两组转录组的测序芒草物种揭示了根状茎的功能特异性，并阐明了进化关系

背景

芒草是温带地区有前途的生物质作物。尽管人们对这种植物越来越感兴趣，但有限的序列信息限制了对其生物学、生理学和育种的研究。全基因组转录组m . sinensis而且m . sacchariflorus本研究可为了解两种重要的功能组合物提供良好的资源芒草基因组及其进化关系。

结果

为m . sinensis从叶片和根茎组织中分别获得457,891个和512,950个表达序列标签(est)，其中叶片为12,166个contigs和89,648个单株，根茎为13,170个contigs和112,138个单株。为m . sacchariflorus从叶片和根茎组织中分别获得288,806和267,952条ESTs，其中叶片为8,732个contigs和66,881个单片段，根茎为8,104个contigs和63,212个单片段。根据同义核苷酸取代(Ks)的分布，高粱和芒草大约在620万年前(MYA)分道扬镳，糖而且芒草发散4.6 MYA，和m . sinensis而且m . sacchariflorus发散1.5 MYA。预测高粱蛋白序列的成对比对芒草和两个芒草两个物种分别发现了43770个和35818个nsSNPs。nsSNPs发现的显著突变的影响在高粱和高粱之间要低得多芒草比两者之间的要多芒草物种，也许是由于更高水平的基因复制芒草以及由此产生的缓冲基本功能免受干扰的能力。

结论

本研究中产生的无害环境技术是对芒草功能基因组学资源，使我们能够发现一些与增强生物量生产相关的候选基因。基于同源ESTs的Ks分布可作为未来研究基因进化的指导芒草品种及其近亲高粱和糖．

对全球变暖的担忧，加上化石燃料使用的增加，刺激了人们对生物燃料等可再生能源的兴趣日益浓厚。属芒草被认为是有吸引力的纤维素生物燃料生产的原料，因为植物适应了温带纬度，但利用高效的C4光合作用途径，生产高产量的生物质，但养分需求低，由于抵抗非生物胁迫，适应边际土地，并且不与食物的使用竞争[1- - - - - -3.］．目前，14芒草大多数原产于东亚，但也有少数发现于波利尼西亚、喜马拉雅山和南部非洲[4］．

芒草草属草本植物，包括许多重要的经济作物，如玉米、高粱和甘蔗。特别是,芒草而甘蔗属于糖糖亚族，其特征可能是其复杂和高倍性的基因组。例如,M. ×巨兽(2n = 3× = 57)，由于其积累生物量的能力而特别令人感兴趣，被认为是由两者之间的杂交产生的m . sacchariflorus(2n = 4× = 76)和m . sinensis(2n = 2× = 38) [5］．研究的大而复杂芒草基因组具有挑战性，尽管近亲高粱的全基因组序列(2n = 2× = 20) [6为分子生物学研究提供了有价值的参考芒草．基因组研究芒草目前专注于利用AFLP构建基因图谱[7]， SSR [8， RNA-seq [9]和GBS(基因型测序)[10］．

表达序列标签(ESTs)通常用于基因组资源不充足的植物物种，提供基因的功能概况以及进化研究的基础。由于大规模的并行测序技术，在不同的生长条件或组织类型下可以很容易地产生大量的ESTs;然而，只有5个芒草截至2013年12月，NCBI的dbEST已公开提供ESTs (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)．

在目前的研究中，我们从m . sacchariflorus而且m . sinensis，怀疑祖先的M. ×巨兽适于生物量生产的物种。我们之所以选择这两个物种进行转录组扫描，是因为它们将被用作绘制亲本，在未来的工作中可能需要收集基因谱。我们确定了每个叶片和根茎转录组的功能谱芒草并比较了剖面。m . sinensis已知有弱(或有时没有)根状茎，但m . sacchariflorus具有旺盛的根状茎，因此有兴趣鉴定在根状茎中表现出与其他组织显著不同的表达的基因[11］．此外，利用大量的转录组数据，我们估计了两者之间的分化时间芒草品种、高粱及糖．

