从腹侧伸展的腺体分泌物GydF4y2BaSpodoptera exiguaGydF4y2Ba毛虫激活与防御相关的基因并诱导番茄中挥发性有机化合物的排放，GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

植物诱导的对食草性植物的防御通常与代谢成本有关，代谢成本导致光合产物从生长和繁殖分配到防御化合物的合成。因此，植物对机械损伤和食草性损伤的感知和区分是非常必要的。研究表明，毛虫的口腔分泌物(OS)含有诱导植物反应的诱导子。然而，这些激发子是来自唾液腺还是来自其他与进食有关的器官，如腹侧可逆腺(VEG)的研究还很有限。在这里，我们测试了一种假设，即来自于GydF4y2BaSpodoptera exiguaGydF4y2Ba毛虫含有诱导子，通过调节挥发性有机化合物(VOCs)生物合成和其他防御相关基因的表达来诱导植物防御。为了验证这一假设，我们量化和比较了番茄植株中防御相关酶的活性、防御相关基因的转录水平和VOC排放GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba带蔬菜的毛虫(VEGI)与被带蔬菜的毛虫破坏的植物(VEGA)。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

量化的防御酶（即过氧化物酶，多酚氧化酶和脂质氧化酶）在VEGI毛虫受VEGI毛虫受伤的植物中显着提高，而不是VEGA毛毛虫受伤的植物。类似地，编码参与茉莉酸和萜烯合酶基因的生物合成的关键酶的基因在VEGI毛毛虫受VEGI毛虫损坏的植物中调节占据萜烯VOC的生物合成酶。此外，VEGA毛虫的OS在诱导番茄植物中的外防基因表达方面不太活跃。与Vegi毛虫因Vega毛虫受损的植物损坏的植物的顶部空间检测到VOC的顶部空间中检测到增加的VOC排放。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这些结果表明蔬菜GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba毛毛虫包含番茄中的后期植物防御信号的Elicore，它引发了与防御相关的酶活性，调节了与防御相关基因的表达，并诱导植物VOC的排放。这些信号级联可能对植物 - 昆虫和胎选相互作用具有重要的影响。GydF4y2Ba

植物已经进化以防御自己对抗昆虫和病原体等生物放量源。众所周知，各种昆虫分泌物，包括产卵流体，口腔分泌物（OS）和昆虫排泄物，可作为昆虫草食病的诱导植物防御的诱发者[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．昆虫诱导的植物防御信号级联反应始于植物对昆虫诱导子的识别，然后是质膜跨电位(VGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba）去极化[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba，胞质钙离子的增加[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba和活性氧(ROS)的爆发，包括过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)及一氧化氮(NO) [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］．这些级联导致植物激素，茉莉酸（Ja）和水杨酸（SA）的产生升高[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]调节与国防相关基因的转录物水平[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba]并以代谢变化结束，包括释放挥发性有机化合物（VOC）[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba]及在植物内产生有毒化合物[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba］．等离子体跨膜电位（VGydF4y2Ba_mGydF4y2Ba)，胞质钙离子的增加和活性氧(ROS)的爆发，这些都是在昆虫受到伤害后的几秒到几小时/秒内发生的，被称为早期植物防御反应，同时产生植物激素，防御相关基因转录水平的变化和代谢变化，包括VOCs的释放和有毒化合物的产生，这些在昆虫受到伤害后的小时/秒到一天/秒被称为植物防御后期反应[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

