致病相关蛋白PR-4b来自GydF4y2Ba可可树GydF4y2Ba表现出核糖核酸酶活性，CaGydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}和米格GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}dna依赖酶活性及抗真菌作用GydF4y2BaMoniliophthora孢GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

植物在生物或非生物胁迫下产生和积累致病相关蛋白(PR)是植物防御的重要机制之一。从一株可可豆中鉴定到致病相关蛋白4cdnaGydF4y2BaMoniliophthora孢GydF4y2Ba相互作用cDNA文库命名GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

TCPR-4B呈现6个保守的半胱氨酸残基的Barwin域，但缺乏壳多糖结合位点。TCPR-4B的分子模拟证实了半胱氨酸残基的重要性，以维持蛋白质结构，和几个保守氨基酸的催化活性。在可可基因组中，TCPR-4B属于组织主要是5号染色体上一个小的多基因家族。GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba抗性和感病可可树感染病毒的RT-qPCR分析GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba两种可可豆基因型均在感染后48小时表达增加。在最初的阶段(24-72 hai)之后GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba在耐药基因型中，表达始终存在，而在易感基因型中，表达集中在感染的最后阶段(感染后45-90天)。重组TcPR-4b蛋白具有RNase和二价离子依赖的dnase活性，但无几丁质酶活性。此外，TcPR-4b具有抗真菌作用GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba和减少GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba存活与菌丝中活性氧的产生有关。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

据我们所知，这是第一个同时显示RNase, DNase和抗真菌特性的PR-4，但没有几丁质酶活性的报道。此外，我们发现TcPR-4b的抗真菌活性与RNase功能直接相关。在可可中，TcPR-4b核酸酶活性可能分别与抗性和敏感可可基因型的建立和维持以及PCD机制有关。GydF4y2Ba

在应对生物或非生物胁迫的生产和植物致病相关蛋白（PR蛋白）的积累是众所周知的，被认为是植物防御的关键机制[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．PR蛋白被定义为在病理情况下诱导的植物蛋白，不需要与病原体直接相互作用[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．然而，一些已鉴定的PR蛋白表现出与抗菌特性相关的酶活性。在已描述的17个PR蛋白家族中，至少有9个存在酶活性，如葡聚糖酶(PR-2;[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba])，渗透因子和thaumatins（PR-5[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba10GydF4y2Ba])蛋白酶抑制剂（PR-6[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]),溶菌酶(PR-8;[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]),过氧化物酶(PR-9;[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]），核糖核酸酶（PR10; [GydF4y2Ba15GydF4y2Ba-GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]）和壳多糖酶（PR-3，PR-4，PR-8，PR-11; [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba-GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba])。针对PR-4蛋白的研究表明，该家族参与了水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等信号分子调控的植物防御反应。在大米、玉米和小麦中GydF4y2BaPR-4.GydF4y2Ba基因表达在所述第一时间内与致病性真菌和/或真菌诱导子（例如串珠镰刀菌素）的接触之后被诱导（直到96小时）GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba］．此外，已证明小麦的活化GydF4y2BaPR-4.GydF4y2Ba基因依赖于SA和JA依赖的代谢途径[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．在双子叶植物中，诱导GydF4y2BaPR-4.GydF4y2Ba在感染的红辣椒的情况下，还在疾病的初始阶段观察到基因表达GydF4y2Ba辣椒温和斑点病毒GydF4y2Ba[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba或烟草感染GydF4y2Ba烟草花叶病毒GydF4y2Ba[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]，以及对乙烯利的反应，乙烯利是大白菜中的一种et释放化合物[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．在苹果,GydF4y2BaMdPR-4GydF4y2Ba基因表达相关联的对植物的防御反应GydF4y2BaBotryosphaeria dothideaGydF4y2Ba，通过SA和JA依赖的信号通路，以及花的形成等生理功能[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

存在C端保守的Barwin结构域——首先在从大麦种子中获得的蛋白质中发现，并含有6个保守的半胱氨酸残基，形成二硫键[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]–对应于PR-4蛋白质的特征结构。此外，大多数PR-4蛋白都有一个信号肽，其中一些在N端区域显示出跨膜结构[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba-GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]一些PR-4蛋白也存在一个C端延伸域，参与蛋白靶向液泡[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba-GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．已经表明，大麦Barwin蛋白能够略微与N-乙酰葡糖胺的寡糖β-（1,4）四聚体略微相互作用，这是几丁酸的类似物[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]PR-4蛋白质分类基于几丁质连接结构域的存在（I类）或不存在（II类）[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba也被称为类似hevein的结构域，这个名字来源于hevein，一种存在于其中的小型抗真菌分子GydF4y2Ba橡胶树brasiliensesGydF4y2Ba乳胶(GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．PR-4蛋白具有几丁质酶、RNase和/或DNase活性，并具有抗真菌活性;这些功能可能相互相关(或不相关)，并且在I类和II类蛋白中都已检测到。I类烟草PR-4蛋白NtCBP20表现出抗真菌活性GydF4y2Ba绿色木霉GydF4y2Ba和GydF4y2Ba茄病镰刀菌GydF4y2Ba通过使发芽管裂解和真菌生长抑制[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．在图中，I类FAPR-4蛋白，以及其截短形式FAPR-4C - 缺乏N末端区域，以模仿类II PR-4 - 显示核糖核酸酶，几丁质酶和抗真菌活性[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．然而，一些PR-4只存在RNA酶和抗真菌活性[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]或RNA酶和DNA酶的活性，但没有几丁质酶特性[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．这些特征也可能在多基因家族成员中观察到;在小麦中分离到4个II类PR-4(命名为wheatwin 1 ~ 4)，均表现出抗真菌活性[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．此外，该重组蛋白wheatwin1表明RNase活性，和一个位点定向诱变实验表明，RNA酶活性的还原相关wheatwin1抗真菌性质的损失 - 对菌丝体生长分析[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

