S1F)。我n the leaves of FNR-EGFP transgenic plants the plastids are clearly highlighted by the EGFP fluorescence. Following infiltration with GVR there were drastic alterations to plastid morphology and plastid position when compared to untreated tissue. The most obvious difference following GVR treatment was the large number of stromules compared to the control (Figure1一个和1B)。gvr侵染叶片区域的平均频变频率(SF)约为53%，显著高于未侵染组织的3%(图2)1C)。

GVR浸润细胞基质形态也发生改变。在非浸润组织中有大量的短间质，大部分在3 ~ 5 μm范围内，只有极少数超过10 μm。与此相反，在暴露于GVR的细胞中，50%的基质长度为5 μm或更高，最大长度约为27 μm(图2)1D)。除了表现出较长的基质外，还经常观察到弯曲和分枝的基质(图2)1B).这些分支起源于沿“主基质小管”的三角形扩张，在早期的出版物中有描述[16，18]。

我们还观察到，在许多gvr浸润的细胞中，一个质体亚群聚集在细胞核周围(图2)1B)与未经处理的组织形成对比，在未经处理的组织中，质体大部分被观察到是均匀分布对的一部分(图2)1为了量化这个参数，我们计算了与单个细胞核相关的质体的数量，我们将其命名为“Plastid -N暗室一个ssociation我ndex”(PNAI)。通过在gvr浸润组织核质中积累DsRed2标记细胞核，而在未处理的组织中，在DAPI中孵育10分钟后检测细胞核。框图如图所示1E清楚地显示，GVR处理后，靠近细胞核的质体数量显著增加，从PNAI中位数为2(最小为1;在未经治疗的区域，PNAI的中位数为5(最小为1;最多18个)。

我们最初的实验证实了之前的观察，即选择的菌株，GVR，引起频闪频率的剧烈变化。在之前进行的对照实验中[10]，浸润本身和用于增溶细菌的农杆菌浸润介质(AIM)均被排除为基质诱导刺激，这表明诱导因素极有可能来自细菌。第二组实验的目标是确定负责这些“基质诱导”亚细胞环境变化的细菌因素。

报告蛋白的表达对GVR浸润后观察到的变化没有影响

在稳定和瞬态系统中，蛋白质的过度表达有可能干扰正常的细胞代谢和细胞器行为[19- - - - - -21]。为了检验报告蛋白的过表达是否导致了所观察到的效果，利用缺乏pCP60-DsRed2 T-DNA载体的GV重复浸润实验。作为阳性对照，我们也将GVR渗透到相同的叶片中。GV和gvr浸润组织显示出相当水平的基质诱导，与未处理区域相比，两种处理的SF值都显著更高(图2)1F)。stromule长度也无显著差异(图2)1G)，或PNAI值(图2)1H)。与gvr浸润组织一样，GV浸润导致质体更倾向于与细胞核结合(PNAI中位数为4，最小值为1;最大9)，与未处理的细胞相比(图1这些结果表明DsRed2的瞬时表达不是GVR诱导变化的原因，但证实了stromule诱导的来源是细菌自身固有的。GV是nopaline野生型菌株C58的解除武装衍生物，C58是许多解除武装实验室菌株的亲本分离物(见[5])。我们用不同的方法重复实验农实验室菌株，源自不同的野生型分离物。

LBA和LBR的浸润对质体形态和位置的改变程度不如GV和GVR

为了评价这种诱导能力是C58衍生菌株所特有的，还是更可能是C58衍生菌株的一般特征农，我们转变了磅A4404与pCP60-35S-DsREd2(缩写-LBR)，并按照GVR的概述重复实验。LBA4404(缩写-)LBA)是为数不多的从章鱼野生型Ach5衍生出来的“解除武装”实验室菌株之一，Ach5是一种不同于C58的野生型分离物(见[5])。此外，为了排除报告蛋白过度表达对表型的影响，我们还浸润了未转化的LBA。再次将GVR渗透到同一叶片中，作为stromule诱导的阳性对照。我n comparison to GV and GVR, LBA and LBR-infiltrated tissue had significantly fewer stromules, and cells looked much like non-infiltrated cells (Figure2一个,2B和2然而，LBA和LBR处理后观察到的基质略长，但明显长于未浸润组织(中位数分别为2.11和2.58 μm)(中位数分别为1.86 μm)，但仍短于GVR处理后的基质(中位数为3.68 μm)(图2)2PNAI结果非常相似(图2)2G)。与未处理的组织相比，在两种LBA处理中，细胞核周围的质体聚集更频繁(图2)2C和2值得注意的是，lbr浸润组织的PNAI与GVR治疗组无显著差异(图2)2G)。

SF测量清楚地表明，GV和GVR对基质的强烈诱导是特异性的，而LBA和LBR菌株对基质的诱导不是特异性的。然而，LBA和LBR的浸润仍然对各自的组织有影响，这反映在基质长度和PNAI上。根据所选参数，这表明LBA和LBR的存在也会改变细胞生理，但程度低于GV和GVR。与LBA和LBR浸润相比，GV和GVR浸润对基质诱导和质体重定位的影响更强，这表明它们是由于细菌染色体的差异或在这些菌株中存在的解除ti质粒的差异。

gvr浸润组织表现出细胞分裂素升高的症状

浸渍后观察到的另一个现象与浸渍后叶组织的衰老有关，在浸渍后约6周，可以检测到叶组织变黄。gvr浸润组织维持为绿色岛状(图2)2H)以一种让人想起文献中描述的细胞分裂素治疗的方式(参见[22])。AIM缓冲液和LBR浸润效果不明显。虽然GVR治疗延缓了组织衰老，但LBR浸润实际上导致了组织过早变黄，在某些情况下甚至从浸润点开始坏死(图2)2H). AIM浸润既没有导致绿岛的形成，也没有导致过早衰老(数据未显示)。GVR诱导绿岛形成的能力表明细胞分裂素可能在被这种特殊菌株浸润的组织中积累。