食叶昆虫通过不断剪食植物材料来摄取树叶。这一过程导致一系列的机械损伤，通常伴随着口腔分泌物进入受损组织[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］．植物将机械损伤与草食物损伤分化并将这些不同的生物应激信号变为合适的生理反应是至关重要的。研究表明，植物能够区分食草动物损伤的简单机械损伤[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．分子水平的研究揭示了机械损伤植物与昆虫损伤植物中防御相关基因的不同表达模式[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．将昆虫OS应用于机械伤害可以模拟大多数植物对食草性的反应[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]，表明OS构成了植物识别昆虫袭击的elicitors [GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］．实际上，几个elicetors已从昆虫操作系统中分离出来，触发植物防御草食管，例如β-葡糖苷酶[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba[Voliticin，一种脂肪酸 - 氨基酸缀合物[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]，caeliferins [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]和inceptins [GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．Lepidopteran OS由下颌骨和阴唇分泌物的唾液组成，从消化道中反刍[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba］．沉积在草食动物喂养植物材料上的OS还含有腹侧可传递腺体（VEG）的分泌物[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．尽管发现了几个菌丝，但展示这些诱捕者是否来自唾液腺或与饲养相关的其他器官，例如伴有腹侧释放腺（蔬菜）是有限的。Voliticin起源于肠道组织GydF4y2Baspodoptera lituraGydF4y2Ba幼虫[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba[inceptins是部分消化的叶绿体蛋白蛋白GydF4y2BaSpodoptera Frugiperda.GydF4y2Ba攻击豇豆(GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

VEG是在毛虫(鳞翅目幼虫)胸部腹部表面发现的一个分泌结构。它由两个功能不同的区域组成:由分泌细胞排列的不可逆转的腺囊和可逆转的角质管。角质管外翻形成可见的乳头，而角质管上次生腺体区域的分泌物转移到乳头的顶端释放[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba］．因为外翻的VEG的尖端可以到达下颌骨[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]，其分泌物随OS沉积在食物基质上[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．来自毛虫蔬菜的分泌物与防御捕食者和抗聚集信息素的生产有关[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］．然而，Veg分泌物在植物 - 昆虫相互作用中的作用仍不清楚。最近，Zebelo和Maffei [GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba[展示了来自蔬菜的分泌物GydF4y2BaSpodoptera littoralisGydF4y2Ba毛虫在体内触发早期防御信号事件GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳。GydF4y2Ba

在本研究中，我们调查了veg分泌物的可能参与GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba毛毛虫在番茄中诱导后期防御信号。我们量化并比较了与国防相关酶的活动，萜烯合酶基因的转录水平和其他与防御相关基因的活动，以及番茄植物中的VOC排放受损GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba用VEG完整的毛虫(VEGI)和用VEG烧蚀的毛虫(VEGA)以及用VEGI毛虫OS处理的机械受伤的植物(MI + OSVEGI)对比用VEGA毛虫OS处理的机械受伤的植物(MI + OSVEGA)。GydF4y2Ba

VEG消融没有影响GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba喂养活动GydF4y2Ba

在我们开始评估VEG分泌物对触发植物防御的影响之前，我们评估了VEG消蚀是否影响摄食活动GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba毛毛虫。VEGA之间没有显着差异（2.42±0.44厘米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba）和VEGI（2.61±1.04厘米GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba(P > 0.84)。GydF4y2Ba

Veg分泌物激活番茄中的防御酶GydF4y2Ba

所选防御酶，过氧化物酶（POD），多酚氧化酶（PPO）和脂氧合酶（LOX）在VEGI毛虫和MI + OSVEGI受伤的植物中显着提高，而不是由VEGA毛虫受损的植物，机械受伤（MI）植物，MI + OSVEGA植物和未经处理的（对照）植物。VEGI损坏和MI + Osvegi番茄植物的豆荚活性显着高于Vega受损，Mi，Mi + Osvega或未损坏的植物，在治疗后的24小时开始（图GydF4y2Ba1GydF4y2BaA).与VEGA毛虫、MI、MI + OSVEGA和未受损害的植物相比，VEGI毛虫伤害的植物在处理48 h后PPO活性分别高出8.2、9.1、8.8和8.5%(图)GydF4y2Ba1GydF4y2Bab）。在与其他治疗相比，在由VEGI毛虫和MD + OSVEGI植物损坏的植物中治疗后24小时检测到LOX特异性活性水平的显着增加。治疗后LOX 72h的活性为14.2,17,14.6和21.6％，植物受VEGI毛毛虫损坏的植物高于VEGA毛毛虫，MI，MI + OSVERGA或未损坏的植物（图GydF4y2Ba1GydF4y2BaC）。通常，VEGI毛虫和MI + OSVEGI植物损坏的植物之间的酶活性没有显着差异（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和表格GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