尽管PR蛋白在植物防御中具有重要意义，但在此家族中只有少数成员TcPR-1、TcPR5和TcPR-10在植物防御中得到了充分的描述GydF4y2Ba可可树GydF4y2Ba[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba-GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．在系统发育和表达水平下鉴定并分析了两个名为TCPR-1F和TCPR-1G的TCPR-1。这GydF4y2BaTCPR-1GGydF4y2Ba基因在基因骨菌网感染的生物营养阶段上调GydF4y2BaMoniliophthora孢GydF4y2Ba[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba] - 的丛枝病的致病因子，在一个可可树的最破坏性疾病[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba］．这GydF4y2BaTcPR5GydF4y2Ba一种基因编码了一种渗透蛋白样蛋白，这种蛋白是在Comun(下亚马逊Amelonado类型)可可豆的叶子和根中发现的，它适应干旱，表明它参与了对渗透胁迫的耐受性[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba］．在TCPR-10的情况下，该基因与在丛枝病的最后阶段的防御反应。相应的TCPR-10蛋白也呈现RNA酶的酶活性和抗真菌作用对GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba和GydF4y2Ba酿酒酵母GydF4y2Ba[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba］．在这里，我们描述了另一个PR蛋白，TcPR-4b，它是从可可豆荚中鉴定出来的GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba相互作用cDNA文库(Ceplac项目/未发表数据)和从可可分生组织-GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba交互库[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．第一个GydF4y2Ba在Silico.GydF4y2Ba和半定量RT-PCR分析表明，从可可PR4-B基因提交抗性和易感可可品种间差异表达GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba感染(GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．通过最近的出版物促进了TCPR-4B和CACAO PR-4家族的表征GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba基因组(GydF4y2Ba47GydF4y2Ba].利用生物信息学、分子生物学和生物化学，我们证明GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba属于一个小的多基因家族和感染霜霉病可可基因型中差异表达GydF4y2BavsGydF4y2Ba非感染了GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba．此外，对于我们的知识，这是植物PR-4的第一个报告，其介绍了RNase，DNase和抗真菌性，但没有几丁质酶活性。这项工作还介绍了可可中的第一次完整的PR-4基因家族，这是一种重要作物，可根据最近的研究用作果树的植物模型[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．最后，我们的论文表明，TcPR-4b可能是一种很好的生物技术或分子遗传学控制可可豆巫婆病的候选策略。GydF4y2Ba