454测序和从头组装芒草美国东部时间

在m . sinensis，从叶片和根茎cDNA文库中分别生成了457,891个和512,950个reads，分别约140兆基对(Mbps)和155兆Mbps。叶库(288,806个)和根茎库(267,952个)的reads数m . sacchariflorus比里面的略少m . sinensis；但是，平均读取长度比在m . sinensis(表1)．在组装原始reads(详细资料和方法)后，叶片(MSIL，下文)和根茎(MSIR)的cDNA文库m . sinensis分别生成12,166和13,170个contig。叶(MSAL)和根茎(MSAR)库m . sacchariflorus分别拥有8731和8104个contigs。读取的数量与contigs的数量呈正相关，这并不奇怪。对于MSIL、MSIR、mal和MSAR，一个contig中的平均读取数分别为28.4、28.6、23.6和23.4。contigs的长度分布如图所示1．该装配在中产生了大量的大型contigsm . sinensis(叶片长度≥200bp的有12144个，根茎长度≥200bp的有13146个)。同样，在m萨尔和澳门特别行政区，分别有8,721个和8,095个连续段，长度超过200 bp。平均contig长度为923 (MSI)和993 bp (MSA)，平均单胞胎长度为281 (MSI)和303 bp (MSA)。以单倍体基因组的大小为基础的unigenes的全基因组覆盖范围m . sinensis而且m . sacchariflorus［12]，分别约1.5%和1.1%，而高粱中编码序列的估计覆盖率为5.5% [6］．然而，基因组大小与基因数量并不一致(c值悖论)。的单倍体基因组大小芒草sp .大约是高粱的3倍大，部分原因是它与高粱谱系分化后发生了全基因组复制事件[8- - - - - -10];因此，简单地比较每个基因组的编码序列可能无法解释我们的est对整个转录组的覆盖芒草．例如，表中共有34,355个(MSI)和35,177个(MSA) unigenes(来自contigs和singleton的组合)1)与高粱基因模型有显著相似性(共34,496个)[6]基于爆炸搜索(e< 10⁵)，表示的数目芒草本研究中提出的ESTs足以进行进一步分析。

ESTs功能注释

为了将假定的函数分配给ESTs，只有contig进行相似性搜索，因为短的单例可能会产生假阳性结果。首先，将contigs与Phytozome等主要生物数据库中的所有基因组序列进行比对。13]和KOG (euKaryotic Orthologous Group) [14]，截止e值为10⁵(图2)．共有93%(11377个)的MSIL contigs和81%(10733个)的MSIR contigs与25个植物物种中的一个或多个的Phytozome转录本匹配，而94%的MSAL和MSAR contigs具有显著的命中。从根状茎中获得的Contigs匹配相对较少(特定数据库中的命中数/从根状茎中获得的Contigs总数芒草)，这与从根状茎植物中获得的有限序列信息和对根状茎特异性基因功能的有限认识相一致。接下来，我们将contigs与KOG进行轰击，以确定保守的同源基因。MSIL和MSIR contigs对KOG的显著命中率分别为56%和54%，对MSAL和MSAR的显著命中率分别为58%和55%。m . sacchariflorus显示比m . sinensis因为contig的数量较少。此外，由于植物基因的KOG仅基于拟南芥，与DB中基因无显著匹配的~40%的contigs可能反映了单子代-双子代差异或谱系或种特异性基因。

超过50%的转录本是叶文库或根茎文库特异性的。BLASTN法测定叶片和根茎的contigs高度相似(e < 10^－10)计算在两个器官中表达的基因比例(图3.)．在m . sinensis，叶片和根茎均表达5587个基因，分别占MSIL和MSIR的45.9%和42.4%。在m . sacchariflorus，在两个组织中均表达3939个contigs，分别占MSAL(8732个)和MSAR(8104个)的45.1%和48.6%。

超过39.1%的转录本特异于m . sinensis或m . sacchariflorus库。两者的叶库芒草根状文库中高度相似的contigs有5314个，在MSIL中占43.7%，在MSAL中占60.9%;在根茎文库中有4461个，在MSIR和MSAR中分别占33.9%和55.0%。两者之间高度相似的contigs比例相对较高m . sacchariflorus而且中国在m . sacchariflorus比在m . sinensis库可能是由较少的contig数量引起的m . sacchariflorus而这也与高比例保守的同源基因在m . sacchariflorus库比m . sinensis(图2)．