用细胞分裂素处理烟草细胞培养物后的另一种现象是质体中淀粉的明显和立即积累，如碘染色所示[23，24]。浸润3天后用碘染色法分析GVR和lbr浸润组织中淀粉的积累。结果显示，gvr浸润区域的染色比周围未浸润组织深，表明淀粉积累水平高(图2)2淀粉染色的表皮细胞显微镜显示，这种积累也发生在下表皮细胞中，并不局限于叶肉组织(数据未显示)。对先前实验中拍摄的荧光图像的重新评估显示，淀粉积累在GVR中可见，在GV处理中，在质体基质中的EGFP和叶绿素荧光无区可见(数据未显示)。在大多数情况下，lba浸润区域与未浸润的叶组织难以区分。在少数病例中，LBR浸润的染色略深于周围组织(图2)2与LBA处理的低积累相比，GVR和GV中淀粉的积累明显，这表明GVR和GV浸润后特异性诱导了细胞分裂素的积累，并且这种影响并非普遍存在于所有处理农菌株。

已知细胞分裂素参与源-库关系的调节。除了改变淀粉的积累，这也可以通过可溶性糖水平的变化来反映[25，26]。为了测试可溶性糖水平是否受到农处理后，测定GVR、LBR、AIM及未浸润组织中葡萄糖、蔗糖浓度(图2)2我和2J).与未浸润组织(~3 μmol g)相比，AIM浸润不会引起糖浓度的显著变化¹FW葡萄糖和~ 10 μmol g¹与未浸润组织相比，AIM处理后FW蔗糖含量为~ 2 μmol g¹FW葡萄糖和~ 10 μmol g¹弗兰克-威廉姆斯蔗糖)。与AIM浸润相比，LBR和GVR均诱导葡萄糖和蔗糖浓度明显显著升高。LBR浸润使葡萄糖浓度增加5倍(5.8 μmol g)¹葡萄糖)，蔗糖含量增加4倍(37.7 μmol g)¹弗兰克-威廉姆斯蔗糖)。GVR浸润诱导可溶性糖增加较多，葡萄糖浓度增加5.5倍(8.3 μmol g)¹葡萄糖)和蔗糖浓度增加了7倍(94.46 μmol g)¹弗兰克-威廉姆斯蔗糖)。正如已经看到的，对于其他参数，GVR诱导的葡萄糖和蔗糖积累比LBR更严重。比较这两个农越来越明显的是，GV和GVR菌株比LBA和LBR引起更严重的生理变化。

治疗后的GVR不能诱导基质形成、质体重新定位和细胞分裂素相关效应

为了评估GV和LBA菌株之间可能导致观察到的生理效应的差异，我们对它们的亲本进行了回顾。GV菌株的ti质粒pMP90是C58分离物的ti -C58的衍生物[5]。这个质粒携带一个基因反式-玉米素合成接近梵-基因区域，但在缺失的T-DNA区域之外tz基因(27]。这表明它可能是反式-玉米素在浸渍区积累。以消除细菌的来源衍生反式-zeatin，我们将其ti质粒(pMP90)的GVR耗尽，并对其进行浸润全球之声3101年c变种(缩写GVC，并用菌落编号标记)转化为叶组织。然后我们评估了这些菌株诱导GVR中观察到的效应的能力。确实，淀粉染色和绿岛试验(图2)3.E和3.F)揭示了GVC菌株失去了诱导明显淀粉积累的能力，并且在衰老过程中没有观察到“绿岛”。这表明在GVR观察到的治疗区域产生和维持高细胞分裂素水平的能力下降。对三个单独固化的GVC品系进行了分析。GVC处理组织的显微镜检查显示，在所有病例中，频闪频率明显低于GVR阳性对照浸润(图2)3.A)。GVR阳性对照的浸润导致基质频率约为35-40%，显著高于GVC菌株浸润后的7-14%基质诱导率和未处理组织的5%基质诱导率(图2)3.B)。所有固化菌株诱导的基质少于15%，即相对于未处理菌株，基质频率的增加相对较小(图2)3.B)，与LBA和LBR处理的SF值范围相同(图2)2E)。Stromule长度和PNAI结果显示了处理之间的相似关系，GVR对变化有明显的诱导作用，三株GVC菌株与未浸润条件相当(图2)3.C和3.D)。

利用淀粉积累和“绿岛”的存在作为细胞分裂素活性的指标，可以得出结论，pMP90和pMP90的损失tzGVC菌株中的基因导致细胞分裂素水平急剧降低。这种减少伴随着GVC对量化质体参数的影响急剧降低，与LBR处理相当。这表明GVR诱导效应确实是由pMP90 ti质粒上编码的基因产物引起的。此外，这表明GVR基因组对观察到的反应的贡献可以忽略不计。

在LBA中加入tzs有利于质体形态的改变，增加淀粉的积累

专门测试参与的tz基因(pMP90质粒中编码的一个基因)上调细胞分裂素指标和基于质体的参数，我们测试了将该基因添加到LBA中是否会导致功能、GVR/ gv样表型的增加。的tz从GV中克隆出基因(编码区加上上下游约2kb)，插入到小的二值载体pLSU中[28]，同时去除T-DNA边界和两者之间的序列，以避免dna的转移tz从GV渗透到工厂。然后将该载体转化为LBA，随后的4个转化子(简称LtZ1-4)渗透到FNR-GFP植物中。与NI和LBR菌株相比，所有4株菌株的频密频率都显著增加，频密频率在39% ~ 51%之间(图2)4A)。与GVR对照(LtZ1、ltz2和ltz4)相比，4株菌株中有3株的SF无显著差异。LtZ1-4浸润的组织中位基质长度显著高于NI和LBR对照，但显著低于GVR(图2)4尽管在细胞核周围的质体聚集是明显的，而且常常是极端的(见图2)4C)，我们无法使用DAPI染色或DIC可靠地定位细胞核，因此我们无法量化PNAI。ltz浸润区域的淀粉染色强度与GVR相当，并且与GVR处理一样保持在浸润区域内(图2)4D)。