Veg分泌物诱导番茄中的VOCS排放GydF4y2Ba

记录了不同处理番茄植株顶空VOC分布的关键差异(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．与VEGA毛虫损害的植物、机械损伤(MI)植物和未经处理(对照)植物相比，VEGI毛虫损害的植物的顶部空间中检测到更多的VOCs排放。具体来说，受蔬菜毛虫侵害的植物释放出的绿叶挥发物(GLVs)和某些单萜类物质的量高于其他处理(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba， 桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．特别是全球价值链，(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba) 2-hexenal, (GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-3-hexenal，（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-3-己烯基乙酸（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba)-2-己烯醇的排放量分别是VEGI毛虫损害植物的7倍、5倍、7倍和10倍(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和表格GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

与VEGA毛虫和其他处理方式损害的植物相比，VEGI毛虫损害的植物释放的单萜，β-芳樟醇和γ-萜烯的量显著增加(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba， 桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．α-蒎烯、β-褐蝶烯、β-蒎烯和β-胭脂烯的释放量无显著差异。倍半萜烯(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba)-β-石竹烯、α-腐殖烯和β-榄香烯的排放量也显著高于其他处理。此外，脂肪酸(3-辛醇，壬醛)和有机酯(水杨酸甲酯)的排放在蔬菜受损的植物中更高(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和表格GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

VEG分泌物增加了番茄中的国防相关基因的转录水平GydF4y2Ba

我们使用定量RT-PCR定量6个防御相关基因的转录水平，包括编码脂加氧酶的基因(GydF4y2Ba熏鲑鱼GydF4y2Ba），联烯氧化物合成酶（GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba)和四个萜生物合成相关基因(萜合酶基因)。GydF4y2Ba熏鲑鱼GydF4y2Ba和GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba是茉莉酸（JA）生物合成途径的关键酶。与Vegi毛毛虫和MI + Osvegi植物损坏的植物中发现大多数与国防相关的基因有与Vega毛毛虫，机械受伤（Mi），Mi + Osvega或未治疗（控制）植物（表格GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．特别是，萜烯合酶基因的转录物水平，GydF4y2BaTPS5GydF4y2Ba（编码单萜合成）[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaTPS12GydF4y2Ba(催化倍半萜的形成(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba）-β-亚芳烯烯和α-海绵状物）[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]，与其他处理相比，VEGI毛虫和MI + OSVEGI处理的植株中叶绿素含量显著升高。GydF4y2Ba

番茄植物受损GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba具有完整腹侧的毛细胞可递减腺（VEGI）的毛虫表达了与毛虫与消融蔬菜（VEGA）损坏的植物损坏的植物有关较高量的防御酶和基因。这些结果表明，来自蔬菜的分泌物GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba在番茄中，毛虫含有晚期防御信号的诱导子。据我们所知，这是关于毛虫分泌的蔬菜作为植物晚期防御信号诱导子的首次报道。Zebelo和Maffei之前的一项研究[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba显示的是GydF4y2BaSpodoptera littoralisGydF4y2Ba毛虫诱导早期防御信号GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

三种防御相关酶，过氧化物酶（POD），多酚氧化酶（PPO）和脂氧基酶（LOX）在由VEGI毛毛虫（OS）处理的VEGI毛毛虫或机械受伤的植物受到VEGI毛毛虫（OS）受伤的植物中的显着较高（MI + OSVEGI）比VEGA毛毛虫（MI）植物损坏的植物，机械受伤（MI）植物，用VEGA毛毛虫（MI + OSVEGA）或未治疗（对照）植物治疗的机械受伤的植物。所有三种酶都是十八丁蛋白信号转导途径的组分，其调节植物激素，茉莉酸（JA）的生产[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba-GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］．过氧化物酶(pod)是一组植物防御相关酶，通过产生醌和活性氧来限制昆虫食草动物对植物的营养质量，随后抑制昆虫对植物物质的消化[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．pod过表达可增强植物抗虫性[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]，并限制食虫植物的营养质素[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba］．铃木GydF4y2Ba等GydF4y2Ba．[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba据报道，毛毛虫和高豆荚活性的草本导致几种番茄基因的上调，包括编码蛋白酶抑制剂的基因。GydF4y2Ba