共发现2744个转录本在所有组织类型和物种中表达。GO分类表明，这些转录本大多与植物基础代谢过程或结构有关。尽管在这项研究中，大量转录本似乎是组织或物种特异性基因，但管家功能在不同的组织和物种中似乎得到了很好的保守。

植物根状茎富集基因的比较分析高粱种虫害,芒草est序列

以前，根状茎富集基因已从美国halepense而且美国propinquum［15］．相似度分析显示，在768个根状茎富集基因中，有383个在两者中发现高粱物种中至少有一个正交物芒草ESTs和171在两者的叶和根茎中均有同源物芒草物种。171个根状茎富集基因，4个同源基因芒草（高粱四个文库中的同源物)被定义为同源组，并为每个同源组生成系统发育树。自m . sinensis已知有弱或没有根状茎，而m . sacchariflorus两种高粱的根状茎富集基因只有3种树聚类，根状茎ESTs为m . sacchariflorus(图中DN和AR4，分别)进一步分析，尽管产生了15种不同的拓扑结构。有趣的是，没有树拓扑显示两个高粱品种的根状茎富集基因和根状茎ESTs的聚类m . sinensis这表明两者的根状茎富集基因高粱的根状茎est更接近m . sacchariflorus．这三种拓扑由31个同源基团组成。表格2显示包含在31个同源基团中的ESTs及其假定的功能。利用基因本体(GO)对这三种拓扑结构中的基因进行标注。虽然没有特定的类别占主导地位，但“刺激反应”(GO:0050896)似乎与应激反应信号有关，占据了很高的比例。张成泽et al。［15的根状茎性的丧失美国二色的可能是由基因调控的变化引起的。尽管这31个基因与根或根状茎中发现的功能和氧化石墨烯类别没有特异性关联，但这些基因可能是研究植物根状茎性的主要目标芒草．这31个基因均在两种植物的叶片和根茎中表达芒草种，但根茎ESTsm . sacchariflorus仍然更接近于两个高粱品种的根状茎富集基因，这可能是由这些基因上游区域的调控变化引起的。然而，有一些无害环境技术专门表达在芒草根状茎(图3.)．它们是否真的是根状茎特有的，还是由于转录组随机测序的采样不充分，仍有待确定。

物种形成的芒草植物、甘蔗和高粱

同源基因对的同义核苷酸替换(Ks)提供了这些草之间分化的时间(s)(图5)．考虑6.5 × 10⁹作为单子叶中性突变率，每年每个同义位点的同义变化[16]， Sorghinae和Saccharinae亚部落的差异(峰值A)为0.08，对应620万年前(MYA)。之间的分歧糖而且芒草属(峰B, Ks = 0.04)估计为4.6 MYA;在两者之间芒草(峰C, Ks = 0.02)为1.5 MYA。

甘蔗和高粱之间的差异以前曾用正交学进行过研究，多项研究估计这两个物种的差异约为7.7 - 9.0 MYA [3.，17，18］．自芒草与甘蔗同属一个亚族(Saccharinae)，具有共同的祖先，估计可能与高粱和的情况一致芒草比较;然而，我们的估计大约是近140 - 280万年(6.2亿年)。与以往报告的差异可能是由于用于比较的序列数据不同。金et al。［18]和王et al。［3.]估计散度时间为7.7 MYA，但Jannooet al。［17]报告了8.0 - 9.0 MYA的散度时间。前两项研究使用的甘蔗ESTs大多来自杂交甘蔗品种，而后者只使用单个基因，Adh1,来估计两个亚部落之间的差异。甘蔗的基因组比甘蔗更复杂芒草由于其倍数较高，杂交甘蔗由于其种间起源和育种历史导致的频繁非整倍体而更加复杂[19］．因此，虽然共同的祖先芒草甘蔗与高粱谱系同时分化，杂交甘蔗在单品种内具有高度多态性，与高粱谱系的分化程度高于高粱谱系芒草，导致Ks值被高估。我们还推断甘蔗和芒草拥有4.6亿年前的共同祖先。由于缺乏核苷酸的信息芒草的散度糖血统在以前并没有估计[18］．同时，由于杂交甘蔗品种的ESTs，这两个属的估计可能被高估。然而，我们的估计连同EST序列可能为未来的进化研究提供指导芒草直到甘蔗基因组的细节被公布。