测量浸润组织中细胞分裂素的积累

到目前为止，浸润后植物组织中细胞分裂素的增加已经通过淀粉染色和绿岛的维持来表明。为了量化叶片组织内细胞分裂素产生的菌株依赖差异，采用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)直接测量反式-玉米，还有反式-zeatin-9-riboside(图4E和4F).两种激素的测量趋势相同。AIM(浸润缓冲液)、GVC7和LBR浸润组织的细胞分裂素水平均低于0.2 ng/g (反式-玉米素)和0.1 ng/g (反式-玉米蛋白-9-核糖体)，而GVR和LtZ浸润的细胞分裂素积累至少增加了三倍(图2)4E和4F).有趣的是，ltz浸润组织反式-玉米素含量大约高出3倍反式-玉米蛋白-9-核苷水平约为gvr浸润组织的9倍。

细胞分裂素浸润的组织与GV、GVR和LtZ浸润的组织相似

作为细胞分裂素积累和基质诱导之间存在因果关系的最终证据，即使在没有所有细菌因素的情况下，我们也用这种激素渗透植物，以测试我们是否可以模拟GVR处理所观察到的效果。为此，我们用100 μg ml浸润组织¹的反式-玉米素，连续三天服用三次。100 μg ml¹还检测了激动素，以确定基质诱导和质体重新定位是否特异性反式或者如果这是由于细胞分裂素引起的一般变化。此外，还浸润了一种对照溶液，以确保多次浸润的应力不会诱发基质。在每种细胞分裂素3次浸润和恢复期2天后，我们观察到，在这两种情况下，基质频率都增加了(图2)5A).平均频闪频率约为23.4%反式-zeatin和38.6%，明显高于NaOH对照组浸润组织，但明显低于GVR阳性对照组，接近60%。激素处理也以与细菌处理相似的方式改变了基质长度，与对照处理相比，基质长度出现了小幅但显著的增加(图2)5B).与GV、GVR和LtZ菌株浸润的组织一样，在反式-玉米素和动蛋白处理(图5E和5F)，但DAPI染色的效率仍然很低，因此PNAI无法量化。淀粉也以一种让人联想到GV浸润的方式积累，尽管染色不像细菌处理后那样深(图2)5C和5D)。虽然我们在叶片的有限区域渗透(如图所示)5C和5D(虚线)深色淀粉染色不局限于浸润区域，而是向邻近组织扩散，提示激素扩散。在某些情况下，这影响了未渗透的对照样本(图2)5C)解释了控制处理中频闪频率高于平均值的原因。

3倍浸润的动蛋白和反式-玉米素被用来抵消植物对细胞分裂素的潜在降解，这是在100 μg ml的单次浸润后怀疑的¹导致2-3天后淀粉积累和基质诱导不一致(数据未显示)。为了尽量减少激素降解的影响，使用合成的细胞分裂素6-苄基氨基嘌呤(BAP)进行单次浸润。外源应用时，这种激素的分解速度比其他细胞分裂素慢得多，在浸润6周后仍可在植物组织中检测到[29]。梯度为1 μg ml¹， 10 μg ml¹， 50 μg ml¹100 μg ml¹观察BAP浸润组织，观察频变频率。除1 μg ml外，其余浓度均显著诱导基质形成¹，与对照入渗相当(图2)5H). 100 μg ml¹bap浸润组织的平均SF值为45%，与浸润后3天评估的GV和GVR的SF相当(比较图2)5H到数字1C,2E,3.B,4A)。质体也在细胞核周围形成簇状(图2)5G)和广泛的淀粉染色(图5I)，类似于激素浸润后的观察和处理tz含有细菌菌株的虽然细菌浸润后引起的生理症状不那么严重，但细胞分裂素的直接浸润似乎能够模仿细菌的作用tz表达的农。

基质是在广泛的生物和非生物胁迫下诱导的，根据我们之前的观察，基质的数量随着GVR的渗入而增加n benthamiana叶组织[10]，我们怀疑这种表型可能表明细胞在农杆菌属-介导的瞬时测定。在瞬态分析(OD)的典型条件下₆₀₀= 0.8，浸润后2-3天显微镜观察)我们证实了先前报道的GV3101 (pMP90) (GV)诱导基质，并发现GV触发质体位置和淀粉积累的改变。使用瞬时测定法假设观察到的细胞表现出真实的亚细胞行为，但叶绿体形态、位置和碳水化合物含量的这些显著变化表明，假设为“正常”的细胞实际上可能与未浸润的邻近组织有很大不同。确定导致这种细胞变化的“诱导剂”对于理解瞬时系统中GV对植物生理的影响程度至关重要。根据观察，浸润组织表现出细胞分裂素增加的特征症状，如衰老期间形成绿岛和淀粉积累增加，我们进行了实验，以确定这是否是导致所观察到的质体相关变化的“诱导”剂。