多酚氧化酶（PPO）是在整个植物王国中发现的诱导酶，并且已知对食草动物具有防御性作用[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]和病原体[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．PPO的生产是由机械损伤，茉莉甲酸甲酯（MEJA）和草食病诱导的[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．类似于我们的结果，涌GydF4y2Ba等GydF4y2Ba．[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]报道番茄植物的高PPO水平机械地伤害，并用来自科罗拉多土豆甲虫的口腔分泌物（OS）处理，GydF4y2BaLeptinotarsa Decemlineata.GydF4y2Ba，提示昆虫OS含有PPO活性激发子[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．脂加氧酶(Lipoxygenases, LOXs)是另一组抗氧化酶，通过十八烷途径参与植物防御食草性和病原体[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．LOX在植物防御中最重要的功能之一是JA信号通路中亚麻酸的氧化[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］．氧化烯合成酶(GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba)催化导致JA生物合成的LOX途径的第一步[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］．在本研究中，我们观察到在喂养完整的蔬菜(VEGI)的毛虫24小时内，lox特异性活性的早期诱导。同样的，转录水平GydF4y2Ba熏鲑鱼GydF4y2Ba和GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba受VEGI毛虫损害的植物的基因高于受VEG (VEGA)毛虫损害的植物。这些结果与前人的研究一致，前人的研究表明，毛虫摄食上调了表达GydF4y2Ba熏鲑鱼GydF4y2Ba番茄中的基因[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

我们的研究结果还表明，与VEGA毛虫或机械损伤植物相比，VEGI毛虫损伤的番茄植株中VOCs的排放增加。食草动物诱导产生的常见VOCs中有lox衍生的，如绿叶挥发物(GLVs)、萜类和水杨酸甲酯[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．众多植物将Glvs和其他VOC作为对食草的间接防御策略，因为这些挥发物可以吸引食草动物的凶悍和寄生的自然敌人[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba-GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．在这项研究中，被VEGI毛虫破坏的植物释放出更多的glv和某些单萜，表明vegg参与了植物VOCs的诱导。例如，大多数全球价值链包括(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba) 2-hexenal, (GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-3-hexenal，（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba）-2-己烯醇和（GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba)-3-醋酸己烯酯在被织女星毛虫破坏的植物中含量高于被织女星毛虫破坏的植物。有趣的是，许多这些glv被毛虫寄生蜂用作宿主位置的线索[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]，表明Veg分泌物可能会影响胎选相互作用。还据报道，GLV在植物植物交互中发挥作用[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

另一种高度多样化的植物化合物是萜类化合物，它是由一组称为萜类合成酶(GydF4y2BaTPSGydF4y2Ba)以产生单、倍半及二萜[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．每克萜类化合物的合成成本高于大多数其他初级和次级植物化合物[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba］．研究表明，单一的机械植物组织损伤事件可能不会诱发与防御相关的挥发性有机化合物[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．然而，将OS应用于机械损伤部位可诱发挥发性化合物的释放，从而模拟草食[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．在本研究中，与VEGI毛虫受伤的人相比，我们观察到由VEGI毛虫的植物损坏的植物中的单口，β-LINEOLOOL和γ-萜烯的发射显着更高。然而，在排放其他单选剂的治疗中没有记录的显着差异，例如α-屈烯，β-磷丁烯，β-肾上腺和β-肾上腺素，表明并非所有VOC都是由VEG分泌物诱导的。GydF4y2Ba

和单萜一样，倍半萜也是植物抗毒素，在直接和间接防御食草动物中起着关键作用[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba］．在本研究中，有几种倍半萜(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba(β-石竹烯、α-腐殖烯和β-榄香烯)、一些脂肪酸(3-辛醇和壬醛)和一种有机酯(水杨酸甲酯)的排放量明显高于VEGI毛虫损害的植物。GydF4y2Ba