TcPR-4b序列分析GydF4y2Ba

这GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba基因识别GydF4y2Ba可可树GydF4y2Ba相互作用文库呈现429个核苷酸的ORF，编码142个氨基酸残基的蛋白质（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在蛋白质的n端观察到一个疏水区域，该区域可能与跨膜n端螺旋或信号肽相对应[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．使用TMHMMA server 2.0进行的详细分析没有显示任何跨膜螺旋结构，而SignalP 4.0 server预测的信号肽在A之间有一个假定的剪切位点GydF4y2Ba_20.GydF4y2Ba和问GydF4y2Ba_21GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.与信号肽的TCPR-4B蛋白具有15.43 kDa的推定的分子量和6.69的推定电点，同时无信号肽的蛋白质具有13.29 kDa的分子量和6.06的推定电点。只有一个磷酸化位点（TGydF4y2Ba_97.GydF4y2Ba）观察（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.TcPR-4b序列中未发现糖基化和乙酰化位点(数据未显示)。TcPR-4b包含功能性Barwin域(PF00967, E-value 1.8.10)GydF4y2Ba^{-65年GydF4y2Ba}） （数字GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.的TCPR-4B氨基保守半胱氨酸残基酸序列礼物6（CGydF4y2Ba_49GydF4y2BaCGydF4y2Ba_70GydF4y2BaCGydF4y2Ba_81.GydF4y2BaCGydF4y2Ba_84.GydF4y2BaCGydF4y2Ba_104GydF4y2BaCGydF4y2Ba_140GydF4y2Ba所述Barwin域的）特征和负责二硫键形成（图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。TCPR-4B既不存在几丁质结合结构域，也没有C末端保守结构域 - 其对应于用于蛋白质的信号寻址到液泡[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba)(图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.通过与其他单、双子叶植物的I类和PR-4s结构域的比较分析表明，TcPR4-b与其他植物的II类PR-4s具有较高的同源性(图4)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba；表格GydF4y2Ba1GydF4y2Ba） 如GydF4y2BaMalus Domestica.GydF4y2Ba(86%;MdPR-4登录号AFH74426.1)，GydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆GydF4y2Ba（84％; NtPR-4B登录号P29063.1），GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba（78％; SLPR-4登录号NP_001234083.1），GydF4y2Ba甜椒GydF4y2Ba(77%;CaPR-4接入号AAF63520.1)，GydF4y2Ba辣椒GydF4y2Ba(78%;CcPR-4登录号BAD11073)，GydF4y2BaTriticum aestivum.GydF4y2Ba(75%;Wheatwin2登录号O64393.1)和GydF4y2Ba石蒜属辐射GydF4y2Ba(75%;LrPR4登录号ACI31201.1)。TcPR-4b抗CocoaGenBD的blast分析GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba，检测位于染色体5和显示用TCPR-4B同一性的100％上的单个基因。完整GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba基因序列（包括UTR和ORF）长度为802 bp，包含2个171和258 bp的外显子，以及1个82 bp的内含子（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在CocoaGenBD TBLASTN搜索还透露在6更PR-4本的存在GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba基因组（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和额外的文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)其中四个（Tg10_g011130、Tg05_g027250、Tg05_g027230和Tg05_g027220）显示了两个Barwin结构域，其中两个（Tg05_g012980和Tg05_g027320）包含一个Barwin和一个几丁质结合结构域，一个蛋白质序列（TcPR-4b）显示了一个独特的Barwin结构域（图1）GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA).只有一个来自可可的PR-4蛋白(Tg05_g027230)在蛋白的n端呈现跨膜螺旋结构，而包括TcPR-4b在内的其他序列呈现信号肽(图)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。除了Tg05_g012980和TCPR-4b中，PR-4从可可蛋白包含液泡信号（图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA). pr4蛋白来自GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba与TcPR-4b（附加文件）有55.4%至78.69%的一致性GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.7可可五GydF4y2BaPR-4.GydF4y2Ba基因（TcPR-4b、Tc05_g027320、Tc05_027220、Tc05_g027250和Tc05_g027230）位于第5号染色体上，一个位于第10号染色体（Tc10_g011130），最后一个（Tc00_t012980）没有明确的定位（第0号染色体；附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.染色体5结构的分析表明，在总染色体长度的约0.3％（从23010至23100kbp）的区域中，在染色体的（ - ）链中的串联组织了5 pr-4基因。（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

T.可可豆PR-4的系统发育GydF4y2Ba

I类PR-4蛋白分组在一个独特的分支中，除Tc00g_12980外，所有蛋白质都有液泡信号（图1）GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.双子叶和单子叶植物的II类蛋白除含有2个Barwin域的可可蛋白外，均无液泡信号;Tg10_g011130、Tg05_g027250、Tg05_g027230和Tg05_g027220形成了一个独立的演化枝。TcPR-4b蛋白与I类序列Tg05_g012980(78%)和Tg05_g027320(68%)同源性较高(附加文件)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba在基因组织方面也更接近Tg05_g012980；TcPR-4b和Tg05_g012980分别有一个和没有一个内含子（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.在系统发育分析中，TcPR-4b蛋白具有两个Barwin结构域，与II类蛋白相比更接近I类蛋白(图)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