农杆菌菌株依赖的细胞分裂素分泌与基质诱导和淀粉积累有关

野生型农已知菌株含有细胞分裂素合成基因，这些基因与T-DNA一起转移到植物细胞中，迫使转化的细胞产生细胞分裂素。在解除野蛮人武装的过程中农将诱导肿瘤的T-DNA从野生型ti质粒中去除，从而去除细菌诱导植物产生细胞分裂素的能力。然而,一些农菌株，如C58 (GV的野生型祖先)，能够特异性地分泌大量的细胞分裂素反式-玉米素，即使在没有植物细胞的情况下，也可以进入培养基(浓度高达35 μM，由[30.])。细胞分裂素在培养中的积累被发现是激活的直接结果tz（trans-zeatin合酶基因[30.]是一种异戊烯基转移酶(IPT)基因，位于野生型T-DNA边界之外，非常接近梵Ti质粒区域[30.，31]。的tz在创建解除武装的ti质粒pMP90期间，基因未被移除[17] GV的港湾[32]。GV细胞浸润后在叶组织中存活超过两周的能力[9]，再加上我们观察到浸润组织出现了强烈的生理症状，特征是细胞分裂素水平高(图2)2H和2K)，表明GV也是植物组织中浸润后数天内细胞分裂素的恒定和重要来源。为了支持这一假设，LC-MS/MS测量表明反式-玉米蛋白在gv浸润组织中的表达(图4E)。

与GV相反，我们发现LBA (LBA4404)是一种章鱼菌株，它不会诱导相同水平的淀粉积累(图2)2K)，绿岛表型(图2)2H)，或两者的任何显著增加反式-玉米蛋白或其核苷(图4E,4F).这与先前发表的数据一致，这些数据表明，章鱼菌株缺乏这种蛋白质tz基因在它们的质粒上，因此不能分泌高水平的反式-玉米栽培[30.，32]。

证据支持的作用tz产生负责改变质体参数的“诱导剂”的基因来自我们对GV的处理，这导致细胞分裂素指标和基质诱导的急剧下降。更明确的证据证明了两者之间的因果关系tz衍生细胞分裂素和基质诱导来源于克隆tz转化为pLSU，转化为LBA。由此产生的菌株(LtZ1-4)增加了基质频率，基质长度和暗淀粉染色，使人联想到GV和GVR浸润。此外，所有这些症状都与两者的增加有关反式-玉米蛋白及其核糖体内浸润组织，证实克隆tz基因是功能性的。添加单个基因后，LBA的“功能获得”表型，tz，定义了该基因在细菌衍生的细胞分裂素的产生以及细胞的重大变化中的作用。

在建立因果关系之后tz通过LtZ菌株的产生，细胞分裂素本身与观察到的效应之间的因果关系是通过三种不同的细胞分裂素直接浸润建立的。反式-玉米蛋白，动蛋白和BAP。浸润的细胞分裂素被发现影响质体形态和淀粉的积累，但我们的能力产生的变化程度与诱导的相同tz包含农菌株是有限的。对此，我们提出了几种可能的解释。首先，很难评估在我们的渗透中应该使用什么浓度的激素，因为很难确定细菌产生的细胞分裂素的数量，从而在植物组织中引起给定的反应。农在感染期间锚定在植物细胞壁上[33]，而固定化细菌分泌的细胞分裂素可能导致细胞分裂素的高度局部积累和植物组织内激素的不均匀分布。此外，游离基细胞分裂素(如反式-玉米素)优先在叶绿体中积累，导致激素在细胞水平上的分布不均匀，进一步阻碍了确定其作用点浓度的能力[34]。因此，虽然我们测量全叶匀浆的方法提供了一个很好的初步估计反式-玉米素诱导的A.tumefaciens，它可能导致低估细胞分裂素的绝对数量，以引起观察到的植物生理变化。我们在试图直接渗透激素时面临的第二个问题是单一的渗透反式玉米素或激动素不一致地诱导基质或淀粉染色，提示它们可能失活。细胞分裂素氧化酶，重要的细胞分裂素灭活剂[35]，实际上是由于激素本身的存在而被上调的[35，36这意味着在细胞分裂素的渗透下，我们可以同时触发它们的失活。第三个问题是渗入的激素可能扩散出渗透区，这可以从渗入叶片的大量淀粉染色中看出(图2)5C,5D和51).这可能导致浸润区激素浓度降低，也使我们无法控制浸润区激素的量。虽然我们不能阻止激素扩散，但我们已经使用BAP作为替代反式-渗透中的玉米素和动蛋白，由于对降解的抵抗力增强[29]。BAP梯度显示单次浸润，浓度低至10 μg ml¹仅在浸润后2天就能显著诱导stromule(图5H).应该注意的是反式- Powell等人在C58培养物的上清液中测定玉米素[30.]与该值相当(35 μM = 7.67 μg ml)¹)。增加激素浓度(1-100 μ ml)¹)导致基质数量相应增加，从而将激素与质体体中这些突起的形成联系起来。

的表达式tz基因增加了多种细胞分裂素种类的丰度

多次渗透与纯反式-玉米素表明这种激素足以模拟tz通过细菌表达并诱导质体形态和位置的改变。然而，重要的是要注意tz已知基因会增加其他细胞分裂素的丰度[37]，这也会影响所测质体参数。的tz基因产物对HMBDP和HMBDP均具有特异性的催化活性反式-玉米蛋白型细胞分裂素)和DMAPP (ip型细胞分裂素的前体)底物，这意味着该酶能够在多种细胞分裂素生物合成途径中起作用，产生多种细胞分裂素[37]。C58的克隆tz基因植入大肠杆菌随后对分泌到培养液中的细胞分裂素的测量表明，尽管增加了反式其中-玉米蛋白最明显(11 ngL)¹之前tz增加到19,900 ngL¹添加后)，也有增加iso-五烯腺嘌呤(iP)型细胞分裂素(120 ~ 8700 ngL)¹），反式-核糖素(<1 ~ 236 ng / l¹),iso-五烯腺苷(iPA)型(25 ~ 85 ngL)¹)细胞分裂素[27]。细胞对不同物种的敏感性似乎在很大程度上取决于存在的细胞分裂素受体的配体偏好[38，39]。基于拟南芥和玉米，似乎iP和反式-玉米是最受欢迎的[38，39的敏感性n benthamiana受体是未知的。因此，虽然我们可以说细胞分裂素正在改变质体的形态，但在这一点上，我们不能进一步推测是哪个产物tz基因对测量参数的影响最大。