最近公布的基因图谱显示芒草Lineage在与高粱分化后经历了全基因组复制[8，10］．尽管我们试图从EST数据集中找到重复的平行测井，但信号大多隐藏或太弱。利用EST技术发现最近的全基因组复制事件有些困难，因为在EST数据集中并不能清楚地识别副同源和冗余序列，而且最近的全基因组复制信号经常被最近的单基因复制信号所掩盖。如果全基因组复制发生在芒草在其与高粱的共同祖先(约6.2 MYA)分道扬镳后，有两个假设是非常有可能的:(1)高粱芒草在此之前，基因组经历了一些“二倍体化”(重复基因对中的一个成员的损失)芒草物种分化(约1.5 MYA);(2)二倍体m . sinensis之后，基因组经历了明显的二倍体化芒草物种分化。如果前者是真的，m . sacchariflorus可能是在两个物种分化后又进行了一次全基因组复制。考虑到这两个物种最近的差异(1.5 MYA)，后者可能更合理。然而，这必须通过额外的信息来阐明。

功能分化芒草高粱基因

保守的蛋白质结构域对于基因的功能通常是必不可少的。发生在蛋白质序列保守区域的氨基酸变化比发生在其他区域的变化更有可能对基因功能产生更大的影响[20.］．nsSNPs对基因功能的影响是基于Paterson描述的基因守恒谱来预测的et al。［21］．共鉴定出43,770个nsSNPs芒草高粱和MSA和MSI之间有35818个nsSNPs。如果涉及特定nsSNP位点的一个碱基在30个已发表的基因组中占主导地位(见材料和方法)，则该碱基被定义为一个公共等位基因。否则，它被定义为一种罕见的等位基因。在图6， x轴表示对基因功能的影响。如果一个nsSNP从一个普通等位基因变成一个罕见等位基因，它就具有正的价值。因此nsSNPs对基因功能的影响由负向正逐渐增加。y轴表示不同影响的nssnp的概率。两者之间不同的snp对基因功能的影响芒草种间的SNPs显著高于高粱和高粱间的SNPs芒草(t统计值= 125.37，P= 0)，表明显著突变更频繁地出现在两者之间芒草品种比高粱和芒草．这可能是基因复制水平高得多的结果芒草在这种情况下，由于存在可能赋予基本功能的第二个基因副本，突发性突变可能更容易被容忍。

表格3.显示了在参考(高粱)和突变等位基因之间发现的十个影响最大的nsSNPs (芒草)．这10个基因可分为ABC转运蛋白、糖原合成酶激酶-3、atp酶、β微管蛋白和纤维素合成酶5个功能类。有趣的是，除了纤维素合成酶(Sb01g019720)外，ABC转运酶、ATP酶和糖原合成酶激酶-3这三个功能和β微管蛋白的GO项都非常接近，分别是ATP结合(GO:0005524)和GTP结合(GO:0005525)。这些基因可能对进一步的功能研究有意义。