基因表达研究的结果表明，大多数萜烯合酶基因（即GydF4y2BaTPS7GydF4y2Ba它编码单萜，β-肾上腺素和GydF4y2BaTPS12GydF4y2Ba哪个编码sesquiterpenes，（GydF4y2BaE.GydF4y2Ba）-β-亚氰基乙烯和α-海豚）和参与GLV和茉莉酸生物合成的基因（即GydF4y2Ba熏鲑鱼GydF4y2Ba和GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba)在被蔬菜毛虫破坏的植物和被蔬菜毛虫口腔分泌物(MI + OSVEGI)处理的机械损伤植物中表达上调。然而，这些基因的转录水平在VEGA毛虫损伤的植物、VEGA毛虫口腔分泌物处理的机械损伤植物(MI + OSVEGA)和机械损伤植物(MI)中均未上调。这些结果表明一个完整的蔬菜GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba毛毛虫对于通过表达国防相关基因引出晚期防御信号至关重要。这些调查结果与Bricchi的调查结果一致GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba[这表明单独的机械损伤未能增加萜烯合酶和JA生物合成基因的转录物水平GydF4y2BaArabidobsis芥,GydF4y2Ba但是用机械损伤治疗GydF4y2BaSpodoptera littoralisGydF4y2Ba口腔分泌物激活了基因。GydF4y2Ba

最近对毛虫分泌物对诱导植物防御的作用，Felton [GydF4y2Ba61GydF4y2Ba]建议蔬菜在喂食毛虫在家庭中喂食中的毛虫在分泌中发挥重要作用。蔬菜对毛虫的结构和附近借给这项建议的信任。当植物材料上的毛毛虫喂食蔬菜在毛毛虫胸部的腹表面上的可传递位置扩张，并达到受伤的植物表面[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61GydF4y2Ba］．此外，因为Everted Veg的尖端可以在喂食期间到达颌骨[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba[veg分泌通常用OS沉积在食物底物上[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．我们的研究结果证实，在毛虫取食过程中，VEG分泌物与口腔分泌物一起沉积或反刍到植物上，可以诱导番茄的晚期防御信号。需要进一步的研究来确定vegg分泌物中触发植物防御信号的生物活性成分。GydF4y2Ba

韦尔首次报道1745年[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]但很少有关于其在植物 - 昆虫相互作用中的作用。我们目前的结果表明蔬菜的GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba含有晚期植物防御信号的激发子，可能触发防御相关的酶活性，调节萜合酶基因和其他防御相关基因的表达，并诱导植物VOCs，可能在植物-昆虫和三营养相互作用中产生分支。我们实验室正在进行研究，以调查是否VEG的分泌单独或联合其他唇腺分泌物和肠道反刍物触发植物对昆虫食草性的反应。植物信号网络的复杂性以及昆虫口腔分泌物在介导植物-昆虫和三营养相互作用中的作用还需要进一步的研究。GydF4y2Ba

动植物原料GydF4y2Ba

番茄植物（GydF4y2BaSolanum Lycopersicon.GydF4y2Ba轧机。利用日光荧光管(270 μmol m .)在23°C、60%相对湿度条件下，在无菌阳光混合土壤的塑料盆中培养种子GydF4y2Ba^{－2GydF4y2Ba}S.GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}）光相16小时。六周的非开花盆栽番茄植物用于实验。GydF4y2BaSpodoptera exiguaGydF4y2Ba从奔驰研究（Carlisle，PA）购买的鸡蛋被用来在Auburn大学开始实验室殖民地（Auburn，Al）。毛毛虫被喂养实验室制备的泛塔豆饮食，并保持在25±1°C，75±5％相对湿度，14：10-H（L / D）光周期。GydF4y2Ba