暴露在tz衍生的细胞分裂素改变细胞的生理机能

我们的实验证实GV和其他tz当浸润到叶组织时，含有细胞分裂素的菌株是大量细胞分裂素的恒定来源，这是在相对较短的瞬时测定时间内观察到质体形态变化的原因。先前的研究也观察到暴露于细胞分裂素升高后叶绿体结构的变化。例如，晶体或“变形虫样”形态的形成是过度表达细胞分裂素合成基因的稳定转基因烟草叶片中质体的特征[34，40]。虽然我们从未观察到晶体，但对“变形虫样”质体结构的描述让人想起我们对单个质体体产生多个基质的观察。由此看来，虽然植物暴露于tz-衍生的细胞分裂素在瞬态分析系统中被限制在几天内，由这种短暴露引发的生理变化是显著的，足以以类似于长期暴露的方式有利于质体膜的改变。

我们已经证明，基于gv的瞬时测定的短时间也足以诱导碳水化合物含量的变化，如浸润组织中淀粉和可溶性糖(蔗糖和葡萄糖)含量的增加所示。这一发现与文献报道相一致，文献报道暗示细胞分裂素参与组织碳水化合物状态和碳水化合物分配的调节，从而影响组织的源/汇状态(参见[25，26，41])。这表明，在一个典型的瞬态试验中tz衍生的细胞分裂素可能足以将碳水化合物状态的组织从来源转变为吸收。

在被认为是碳水化合物汇的组织中经常观察到基质的形成[42]。这一观点得到了Schattat和Klösgen [43]，结果表明，外源性葡萄糖和蔗糖处理诱导了拟南芥上叶表皮。这可能表明，观察到的stromule诱导是可溶性糖水平升高的结果tz细胞分裂素。然而，相比之下答:芥然而，可溶性糖的增加与频闪频率的增加并没有明显的相关性。尽管没有tz在LBR中，可溶性糖显著增加，而与未浸润处理相比，基质频率只有非常小的变化(图2)2E,2我和2J).尽管糖水平升高在gvr浸润组织中更为明显，但糖升高与细胞质形态改变之间存在直接联系n benthamiana还有待确定。

质体的重新定位似乎与基质的形成无关

在测量糖时观察到的LBR的中间表型也在测量PNAI时观察到。与基质诱导相反，在缺乏基质的菌株中，质体向细胞核的重新定位并未完全消除tz基因(LBR或GVC)，导致中间或gv样表型(图2)2G).质体靠近细胞核和基质的发生率经常被讨论，好像这两种现象在功能上是相关的[44- - - - - -46]。然而，在细胞分裂之前，已经可靠地观察到在细胞核周围聚集的质体，这被认为是为了确保无偏的细胞器遗传[47]，这种现象可能与基质的形成无关。人们早就知道，用极少量的外源性细胞分裂素(1ug L¹)能够在烟草组织培养中诱导细胞分裂[48]。我们发现单次治疗反式-玉米素(100mg ml¹)诱导质体可靠地聚集在细胞核周围(数据未显示)，这种治疗方法不能可靠地诱导间质，这表明质体的位置似乎与间质形成无关，可能对激素更敏感。PNAI对细胞分裂素的高敏感性可以解释在一些LBA和治愈治疗中质体与细胞核的频繁关联，这种关联与低水平的基质诱导有关。

基质诱导、淀粉积累和质体重新定位是否与病原体相关?

我们的实验并不是第一个阐明解除武装效果的实验农浸润叶组织上的菌株。在另外两项侧重于植物与病原体相互作用的研究中，发现用标准解除武装的实验室菌株(包括GV3101(pMP90))浸润烟草会干扰随后的烟草花叶病毒(TMV)感染两(8，9]。除了减轻感染症状外，"解除武装"的渗透农杆菌属菌株改变病原菌应答基因PR-1(病原菌相关1)的表达，诱导黄化，抑制叶片扩张，降低ABA水平和SA的产生p .两(8，9]。被ti质粒固化的细胞引起的这些反应程度与原始菌株几乎相同，这使得两项研究的作者得出结论，这些与病原体相关的反应与ti质粒编码的基因产物无关[8，9]。与这些与ti质粒无关的表型相反，我们发现基质形成、质体重新定位和淀粉积累高度依赖于ti质粒衍生的细胞分裂素。尽管我们不能排除这一点农杆菌属衍生的因素可能在一定程度上调节这些过程的诱导，事实上，我们能够模拟的渗透tz用激素溶液孵育细菌表明，其他细菌来源的因素对于诱导观察到的反应不是必需的。因此，似乎最有可能的是，基质的形成不是病原体特异性细胞反应的结果。

评价农杆菌介导的瞬时测定法

GV是一种受青睐的实验室菌株，可能是由于其高转化效率。在大多数方案中，细菌的OD值被调整为0.8，正如我们在实验中所做的那样，然而，已经发现较低的密度可以产生足够的转基因表达[49]。这导致了一种假设，即在基于gv的实验中降低细菌的浓度可能会减少这种特定菌株的不利影响，同时保持足够数量的瞬时基因表达。利用基质的诱导作为细胞分裂素积累的“生物指标”，我们简要地测试了是否存在GVR浓度，我们观察到转基因，但没有观察到基质。初步结果表明，即使在一个外径₆₀₀值为0.01时，在极少量DsRed2检测的情况下，GVR在入渗3天后仍能诱导SF值接近30%(数据未显示)。这表明，尽管细菌数量急剧减少，细胞分裂素仍然积累到足以引起质体变化的水平。以基质为指标，进一步验证该策略在高表达、稳定的转基因产物中的可行性。这可能允许将OD降低到不再诱导基质的水平，但维持蛋白质的可见性。