TcPR-4b的分子建模GydF4y2Ba

TcPR-4b的氨基酸序列与大麦Barwin蛋白（1BW3_A.pdb）的比对显示74.4%的一致性和89%的相似性（E值1.43.10）GydF4y2Ba^{-45年GydF4y2Ba}；数字GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA） 和0.092Å的RMSD。恒等式高于50%，E值低于4.10GydF4y2Ba^{-43年GydF4y2Ba}提示Barwin蛋白是一个很好的模板模型。TcPR-4b(不含信号肽)的分子模型显示:1)3个α-螺旋，α1 (37-42)， α2(95-98)和α3 (103-107);(二)4β床单,β1(6 - 8),β2(62 - 68),β3(72 - 79)和β4 (110 - 117);iii) 8回路L1 (1-5)， L2 (9-36)， L3 (43-61)， L4 (69-71)， L5 (80-94)， L6 (99-102)， L7(108-109)和L8(118-121)(图4GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB). TcPR-4b模型的验证分析(Ramachandran plot)显示73.8%的残基位于最有利区域，25.2%位于额外允许区域，仅1%位于不允许区域，这表明99%的氨基酸残基位于最有利区域(附加文件)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.PSIPRED验证显示二级结构合理，ANOLEA能量值良好。半胱氨酸沿着PR-4多肽的守恒(图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）突出这些残留物的重要性，以维持蛋白质的趋势结构[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．在TcPR-4b中，半胱氨酸残基形成三个二硫键CGydF4y2Ba_49GydF4y2Ba-CGydF4y2Ba_81.GydF4y2BaCGydF4y2Ba_70GydF4y2Ba-CGydF4y2Ba_104GydF4y2Ba和CGydF4y2Ba_84.GydF4y2Ba-CGydF4y2Ba_140GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB).磷酸化位点GydF4y2Ba_97.GydF4y2Ba位于β层，在分子表面，即在一个可以添加磷酸基团的区域(图GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC). PR-4s中保守的HGydF4y2Ba_11GydF4y2BaHGydF4y2Ba_113GydF4y2BaDGydF4y2Ba_92.GydF4y2Ba和RGydF4y2Ba_7.GydF4y2Ba被认为是抗真菌和核糖核酸酶活性的关键[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．在TCPR-4b中的保守残基ħGydF4y2Ba_31GydF4y2BaHGydF4y2Ba_130GydF4y2BaDGydF4y2Ba_110GydF4y2Ba和RGydF4y2Ba_27GydF4y2Ba被观察到;HGydF4y2Ba_31GydF4y2Ba和DGydF4y2Ba_110GydF4y2Ba位于环- DGydF4y2Ba_110GydF4y2Ba比H更内在的GydF4y2Ba_31GydF4y2Ba位于蛋白质表面（图GydF4y2Ba3.GydF4y2BaD） .氨基酸HGydF4y2Ba_130GydF4y2Ba和RGydF4y2Ba_27GydF4y2Ba在分子表面形成了一个β层，即在一个具有适度灵活性的可接近区域(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad）。TCPR-4B的分子建模还揭示了位于在分子表面暴露在分子表面上暴露的环路中的保守区域35-41 / PEQNNNWD的存在，即在具有高柔韧性的可接近区域（图GydF4y2Ba3.GydF4y2BaE).相反，109-111/LDL区域也形成了一个环路，位于蛋白质的内部部分(图)GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae）。GydF4y2Ba

TcPR-4b在可可豆抗感基因型中的表达GydF4y2Ba

表达GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba分析了TSH1188(抗女巫帚状病)和Catongo(易感)两种可可基因型是否感染女巫帚状病(对照)GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba对于两种基因型和所有收获点，PCR扩增发生在相同且唯一的熔融温度下，表明仅扩增了TcPR-4b基因（附加文件）GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.在这两种基因型中，GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba表达在24小时时较低，在48小时时增加（分别是TSH1188和Catongo对照组的3.6倍和1.86倍），然后在72小时时下降（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba故选BGydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2BaTSH118的表达约为Catongo的2倍。从8到30代，GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba在Catongo中受到抑制，在TSH1188中过表达;TSH1188的表达量分别比Catongo在8、15和30代的表达量高12、6和17倍GydF4y2Ba6.GydF4y2BaB).与对照组相比，从45到90代，TcPR-4b在两个基因型中都超表达(60和90代时大约多8倍)。除45代外，TSH1188的表达量高于Catongo(60代和90代分别为3.2倍和1.2倍)。在45代，GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2BaCatongo的表达比TSH1188高1.34。GydF4y2Ba

重组TcPR-4b蛋白的生产GydF4y2Ba

这GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba克隆到pET28a质粒中，并成功表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba罗塞塔（图GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba泳道3至12），而在对照中没有观察到可见的条带（pET28a中没有插入在存在或不存在的IPTG）（图GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba18°C诱导的蛋白表达高于37°C(无论IPTG浓度和潜伏期如何;数字GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba11和12号车道)。因此，我们将0.4 M的IPTG和18℃(过夜)的条件确定为TcPR-4b诱导的最佳条件。重组蛋白分子量为15 kDa，接近预测值(15.43 kDa)。用Talon树脂金属亲和柱成功纯化TcPR-4b(图)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba，第13巷）。GydF4y2Ba

核糖核酸酶和钙GydF4y2Ba^{＋２GydF4y2Ba}和米格GydF4y2Ba^{＋２GydF4y2Ba}相关的脱氧核糖核酸活动GydF4y2Ba

纯化的重组TcPR-4b的核酸酶功能通过将蛋白质与RNA或DNA孵育并在琼脂糖凝胶上显示核酸降解模式进行分析（图GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.后用TCPR-4B孵育30分钟，观察到番茄RNA降解（RNA的涂片）;降解更重要时，纯化的重组蛋白的量增加（图GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba；5 ~ 25 μg蛋白质)。在25 μg TcPR-4b存在下的RNA降解模式与与商业RNase A孵育的样品中获得的阳性对照降解相似(图)GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba；阴性对照无降解(不含TcPR-4b，用10 μg BSA代替TcPR-4b)或极轻微降解涂片(10 μg煮沸TcPR-4b;数字GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.此外，在15 μg TcPR-4b + RNase inhibitor(抑制RNase A、B和C)的作用下，未观察到降解，证实重组TcPR-4b具有核糖核酸酶活性。在TcPR-4b + 10 mM MgCl孵育过夜后，观察到质粒和基因组DNA降解GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba氯化钙的A和C）或1mMGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba9.GydF4y2BaB).没有MgCl的TcPR-4b没有降解GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba或cacl.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba(A, B和C)。当TcPR-4b的量增加时，降解更为重要(图4)GydF4y2Ba9.GydF4y2BaA和B）.阴性对照（不含TcPR-4b和TcPR-4b加MgCl的样品）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba煮沸样品）未显示降解（图GydF4y2Ba9.GydF4y2BaA，B和C）。TCPR-4B加氯化镁的样品GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba与10mm的EDTA（各种金属离子的螯合剂孵育），显示没有DNase活性（图GydF4y2Ba9.GydF4y2BaA).使用不含插入pET28载体的细菌提取液未观察到RNA或DNA降解(阴性对照)，避免了某些细菌成分可能对获得的结果起作用(附加文件)GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA和B）。GydF4y2Ba