蔬菜消融和口腔分泌收集GydF4y2Ba

VEG消融(VEGA)如Zebelo和Maffei所述[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba几乎没有改动。三龄幼虫被冷藏在冰上，直到它们变得不活动。每个毛虫都用不锈钢销钉固定在一个聚苯乙烯泡沫梳中，通过弯曲销钉抵住毛虫的身体。装有毛毛虫的泡沫塑料被放置在奥林巴斯立体显微镜(日本东京)下，放大率为250倍。毛毛虫的头被轻轻向后推，用棉花耳塞把蔬菜竖起来，一个不锈钢别针被本生灯加热，直到它变红，然后靠近倾斜的蔬菜。VEG经热处理后呈乳白色(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA)，消融后veg在蜕皮后没有再生。织女星幼虫在番茄叶片上取食24 h。对照幼虫(即完整的蔬菜幼虫，VEGI)被冷冻并放置在聚苯乙烯泡沫梳中，诱导其使蔬菜外翻，但不使用加热的大头针处理(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB). VEGI幼虫也在番茄叶片上取食24 h。三龄的织女星和织女星幼虫可以蜕皮到四龄和五龄。这使它们能够适应宿主植物，从消融中恢复过来，并在试验前恢复进食。为了比较VEGA和VEGI毛虫造成的损害程度，从番茄植株上切下叶片，放置在直径8厘米的培养皿中，用潮湿的白色纸巾铺成地毯。摘去的叶片在叶柄处用湿棉球堵住，防止干燥。织女星毛虫和织女星毛虫被允许以摘除的叶子为食(每个叶子一个幼虫)。一天后，通过扫描叶片量化幼虫进食的叶片部分。将扫描图像导入ImageJ软件(ImageJ;GydF4y2Bahttp://rsbweb.nih.gov/ij/GydF4y2Ba）测量消耗的叶片量。GydF4y2Ba

如Zebelo和Maffei所述，从VEGI和VEGA毛虫中收集口腔分泌物[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．OS稀释5 mGydF4y2BamGydF4y2Ba2 - (GydF4y2BaNGydF4y2Ba用微注射器分别以1:5和5 μl的速度在番茄叶片机械损伤部位注射-吗啡啉)乙磺酸(ms - naoh) (pH 6.0)缓冲液。口腔分泌物与Mes-NaOH缓冲液的比例以及在机械损伤番茄植株中添加OS溶液的量如以往研究报道的[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．此外，先前的研究表明，单独的MES-NaOH缓冲器未能触发植物防御信令[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

Live / Dead Veg测定GydF4y2Ba

在灌注和恢复从消融和恢复后，从上述治疗中的代表性VEGI和VEGA毛毛虫再次冷却，直至松弛，并置于发泡蛋白梳子中。每个毛虫都用不锈钢销钉固定在一个聚苯乙烯泡沫梳中，通过弯曲销钉抵住毛虫的身体。将毛毛虫头向后推动到Ever veg，并且使用细微肌肉来除去蔬菜，不含口腔分泌物或多余的血淋巴，并直接放置在微观凹阱幻灯片（显微镜世界，Carlsbad Ca，USA）。Live / Dead活力/细胞毒性测定试剂盒（Biotium Hatward，CA，USA）用于确认蔬菜消融。用较放大40x的奥林巴斯荧光显微镜（BX61，东京，日本）进行双色荧光细胞活力测定。GydF4y2Ba

Ethidium homo二聚体-1 (EthD-III，是检测试剂盒的一个成分)进入细胞膜受损的细胞，与核酸结合后荧光增强40倍，从而在死细胞中产生亮红色荧光(ex/em ~495 nm-635 nm)(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC).活细胞被普遍存在的细胞内酯酶活性所区分，这是由几乎非荧光渗透细胞的钙黄素乙酰氧甲基(AM)到强荧光钙黄素的酶转化所决定的。聚阴离子染料钙黄素在活细胞内保存良好，在活细胞内产生强烈均匀的绿色荧光(ex/em ~495 nm/~515 nm)(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2BaD).根据制造商的建议进行了蔬菜组织标记。GydF4y2Ba