降低细菌产生的细胞分裂素影响的另一种策略是，一旦检测到转基因表达，就通过分析组织来限制暴露时间。然而，在拟南芥揭示了细胞分裂素对基因表达和蛋白质组的影响是广泛而直接的[50- - - - - -52]。例如，用5 μM外源细胞分裂素处理幼苗会导致82个基因的差异表达[50]和96种蛋白质在头15分钟内的差异调节[52]。大多数蛋白定位于叶绿体(52%)，但其他蛋白预计定位于细胞壁、细胞质、内质网、细胞核、线粒体和液泡[qh]52]。尽管这些反应必须经过评估n benthemiana在瞬态实验的背景下，似乎即使短期暴露于低水平的激素也有可能影响多个细胞区室的组成，并且细菌来源的细胞分裂素在瞬态分析中的影响可能比最初假设的要广泛得多。

除了改变渗透和分析协议的参数外，一个明显的解决方案是使用an农那是缺乏张力的tz基因。因此LBA菌株，缺乏tz基因，可能更适合在瞬态系统中使用。然而，即使是这种菌株也会引起叶绿体形态、位置和可溶性糖水平的微弱变化。这很可能是由于额外的细胞分裂素种类的积累。nopaline(例如GV和GVR)和octopine农菌株(如LBA和LBR)分泌iP，即使在去除ti质粒后，这两种菌株仍继续产生这种细胞分裂素[31]。虽然我们的数据表明，最大的影响农是菌株依赖性分泌的结果吗tz在解释瞬时检测结果时，不应忽视细胞分裂素和其他细菌因素。这里观察到的不同细菌菌株的不同影响突出了需要适当的控制来评估每种细菌菌株对观察过程的影响。

这是不可否认的农杆菌属-介导的瞬时检测为研究活细胞中的蛋白质定位和基因表达提供了有价值的工具。然而，在这些实验中观察到的细胞是否代表“正常”细胞一直受到质疑。我们已经报道了叶绿体形状、位置和碳水化合物状态的剧烈变化是细菌向植物组织分泌细胞分裂素的菌株依赖性的结果。虽然我们只研究了瞬态的影响农侵染在一个细胞器上，改变质体形状和淀粉含量表明对整个细胞的生理影响。我们强调设计适当的控制来测试细菌对观察结构的影响的重要性，以及在可能的情况下通过产生稳定的转基因系来确认瞬态检测结果。

植物材料和生长条件

植物材料在短日条件下(光照8 h /黑暗16 h)，温度约为。20°C(白天和晚上)，光照强度约为。120 μE m²。在土壤上生长的4至6周的植物的第三或第四片叶子上进行渗透。用于转基因质体和基质形态的可视化n benthamiana使用表达基质靶向eGFP的细胞系(参见[10]);中描述的嵌合FNR-EGFP15]。为了排除观察到的效应是由于T-DNA插入转基因植物基因组的某个区域引起的可能性，所有实验都在三个独立的转基因品系(FNR-EGFP_7-25;FNR-EGFP_6-24;FNR-EGFP_3-20)源于独立的转化事件。

菌株和培养

农杆菌属用于实验的菌株列于表中1。两个GV [17]及LBA [53]，通过电穿孔转化(Bio-Rad，大肠杆菌T-DNA载体pCP60-35S-DsRed2来源(见[10]。该载体含有35s启动子驱动的表达盒，表达无标记的DsRed2，并赋予细菌对卡那霉素的抗性。农菌株在YEB琼脂板或YEB液体培养基上按[54]，分别给予抗生素(利福平100 μg ml-1;庆大霉素20 μg ml-1;卡那霉素100 μg ml-1;链霉素100 μg ml-1) (Duchefa Biochemie, Haarlem，荷兰)。

固化GV3101 (pMP90)

为了治愈农菌株GV3101(pMP90)的ti质粒(pMP90)基于Engler等人描述的方法的改进方案。[55]被使用。为了治疗GVR，我们在37°C的YEB板上培养单菌落条纹，培养5天。盘子中含有卡那霉素和利福平。庆大霉素耐药是由ti质粒指定的，因此不包括在培养基中，从而消除了保留质粒的压力(表中对菌株抗生素耐药性的总结)1)。为了选择成熟的GV3101(不含pMP90)，选择30个单菌落转移到两个不同抗生素组合的平板上，一个是卡那霉素/利福平，另一个是卡那霉素/利福平/庆大霉素，并在室温下生长。7天后，30个采摘的菌落中有12个在含有庆大霉素的平板上没有生长，表明可能固化，其中3个在补充的附加文件中显示1图S1A。在这12株中，有4株被检测存在tz(附加文件1:图S1B)tz基因(附加文件)2:表1)。nptIII基因特异性引物(附加文件)2pCP60-35S-DsRed2作为阳性PCR对照(附加文件)1:图S1B)，因为该载体在固化过程中应该被保留(引物来自Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany)。作为额外的检查，其中三个被选为渗透n benthamiana共聚焦显微镜下筛选下表皮DsRed2的表达。治愈系可能缺乏Ti质粒上的毒力基因，不能促进植物中DsRed2的表达(附加文件)1:图S1E和S1G)。