几丁质酶活性GydF4y2Ba

使用Buffera / pH 5.0和缓冲液B / pH 7.0在两个不同的pH条件下测试TCPR-4B的几丁质酶活性（参见方法部分）。无论使用的缓冲液如何，与坯料（缓冲液A或B）相比，TCPR-4B未显示任何活性，而来自Cacao Meristems的蛋白质提取物根据缓冲液和蛋白质呈现1.5-2.5 U / H的几丁质酶活性浓度使用（图GydF4y2Ba10GydF4y2Ba）.此外，TCPR-4B量（从20微克到120微克）不影响结果（图GydF4y2Ba10GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

TcPR-4b抗真菌活性GydF4y2Ba

目的:检测TcPR-4b抗真菌活性GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba，增加重组蛋白浓度(0 ~ 40 μg/ml)与双核断裂菌丝孵育GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba．减少GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba在所有测试浓度的TcPR-4b中观察到存活率，存活率的降低与蛋白质浓度的增加相关（图1）GydF4y2Ba11GydF4y2Ba).在5μg/ml TcPR-4b存在下，真菌存活率与对照组（不含蛋白质的PBS）相比没有任何差异。在10、20和40μg/ml的TcPR-4b中，存活率显著降低，在40μg/ml的蛋白质存在下，存活率达到10.3%。生活中活性氧的产生GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba用DHE选择性地染色线粒体超氧化物(OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba）.经TcPR-4b处理的菌丝呈亮红色荧光(图)GydF4y2Ba11GydF4y2BaC和E)，某些病灶的荧光更强(图)GydF4y2Ba11GydF4y2BaE,箭头)。与TcPR-4b处理的菌丝相比，对照菌丝(用PBS孵育的菌丝)呈现很少或没有荧光(图)GydF4y2Ba11GydF4y2BaB和d）。TCPR-4b的上的动作（40微克/毫升）GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba在存在（或不存在）RNase抑制剂的情况下测试存活率（图GydF4y2Ba12GydF4y2Ba一种）。在TCPR-4B Plus RNase抑制剂存在下，存活率高（83％），与仅存在TCPR-4B的存活率（6％）统计学不同。这GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2BaTcPR-4b加RNA酶抑制剂的存活率与对照组（PBS和PBS加RNA酶抑制剂）的真菌存活率相似GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2BaTcPR-4b伴或不伴MgCl存在时的存活率GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba相似且低(约10%;数字GydF4y2Ba12GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

在这篇文章中，我们的特点一个病程相关蛋白4B从GydF4y2Ba可可树GydF4y2Ba（TCPR-4B;图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)以前鉴定在可可-GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸数据库进行交互。TcPR-4b蛋白有一个Barwin结构域，在PR-4s中高度保守，但没有几丁质结合结构域(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.与其他6种来自可可的pr -4相比，TcPR-4b只包含一个Barwin结构域，没有液泡信号(图)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.但序列分析显示TcPR-4b含有一个信号肽，提示它是一个以质外体为靶点的细胞外蛋白(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.TCPR-4B显示出与来自其它植物物种的II类PR-4S高同一性（图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba；表格GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

用重组TcPR-4b进行的酶学测试表明，该蛋白具有DNase和RNase活性(图)GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.据我们所知，这是PR-4具有这两种功能的第二次报告GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.TcPR-4b DNase活性依赖于二价离子MgGydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}和CaGydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}因为螯合或不存在的这些离子防止任何DNase活性。在一些研究中，如在的情况下，GydF4y2Ba辣椒GydF4y2BaII类PR-4 (CcPR-4)， DNase的催化功能与Mg无关GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}的，但除了这些离子的增强的DNase活性[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．相反，TcPR-4b的RNase活性是独立于二价离子的，这表明这两种核酸酶作用可能有不同的催化位点。如其他著作所述[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba， TcPR-4b的RNase活性通过加热和RNase抑制剂(RiboLock, Thermo Scientific)的存在而受到抑制，RNase抑制剂能够使A、B和C型RNases的活性失效。然而，也有一些例外的报道，例如，CcPR-4似乎具有与a、B和C型RNases不同的RNase活性机制[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．此外，对于I类PR-4 s，如FaPR4，几丁质结合域的存在可能有助于蛋白质的热稳定性，避免蛋白质在被加热时缺乏RNase活性[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