目前的研究提供了近22.7万份est和14.6万份estm . sinensis而且m . sacchariflorus，极大地丰富了这种有前途的木质纤维素生物乙醇作物的转录组知识。m . sinensis而且m . sacchariflorus之所以特别有趣是因为它们被怀疑是三倍体的祖先M. ×巨兽这是一种生物质作物。这些ESTs可用于许多方面，如寻找分子标记、基因组序列中的基因预测和基因表达研究。这两种动物的一组核心基因(主要是管家基因)表达是相同的芒草物种和两个组织的研究，大量的基因似乎是组织特异性的。在根状茎中显示根状茎富集表达的基因高粱物种似乎更接近于m . sacchariflorus哪个有侵略性的根状茎m . sinensis它的根茎很弱。对nsSNPs的分析表明，惊人的突变更频繁地出现在两者之间芒草物种比芒草还有高粱，想想看芒草似乎比高粱更能容忍点突变。对这一观察结果的一个合理解释是，最近基因组翻倍所导致的基因组冗余放宽了对重复基因副本的选择。我们还对ESTs进行了初步的推断芒草进化。如文中所述，芒草从高粱分化以来，经历了全基因组复制。虽然ESTs通常提供的信息太少，无法清楚地识别由全基因组复制形成的副同源谱，但通过提供清晰的同源关系信号，它们仍然有助于预测物种形成事件。当额外的基因组序列和详细的图谱可用时，可以评估全基因组复制事件的准确时间，而我们的ESTs将能够为这种详细的进化研究做出贡献。

植物材料和生长条件

中华分枝杆菌和糖花分枝杆菌均在韩国采集，其倍性水平和形态特征与之前的报告相同[22］．在韩国木浦市木浦国立大学的温室里，植物在塑料盆里种植了一年。取样前不施肥，待土壤干燥后浇水。生育期温室温度控制在24 ~ 28℃，不补光。在开花前以植物状态采集叶片和根状茎。将锅内表面新发育的<1年的根状茎磨碎后收归池中。所有样本送往国家环境管理仪器仪表中心(NICEM, Seoul, South Korea)进行cDNA文库构建。

cDNA文库的构建及测序

从根状茎和叶组织中分离得到总RNAm . sinensis而且m . sacchariflorus根据制造商的说明使用rneeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Seoul, Korea)。使用Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)对提取的RNA样本进行量化和质量检查。总RNA (6 μg)使用Super Script II (Life Technologies, Carlsbad, CA)进行反转录。第二链cDNA用Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech, Seoul, Korea)合成。cDNA样本使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Seoul, Korea)进行纯化。纯化后的片段使用454文库制备试剂盒(Roche)构建454单链cDNA文库。使用T4连接酶和T4多核苷酸激酶修饰片段末端，将包含引物序列和生物素标签的适配器连接到片段末端(Roche, Brandford, CT)。将适当连接接头的片段固定在磁性链霉亲和素涂层珠上(Roche, Brandford, CT)。使用填充聚合酶修复适配器和dscDNA片段之间的缺口或间隙。将固定化的dscDNA片段的非生物素化链熔化，生成用于454测序的单链cDNA文库。

组装454个读取和注释的contigs

装配前，去除3 '和5 '末端的扩展多路标识符(MID)序列、poly A(T)尾、短序列(<50 bp)和低复杂度序列。4个EST数据集来自两个植物的叶片和根茎组织芒草用GS对物种进行单独组装新创汇编器2.6版(罗氏诊断公司，http://454.com/products/analysis-software/index.asp)使用默认参数。从装配结果来看，由于单例序列的长度较短，只取一致序列(contigs)进行进一步分析。通过与公共数据库的序列比较进行功能注释。所有的contigs都与Phytozome数据库(http://www.phytozome.org， version 7.0, 2011年4月)，其中包括带有KOG赋值的注释基因(e< 10⁵)．

根状茎富集基因的比较美国halepense而且美国propinquum

从根状茎富集基因中提取的ESTs共有768条美国halepense或美国propinquum［11被猛烈抨击芒草寻找假定的正极序列的ESTs (e< 10^-20年)．从五个不同的数据集-根状茎和叶est两个芒草种和根状茎富集基因高粱用Spp . -构建系统发育树。5个正交线采用ClustalW多重对齐[23］．ClustalW还实现了使用邻居连接算法生成系统发育树。通过确定PHYLIP包中Treedist函数的树之间的对称差异，系统发生树根据它们的拓扑结构进行分组[24]，以比较两者的根状茎富集基因高粱物种到est芒草．系统发育树根据其拓扑结构进行分组，以推断根状茎富集的est芒草物种。对于候选的根状茎富集est芒草，采用Blast2GO对假定函数进行分类[25］．