从GV克隆tzs并转化为LBA

一个4.3 kb的片段，包括tz使用专为RF克隆设计的引物扩增了上游约2kb和下游约1.7 kb的编码区(描述由[56])将片段转化为pLSU二值向量(tz4 kb_plsu_f: gctagcgcgcggacaagctaggattggctcaggcagcttcgcagcgaaac,tz4 kb_plsu_r: ttgagacacaacgtggatctaattgctgatagaggagaccagagtaactt)。RF克隆后转化DH5α，选择含卡那霉素的LB，分离4个不同菌落的DNA，转化为LBA。通过PCR检测耐药LBA菌落的存在tz使用内部引物tz编码区域(参见附加文件)2:表1)。

农杆菌在拟南芥叶片中的渗透

浸润按照标准瞬态表达协议进行。将1 ml的细菌“过夜”培养物制成颗粒，重新悬浮，并在含有浸润介质(AIM由10 mM MgCl组成)的乙酰丁香酮(Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)中孵育₂5 mM MES pH 5,3(均来自Roth, Karlruhe, Germany)和150 μM acetosyringone)。孵育2 h后，将悬浮液的光密度调整为OD_600海里= 0.8。单独AIM(缓冲控制)和农菌株在6 ~ 8周龄时渗透到第三或第四叶的底部n benthamiana不用注射器的植物。为了更好地比较不同叶片中独立浸渍的结果，我们用对照浸渍了一半叶片，用处理浸渍了另一半叶片。48-72小时后，采集浸润区域的叶盘和未浸润的对照，用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察下叶表皮。

显微镜染色和组织准备

染色细胞核n benthamiana，叶片在20 μM DAPI (Roth, Karlsruhe, Germany)中孵育10分钟。

为了可视化淀粉，从植物上取下叶子，放在含有100%乙醇的培养皿中(罗斯，卡尔斯鲁厄，德国)，在室温下过夜去染。一旦完全漂白，叶子用水冲洗，并加入6毫升碘(罗斯，卡尔斯鲁厄，德国)染色淀粉。30分钟- 1小时后，将染色的叶片冲洗干净，在室温下将叶片悬浮在水中4-5小时，去除多余的污渍。

蔗糖和葡萄糖浓度的测定

对于非浸润、缓冲浸润(AIM)以及细菌浸润组织的葡萄糖和蔗糖测量，按照前面描述的方法进行处理。对于生物和实验重复3个叶片(3^{理查德·道金斯}， 4^th和5^th)。每片叶子的一半被AIM浸润，另一半不处理或被其中一种细菌菌株浸润。48小时后，收获叶片并在液氮中冷冻。蔗糖和葡萄糖的定量按照[57]。

细胞分裂素的测量

冷冻植物物料用MM301 (Retsch, Haan, Germany)混合机以25 s的频率均质成细粉¹50秒用一个5毫米直径的钢珠在2毫升埃彭多夫管。所得粉末用200 μl甲醇提取，其中[²H₅]反式-玉米和[²H₅]反式-玉米蛋白9-核苷(OlChemIm Ltd.)奥洛穆茨，捷克共和国)作为内部标准。强力震荡20 min后，10000 g离心2次，离心5 min，最终上清用800 μl甲酸水溶液(2% v/v)稀释，固相萃取(SPE)。将干燥的hr - xc树脂(Macherey-Nagel, d ren, Germany)分散到96孔过滤板的孔中(每孔50 mg)，制备SPE 96孔板。树脂用1ml甲醇和1ml水进行调节。在此及所有后续步骤中，液体在Avanti J-26XP离心机(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)中使用JS5.3摆动转子以250 × g离心5分钟通过树脂。样品上样后，用1ml水清洗树脂，然后用1ml甲醇清洗树脂，用0.35 M nhh洗脱树脂₄甲醇中的OH放入96深孔板(Roth, Karlsruhe, Germany)。洗脱液转移到2ml Eppendorf管中，溶剂在45°C (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)的Savant SC210A Speed Vac浓缩器中真空蒸发。将干渣用40 μl 10% (v/v)甲醇溶解。用40 μl水稀释，10000 g离心10 min后，将样品转移到自动进样瓶中进行LC-MS/MS分析。

分离柱为Nucleoshell RP18 (50 × 3 mm，粒径2.7 μm;(machery - nagel, d ren, Germany)在30°C下使用Agilent 1290 Infinity HPLC系统。洗脱液A和B分别为水和乙腈，各含0.2% (v/v)乙酸。在2% B初始保持0.5分钟后，在3分钟内将B的百分比增加到28%，在0.5分钟内进一步增加到98%，然后在98% B等压1.5分钟。在接下来的0.5分钟内恢复启动条件，并允许柱在2% B下重新平衡1分钟，流速设置为0.5 ml/min。采用API 3200三重四极柱LC-MS/MS系统，配备ESI Turbo Ion Spray接口，在正离子模式下运行(AB Sciex, Darmstadt，德国)，通过ESI-MS/MS在线检测分析物。离子源参数设置为:幕气50psi，离子喷雾电压3500v，离子源温度650℃，雾化气70psi，干燥气50psi。在多反应监测模式(MRM)下获得三重四极杆扫描，Q1和Q3设置为“单位”分辨率。预定MRM以90秒的窗口和0.1秒的目标扫描时间进行。所选的MRM转换和化合物特定参数在补充附加文件中给出3.表S2。

使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex, Darmstadt, Germany)的IntelliQuant算法自动计算峰面积，必要时进行手动调整。所有后续计算均使用Excel (Microsoft Office Professional Plus 2010)进行。激素采用内标定量。