TCPR-4b的抗真菌活性进行了验证GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba在GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba菌丝（图GydF4y2Ba11GydF4y2BaA）和被关联到线粒体的O的增加GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba由DHE检测的产量(图GydF4y2Ba11GydF4y2BaC和E）。高生产的OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba应该改变了线粒体复合体，导致氧化应激，DNA损伤，缺乏细胞功能，细胞凋亡或坏死，从而抑制真菌生长。PR-4的动作机制可能涉及argGydF4y2Ba_7.GydF4y2Ba,他的GydF4y2Ba_11GydF4y2Ba, AspGydF4y2Ba_92.GydF4y2Ba,他的GydF4y2Ba_113GydF4y2Ba被认为对RNase和抗真菌活性至关重要的15-PAQNNWD-21区域[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52GydF4y2Ba］．TcPR-4b的结构模型表明，HisGydF4y2Ba_31GydF4y2Ba,他的GydF4y2Ba_130GydF4y2Ba,参数GydF4y2Ba_27GydF4y2Ba残基和35-PEQNNWD-41区域存在于蛋白的可及区域;只有AspGydF4y2Ba_110GydF4y2Ba氨基酸有更多的内部定位(图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.由于大多数这些残留物中的高度柔韧的分子结构，它们可以在TCPR-4B中对应于具有目标分子的相互作用点GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba，因此可能被认为是定向位点突变研究的良好候选。GydF4y2Ba

的抗真菌活性在不同的PR家庭常见的，而不管他们每个人[的具体酶功能GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．在PR-4家族中，几丁质结合域的存在或缺失与抗真菌作用无关;类我GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]以及第II类[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2BaPR-4蛋白具有抗真菌活性(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，该结构域的存在与PR-4蛋白的几丁质溶解功能无关(见表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)正如在阿瑟尔的案例中所观察到的那样[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]和fapr-4c [GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．FaPR-4C蛋白是I类蛋白的截断形式，用以模拟II类PR-4，与原始未截断的FaPR-4具有相同的几丁质酶、RNase和抗真菌活性[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba］．此外，几丁质酶功能在极少数PR-4s中得到证实(表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）;这里，TcPR-4b既没有几丁质结合结构域，也没有几丁质酶活性(图)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba10GydF4y2Ba)，但有抗真菌作用GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba（数字GydF4y2Ba11GydF4y2Ba）.这些数据表明，PR-4作为几丁质酶的分类是不充分的，可能会受到质疑，正如之前所建议的[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．关于对丁蛋白结合域的存在/不存在相关的PR-4蛋白功能的疑虑提高了关于该领域的进化起源的问题。对于含有几丁质结合结构域在含有独特的BARWIN结构域的II类蛋白中并不侧面，或者如果在所有序列中存在丁蛋白结合结构域并稍后丢失。系统发育分析表明，在II类基因中掺入N-末端结构域后，I基因的阶级进化[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]但其他作者强调了一个假设，即第二类起源于缺乏hevein域后的第一类[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．在这里，形成了一个只有最相关的PR4序列GydF4y2BaŤ可可GydF4y2Ba，具有重复的巴温域和液泡信号，表明这些分子可能是单一的起源(图GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.然而，我们找到了其他的GydF4y2BaŤ可可GydF4y2BaPR4在I类中分组，以及其他真菌物种的序列。最后一个事实可能表明了两个进化的情况：Pr4类II出现在常见的I祖先中，这损失了几阶血清蛋白结合，或者II类祖先引发了两级蛋白质，TC00 G012980 TC05 G027320获得了该能力与甲壳素结合。考虑到之间的相互作用GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba和GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba，在这种真菌生长的不同阶段，是强烈的和进化古老的，有可能的II类分子GydF4y2BaŤ可可GydF4y2Ba导致了I类的产生。GydF4y2Ba

此外，我们发现TcPR-4b的抗真菌活性直接依赖于其RNase活性;的生存GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba有TcPR-4b + RNase inhibitor的菌落比只有TcPR-4b的菌落高(图)GydF4y2Ba12GydF4y2BaA).含或不含MgCl TcPR-4b的实验GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(这对TcPR-4b的DNase活性是必要的)没有显示任何差异，表明抗真菌活性不依赖于蛋白的DNase活性(图GydF4y2Ba12GydF4y2BaB).抗真菌和rna酶活性之间的联系已经被提出了PR-4家族。小麦win 1蛋白(属于II类)保守氨基酸H上的定向位点突变GydF4y2Ba_11GydF4y2Ba和HGydF4y2Ba_113GydF4y2Ba（HGydF4y2Ba_11GydF4y2BaG HGydF4y2Ba_11GydF4y2Ba大号欧^ hGydF4y2Ba_11GydF4y2BaL/HGydF4y2Ba_113GydF4y2BaL)被认为对RNase活性至关重要，降低了wheatwin 1降解RNA的能力;在双突变体HGydF4y2Ba_11GydF4y2BaL/HGydF4y2Ba_113GydF4y2Bal减少高于简单突变体[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]突变插入导致的核糖核酸酶活性缺失与抗真菌潜力降低相关[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．在使用RNase抑制剂(5 ' -ADP)处理后，MdPR-4蛋白也表现出相应的RNase和抗真菌活性的降低[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．这些证据表明，抗真菌活性取决于RNase活性。此外，以wheatwin 1蛋白为例，已经证明该蛋白能够进入真菌细胞的细胞质并作为RNase而不破坏细胞膜[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