酶测定GydF4y2Ba

我们量化了对植物防御的三种酶的活性响应昆虫草食虫：过氧化物酶（POD），多酚氧化酶（PPO）和脂氧合酶（LOX）。从Vegi毛毛虫，Vega毛毛虫（MI）植物的机械受伤（MI）植物受损的番茄植物中收集叶样品，用VEGI毛毛虫（MI + OSVEGI）处理的机械受伤的植物，用VEGA毛毛虫治疗的机械受伤的植物（MI + OSVEGA），并且在毛毛虫进料后的0,24,48和72小时，未损坏（对照）植物。每株植物的十叶在液氮中接地，从每个样品0.2g接地叶片在2ml冰冷的0.05M磷酸盐缓冲液中均化（POP 7.2，PPO的pH 7.8）含有1％（w / v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。匀浆以12,000离心 GGydF4y2Ba4°C保存45分钟。收集上清液并用于POD和PPO测定。豆荚活性确定如[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］．通过分光光度法，用0.05M儿茶酚作为底物测定PPO活性[GydF4y2Ba64GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在共轭二烯形成过程中测定了LOX活性[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］．叶片在液氮中研磨，将0.2g从每个样品的接地叶片用1ml冰冷的0.5Mtris-HCl缓冲液（pH7.6）均化，并以12,000离心 GGydF4y2Ba4°C保存45分钟。上清置于4℃保存至使用。底物含有1.6 mM亚油酸和0.5% (v/v)吐温20在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)。在4.8 ml底物中加入0.2 ml上清液引发反应。在234 nm处，二烯的形成是随着吸光度的增加而测定的。GydF4y2Ba

酶的活性是通过使用各自的底物生产随时间的线性回归方程来计算的，根据消光系数估计与一个真实的标准。酶的催化活性以katal (Kat)计算，它的定义是催化1mol底物s形成的酶的量GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}根据上述测定条件。通过布拉德福德的方法量化蛋白质浓度[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba以牛血清白蛋白为标准。数据采用单因素方差分析，然后采用Tukey-Kramer HSD多重比较检验(显著性水平)GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05.

从被VEGI和VEGA毛虫破坏的番茄植株中收集VOCsGydF4y2Ba

为了确定蔬菜对番茄中VOC发射的作用，从VEGI毛虫，VEGA毛毛虫，机械受伤（MI）植物损坏的植物中收集了前空挥发物，以及未损坏（对照）植物。十五3.GydF4y2Ba^rd.GydF4y2Ba龄GydF4y2BaS. exigua.GydF4y2Ba幼虫(VEGI或VEGA)在盆栽番茄植株上取食24 h，幼虫取食6 h可造成约25-35%的叶面积损害，这与用花纹轮模拟的机械损伤相似，如[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．装有盆栽土壤的花盆用铝箔包裹，以减少土壤中的水分和挥发物的蒸发，并放置在一个由5 L玻璃瓶组成的挥发性收集器中。用净化后的350ml /min的活性炭气流在室温下通过罐子24小时，用荧光灯泡照射植物，产生50 μmol m的荧光GydF4y2Ba^{－2GydF4y2Ba}S.GydF4y2Ba^{－1GydF4y2Ba}具有16小时的光周期。使用含有50mg Super-Q（Alltech Associates，Deerfield，IL）的捕集器收集顶空挥发物，并用300μl二氯甲烷洗脱。将所得提取物（300μl）储存在冷冻箱（在-20℃）中直至使用。使用没有植物或毛虫的灌封土壤的另一个容器用于检查抽样过程中的杂质杂质和陷阱的突破。通过气相色谱（Agilent Technologies，Mod.7890A）与质谱（Agilent Technologies，Mod.5975C）耦合，分析了每个顶空挥发性提取物的一微升挥发性提取物。[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．通过使用NIST 05图书馆比较其与参考物质的质谱和保留指数（Kováts指数）与参考物质的保留指数（Kováts指数）进行鉴定化合物（通过NIST 05库（Gaithersburg，MD）的国家标准和技术研究所，美国）。外部校准曲线是用（GydF4y2BaE.GydF4y2Ba)-2-己烯、α-蒎烯和GydF4y2BaE.GydF4y2Ba)-β-石竹烯，用于定量测量，如前所述[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba］．通过使用单向ANOVA进行分析数据，然后通过TUKEY-KRAMER HSD多个比较测试在显着的水平GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05.