激素治疗

的原液反式-玉米蛋白和动蛋白(均来自荷兰哈勒姆的Duchefa Biochemie)首先将粉状激素溶解在0.5 mL 1 N NaOH中(Roth, Karlsruhe，德国)。然后用这些原液配制100 μ ml¹用于后续渗透的工作溶液。另一对照浸渍是含有与处理条件相同浓度(2.28 mM NaOH)的NaOH溶液(用于增加激素溶解度的碱性溶液)。反式-玉米素和动素通过相同的方法使用不必要的注射器给药农渗透。溶液连续3天在叶片的同一区域浸润3次，最后浸润2天后进行显微镜观察。BAP梯度浸润(1、10、50和100 mg L)的方法相同¹)，但浸润只进行一次，浸润后2天完成显微镜检查。渗透的对照溶液中含有与处理条件相同浓度的NaOH。

显微镜和图像处理

共聚焦显微镜使用德国耶拿卡尔蔡司公司的Axiovert mot LSM 510进行。DsRed2和叶绿素在不同通道中同时成像。DsRed2用543 nm的激光线激发，发射光用560 ~ 615 nm的带通滤波器滤波。叶绿素荧光由633 nm激光线激发，发射荧光经650 nm长通滤光片过滤。

使用德国耶拿蔡司公司(Zeiss GmbH, Jena, Germany)的非电动Axioskop2，配备Axiocam HRc ccd相机(Carl Zeiss, Jena, Germany)拍摄Epifluorescence图像。荧光照明通过配备汞灯泡的HBO100灯箱实现(来自德国慕尼黑欧司朗的HBO100 W/2)。EGFP, DsRed2和DAPI使用AHF-Analysetechnik (t宾根，德国)的以下滤波器成像:DsRed/GFP (F51-019)， DsRed (F46-005)， endowGFP (F41-017)， DAPI/GFP (F51-012)。

图像处理和图像分析

荧光图像作为z堆叠。这一系列图像被导出为一组单独的“。tif”文件。导出的图像在Adobe Photoshop CS6中通过对单个图像应用非锐化蒙版进行锐化。随后，将一个z-stack的图像平面化，获得具有扩展焦深的单幅图像。免费软件包CombineZPBatch [58]被使用，如[59]。为了演示目的，将荧光图像转换为黑白，并倒置，以便在印刷媒体上更好地观察基质。因此双带滤光片组图像失去了DAPI染色或DsRed2对eGFP的色差。然而，由于细胞核的大小和位置，它仍然可以很容易地在图像中被识别出来。

使用“细胞计数器”插件和斐济的“测量”功能，计算频闪数、频闪长度和质体与细胞核的关联[60]。忽略保护细胞中的质体，对每张图像进行计数和长度测量。对于频闪频率，每个充分成像的表皮质体被计数。每个处理的平均频闪频率代表9个不同图像(n = 9)的平均计数，每个图像包含大约250-350个质体(每个处理由2000 - 3000个质体表示)。对于频闪长度测量，每张图像测量30个频闪。为了避免测量偏差，在各自图像的左上角的矩形中测量基质。我们认为短串联枝的形成独立于主串联体的伸长。基于这一假设，对最长的频闪分支进行了频闪测量。

统计分析

每个处理分别渗透3个独立的FNR-EGFP株系(3、6和7)的3个不同的植株，并从渗透区域打孔一个盘。每个叶盘拍摄3张图像，共9张图像。由于不同植物系的数据具有相似性，重复序列的数据被合并。基质频率(SF%)表示具有一个或多个基质的质体的比例。为了计算SF%，计算有基质的质体的数目并除以质体的总数。对得到的数据进行反正弦变换，并对变换后的数据进行统计分析。计算95%置信区间和算术平均值，并以柱状图表示反向转换的数据(使用Excel完成转换)。我们引入PNAI来描述与给定细胞核密切相关的质体的绝对数量。为了更好地显示数据的分布，频移长度和PNAI用中位数和箱形图表示。

每个处理从7片叶片(n = 7)中获得葡萄糖和蔗糖浓度。在每个处理中，将AIM对照渗透到同一叶片中，将7个叶片中每个叶片的AIM和处理条件汇总并平均(算术平均)。为了描述方差，计算标准差并进行t检验来比较正态分布的数据，而使用Mann-Whitney秩和检验来比较未通过正态性检验或等方差检验的数据。对同一组叶片进行了AIM和处理条件的比较。所有数据采用西格玛图进行统计分析。

我们要感谢Sarah Griffiths和Sebastian Schornack审阅了手稿的早期版本并提供了宝贵的建议。

金融资源

研究资金由加拿大自然科学和研究委员会授予S.J.R.和J.M.额外的资金由加拿大创新基金会和安大略省研究与创新部提供给J.M.。J.Z.和s.a.的贡献由莱布尼茨协会(SAW-PAKT 2011-2015)资助。M.H.S.的资金由欧盟的EFRE基金提供。

作者指出

1. 大卫·格瓦拉

   现在的地址:Pioneer Hi-Bred, 12111密西沙加路，乔治城，ON, l7g4s7，加拿大

从属关系

1. Abteilung Pflanzen Physiologie， 生物学- pflanzenphysiologie研究所，Martin-Luther-Universität Halle- wittenberg, Weinbergweg 10, Halle/Saale, 06120德国

   杰西卡·L·埃里克森，拉尔夫·B Klösgen和马丁·H·沙塔特

2. 德国莱布尼茨生物化学研究所分子信号与检测中心，德国哈勒/萨勒，06120

   Jörg齐格勒和斯蒂芬·阿贝尔

3. 圭尔夫大学分子与细胞生物学系，安大略省圭尔夫，n1g2w1，加拿大

   David Guevara, Jaideep Mathur, Steven J Rothstein和Martin H Schattat

相应的作者

对应到马丁·H·夏塔特。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

JLE和MHS负责实验设计、分析，并撰写文章;JZ在SA的监督下进行激素测量;DG在SJR的监督下进行糖测量;JM和RBK对手稿提供了建议和技术支持。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原创作品要有适当的署名。创作共用公共领域免责声明(https://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据，除非另有说明。

转载及权限