PR蛋白是已知参与由病原体引起的植物反应，感染，和一些PR-4进行更具体的相关联答复真菌病原体[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．在这里，我们分析了GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba基因在抗性和易感可可基因型中感染与否GydF4y2Bam .孢。GydF4y2Ba在感染的早期，全球GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba即使在48 hai两种基因型之间观察到显著差异，抗病和感病植株之间的表达模式相似(图)GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.这种早期表达可以被认为是对两种基因型中病原体的第一植物反应，作为诱导的防御机制GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba担孢子萌发，并且菌丝渗透和进展。质外体的TCPR-4b的寻址（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，及其核酸酶活性(图GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba)，表明这两种功能可能与蛋白质的抗真菌活性有关（图GydF4y2Ba11GydF4y2Ba)主要是在疾病的生物营养阶段，当GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba生长的橘细胞[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．强度越高GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba抗性植株TSH1188的表达量是敏感植株的2倍;数字GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)可能有助于减少GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba菌丝渗透和进展在该基因型[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．在易感可可分生组织中，GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba在24 hai的亚表皮层细胞间隙检测到菌丝，而在抗性基因型中没有或很少观察到真菌渗透[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba55GydF4y2Ba］．对于大多数致病系统来说，植物抗性或敏感性的反应更多地与某些基因表达的时间/速度和大小/强度的差异有关，而不是与基因组组成的差异[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．例如，在Arabidopsis-GydF4y2Ba炭疽菌higginsianumGydF4y2Ba在抗性和敏感接种植株中均检测到PR-4的表达。在这两种基因型中，PR-4的表达随着疾病的发展而增加，但抗性基因型中PR-4的表达量最高，为48 hai，而易感基因型中仅为4 dai [GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．这一结果与文献数据一致，一般不亲和的相互作用比亲和的相互作用PR蛋白积累和/或基因表达更早[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．经过最初的阶段，在抗性可可植物中GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba表现在所有的样品一个相对较高的水平(从2到8倍的控制)基因镇压观察从8时30戴在敏感植物(控制)相比,其次是增加表达式从45到90戴(图GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.在抗性的恶毒性基因型中，即使未观察到宏观症状，也在接种植物后已经有关的一些代谢改变GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．其中，hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba与草酸钙晶体(COC)溶解相关的生产以及钙相关基因的表达GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}在接种后的最初阶段(24,48和72 hai)观察到依赖信号[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．此外，一种负责COC溶解的草酸氧化酶在抗性可可基因型中不断表达，使Ca含量高GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}可用数量很长一段时间的工厂一直在接触病原体后[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba］．在感病植物中，COCs在生物营养阶段(直到30代;[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60GydF4y2Ba])，并在过渡到坏死营养期(30至50代)时溶解[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．此外，necrophic相位被关联到程序性细胞死亡（PCD）核DNA降解其特征易感植物[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．考虑到TcPR-4b dna酶活性为CaGydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}-TSH1188基因型在30-90 dai之间的相应基因的高表达和几乎恒定的表达可能反映了TcPR-4b在抵御进一步外来入侵病原体的保护机制中的作用，正如其他植物的PR-4所建议的那样[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．在Catongo植物中，GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba表达与生物营养/黑人营养相转变期间的COC溶解以及病症期间的核DNA降解和梯形形成[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]这表明在该基因型，所述TCPR-4b可以作为PCD处理的元件中的一个起作用。核酸酶活性的增加，他们中的一些钙GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}和米格GydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}在PCD过程中，已在植物中发现有依赖性[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba-GydF4y2Ba65GydF4y2Ba］．例如，在小麦种子中，PR-4的最高积累发生在胚乳PCD伴随的时期[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba]综上所述，在可可豆中，发生在抗性基因型和敏感性基因型中的COC溶解导致细胞外CaGydF4y2Ba^{２＋GydF4y2Ba}在感染过程中，TcPR-4b可能作为DNase在耐药机制或PCD中发挥作用。这可能是由于正常细胞的细胞质中钙的可获得性更高，而在PCD期间细胞内出现钙内流[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

我们报道了PR-4与抗真菌活性的双DNase和RNase活性在一起的第一个证据。据我们所知，这是PR-4的第一次报告同时显示这三个功能，但没有几丁质酶的活性（表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.此外，我们表明TCPR-4B的抗真菌活性与RNase函数直接相关 - 而不是DNase One（图GydF4y2Ba12GydF4y2Ba）.这些功能可以在cacao-期间有关TCPR-4的作用GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba相互作用，有助于维持耐药基因型的症状减轻，并有助于敏感基因型的PCD机制。因此，TcPR-4b可以被认为是生物技术应用的一个很好的候选者，以阻止女巫的扫帚病。GydF4y2Ba