总RNA的分离和cDNA的合成GydF4y2Ba

从Vegi毛毛虫，Vega毛毛虫（MI）植物的机械受伤（MI）植物受损的番茄植物中收集叶样品，从VEGI毛毛虫（MI + OSVEGI）处理的机械受伤的植物，用VEGA毛毛虫治疗的机械受伤的植物（MI + OSVEGA）和未被损坏（对照植物），毛毛虫12小时后。将叶样品立即冷冻在液氮中并保持在-80℃。将冷冻样品用杵和砂浆研磨成液氮中的细粉末。根据制造商的说明，使用Spectrum TM植物总RNA套件（Sigma Aldrich，St.Louis，Mo，Mo，Mo）从100mg各种叶样品中提取总RNA。使用Nanodrop TM分光光度计ND-2000（Thermo Scientific，Wilmington，De，USA）测定RNA浓度和纯度，并且还通过1％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来评估RNA的完整性。通过PCR使用已知基因和凝胶电泳分析的特异性引物通过PCR验证RNA样品中的污染物DNA。在这项工作中测试的所有样品中，没有鉴定基因组DNA的片段。根据制造商的说明，使用Goscrpit™逆转录系统套件（Promega，Madison，Wi，USA）从200ng RNA合成第一链cDNA。GydF4y2Ba

实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

参与番茄防御信号通路的基因的转录物水平，例如脂氧合酶（GydF4y2BaLOX2.GydF4y2Ba），联烯氧化物合成酶（GydF4y2Ba先进的GydF4y2Ba)和四萜合酶(GydF4y2BaTPSGydF4y2Ba）基因通过定量RT-PCR测量（参见表中使用的引物列表GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．采用ABI 7500 Real Time PCR系统(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)， 96孔转子进行实时定量PCR (qrtPCR)。扩增反应由12.5 μl PerfeCTA®SYBR®Green Fastmix®LOW ROX qPCR Master Mix (Quanta Biosciences, Inc, Gaithersburg, MD, USA)、0.5 μl cDNA和100 nM引物(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)组成的25 μl混合物进行。相对RNA水平与两个管家基因水平进行校准和标准化:GydF4y2Ba肌动蛋白GydF4y2Ba和GydF4y2Ba18年代GydF4y2Ba核糖体mRNA。通过比较RT产品的稀释系列中的阈值来确定PCR条件，其次是每个引物对的非模板控制。通过使用pfaffl方法计算基因的相对表达水平[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba］．还进行了合适的熔融曲线分析。通过使用单向ANOVA进行分析数据，然后通过TUKEY-KRAMER HSD多个比较测试在显着的水平GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05.

蔬菜：GydF4y2Ba

腹侧伴随着腺体GydF4y2Ba

VOCS：GydF4y2Ba

挥发性有机化合物GydF4y2Ba

ROS:GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

mi：GydF4y2Ba

机械损伤GydF4y2Ba

VEGI：GydF4y2Ba

Veg完整GydF4y2Ba

维加:GydF4y2Ba

蔬菜烧蚀GydF4y2Ba

操作系统:GydF4y2Ba

口腔分泌GydF4y2Ba

AOS：GydF4y2Ba

氧化丙二烯合酶GydF4y2Ba

熏鲑鱼：GydF4y2Ba

脂氧合酶GydF4y2Ba

TPS:GydF4y2Ba

萜烯合成酶GydF4y2Ba

Mi + Osvegi：GydF4y2Ba

从Vegi Caterpillars用OS处理的机械受伤的植物GydF4y2Ba

MI + OSVEGA：GydF4y2Ba

机械受伤的植物从Vega毛毛虫治疗。GydF4y2Ba

我们感谢Heather Leyva协助微型图像。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 美国奥本大学昆虫与植物病理学系，奥本，36849GydF4y2Ba

   Simon Zebelo，Josph Disi＆Henry FadamiroGydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba西蒙ZebeloGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

HF和SZ设计了这项研究。SZ、JP和JD进行了这项研究。SZ分析了数据。HF和SZ撰写了这篇论文。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

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重印和权限GydF4y2Ba