糖精亚族分化时间的估计

估算物种形成的时间m . sacchariflorus，m . sinensis计算同源est之间的Ks值。甘蔗和高粱的est基因序列由dbEST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/)和Phytozome (http://www.phytozome.net/),分别。为了在物种之间确定假定的正交正交，从一个物种的每个序列与来自其他物种的所有序列进行对比，并选取最佳的序列。当一对最佳命中对对齐超过300 bp或更多时，将其定义为假定的正交线(e< 10^-20年)．一对序列的每个成员都对预测的高粱蛋白进行blastx搜索。如果比对长度大于100个氨基酸，则最佳匹配被认为是显著的(e< 10^-15年)．如果没有发现显著的匹配，则将这对序列排除在进一步分析之外。使用Genewise程序翻译清洗后的序列对，该程序可以考虑移码位点[26]，其中含有相应的最佳匹配蛋白美国二色的作为参考。对于每一对平行对数，两个翻译后的产物使用ClustalW [23]，得到的比对结果被用作比对核苷酸序列的指南。去除间隙和含n的密码子后，使用最大似然方法估计同义替换的水平，该方法在程序CODEML中实现，它是PAML包的一部分[27］．批处理作业使用内部python脚本执行。

非同义SNP分析

同源蛋白序列美国二色的，m . sacchariflorus而且m . sinensis以前定义的用于识别nsSNP。为了找到MSA和MSI之间的nsSNPs，对预测蛋白进行了成对比对。对于高粱和之间的nsSNPs芒草这两种蛋白质完全相同芒草物种与高粱蛋白排列一致。将鉴定出的nsSNP分为两组:一组包含在MSA和MSI之间多态的nsSNP。另一组的nsSNPs在高粱和两者之间芒草物种。来自30个已发表基因组的蛋白质序列(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)使用orthoMCL [28]及ClustalW [23］．从三个物种中鉴定出的nsSNPs与同源基因簇一致。使用Paterson描述的公式，通过功能影响评分(FIS)评估nsSNPs对基因功能的影响et al。［21］．

可用性

所有的无害环境技术都可在国家农业生物技术信息中心下载。http://nabic.rda.go.kr/)，并注明加入编号;NN-0642-000001 (MSAL)、NN-0643-000001 (MSAR)、NN-0639-000001 (MSIL)和NN-0641-000001 (MSIR)。

妊娠:

扩增片段长度多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

美国东部时间:

表达序列标签

米娅:

几百万年前

中期:

多路复用标识符

走:

基因本体论

MSI:

m . sinensis

MSA:

m . sacchariflorus

MSIL:

m . sinensis叶图书馆

MSIR:

m . sinensis粉末图书馆

MSAL:

m . sacchariflorus叶图书馆

特别行政区:

m . sacchariflorus粉末图书馆

nsSNP:

非同义单核苷酸多态性

Ks:

同义核苷酸替换。

这项工作得到了下一代生物绿色21计划植物分子育种中心(RDA)的资助。PJ0081312012);美国能源部美国农业部植物原料计划(项目批准号:112786);植物生物技术研究联盟(CPBR);国家科学基金会(NSF: DBI 0849896);来自佐治亚大学佐治亚高级计算资源中心的资源和技术专长，该中心是研究副校长办公室和首席信息官办公室的合作伙伴。

作者指出

1. 8李

   现地址:韩国水原，441-707，农村发展管理局，国家农业科学院基因组学部

从属关系

1. 植物基因组图谱实验室，佐治亚大学，111河湾路，佐治亚州雅典，30602，美国

   金昌秀，李泰浩，郭辉，安德鲁·H·帕特森

2. 国立忠南大学园艺系，韩国大田，305-764

   钟成镇，李庆柱

3. 首尔国立大学农业与生命科学研究所植物科学系，首尔，151-921，韩国

   Do-Soon金

相应的作者

对应到Geung-Joo李．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

AHP, DSK, GJL构思了本研究。CK、THL、AHP、GJL对结果进行分析并撰写论文。YJJ, SJC进行了实验。DSK提供了材料。THL、HG提供生物信息学支持和讨论。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

Changsoo Kim, Tae-Ho Lee对这项工作做出了同样的贡献。

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