序列分析GydF4y2Ba

这GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2BacDNA被从库识别GydF4y2Ba可可树GydF4y2Ba荚果(TSH1188)基因型GydF4y2BaMoniliophthora孢GydF4y2Ba(登录号FC072496.1)GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba(Gesteira et al.， 2007;加入ES440503.1)。使用ORFinder软件进行开放阅读框(ORF)分析。利用BLAST进行序列同源性搜索[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba关于国家生物技术信息中心(NCBI)和cocoagenda [GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]数据库。使用CLUSTALW2软件进行多个序列对齐[GydF4y2Ba68GydF4y2Ba］．利用Expasy分子生物学服务器(GydF4y2Bahttp://www.expasy.orgGydF4y2Ba）.保守结构域和家族蛋白使用Pfam (GydF4y2Bahttp://pfam.sanger.ac.uk/search/sequenceGydF4y2Ba)及InterProScan [GydF4y2Ba69GydF4y2Ba] 程式。netphos 2.0服务器[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba]和NetNGlyc 1.0服务器(GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/GydF4y2Ba)分别鉴定推测的磷酸化位点(Ser/Thr/Tyr)和推测的n-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr型)。ASEB服务器被用来预测推测的kat特异性乙酰化位点[GydF4y2Ba71GydF4y2Ba］．使用SignalP 4.0 Server分析信号肽的存在[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba］．TMHMMA server 2.0预测跨膜螺旋(GydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/GydF4y2Ba；[GydF4y2Ba72GydF4y2Ba])。GydF4y2Ba

系统发育GydF4y2Ba

从所有的所有氨基酸序列进行系统发育分析GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba与TcPR-4b序列相关，序列经ClustalW2比对(GydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba68GydF4y2Ba]，并选择BLOSUM矩阵[GydF4y2Ba73GydF4y2Ba].比对以NEXUS格式保存，用于系统发育分析。然后，使用MRBAYES 3.1.2进行贝叶斯计算[GydF4y2Ba74GydF4y2Ba，采用混合进化模型，三次独立运行(每一次运行4条链)，每次运行1 × 10GydF4y2Ba^6.GydF4y2Ba每100代进行一次抽样。对于这个分析GydF4y2Ba栽培稻GydF4y2Ba序列（OSPR-4B）作为外类群，因为与它的更遥远的进化关系GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

分子建模GydF4y2Ba

TcPR-4b蛋白的三维(3-D)模型的预测使用Swiss Pdb-Viewer软件v.3.7 [GydF4y2Ba75GydF4y2Ba]为了从解析的三维结构中选择用于TcPR-4b分子建模的最佳三维模板，使用PSI-BLAST程序对TcPR-4b氨基酸序列与蛋白质数据库蛋白质（pdb）进行比对[GydF4y2Ba76GydF4y2Ba］．最佳对齐(e值3.10GydF4y2Ba^{-62年GydF4y2Ba})由大麦Barwin蛋白(PDB code 1BW3_A.pdb)获得，该蛋白经核磁共振波谱(NMR Resolution: 99.9;[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]）;因此大麦barwin蛋白用于构建TCPR-4B 3- d模型。从键长和键角的理想几何形状的均方根偏差（RMSD）差异计算上PyMOL的V3.0（所述分子PyMOL的图形系统，薛定谔，LLC）。的TCPR-4B 3- d模型的立体化学品质使用PROCHECK 3.4 [评估GydF4y2Ba77GydF4y2Ba]和ANOLEA(原子非本地环境评估;[GydF4y2Ba78GydF4y2Ba)项目。二级结构验证使用PSIPRED (Protein structure Prediction Server;GydF4y2Bahttp://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/GydF4y2Ba；[GydF4y2Ba79GydF4y2Ba])。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

种子GydF4y2Ba可可树GydF4y2BaL.基因型GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba)和TSH1188(抗GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba）在Ceplac / Cepec（巴西，巴西）温室发芽并种植。发芽后二十至三十天，通过液滴法接种植物的顶端分泌物[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba带有担子孢子悬浮体(2.10GydF4y2Ba^5.GydF4y2BaBasidiospore.ml.GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba)的GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba（来自分离物4145的接种物维持在Ceplac / Cepec植物病理学GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba根据WFCC第921号收集;GydF4y2Bahttp://www.wfcc.info/index.php/collections/display.GydF4y2Ba) ［GydF4y2Ba80GydF4y2Ba］．一种fter inoculation, the plantlets were kept for 24 h at 25 ± 2°C and 100% humidity. Rate of disease fixation based on presence/absence of symptoms [81.GydF4y2Ba]在每个基因型，被后60天接种（DAI）评价;病率为45％和分别TSH1188和Catongo，80％。此外，存在GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba采用特异性半定量RT-PCR检测GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba肌动蛋白引物[GydF4y2Ba82.GydF4y2Ba];两种基因型的真菌发病率(数据未显示)与以前在相同的植物培养和接种条件下获得的数据一致[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba］．接种后24、48和72 h，接种后8、15、30、45、60和90代分别收获根尖分生组织。在相同条件下分别在24和72海、30、60和90代保存和收获未接种的植株(对照)。对于每个基因型和每个收获时间(接种和未接种植株)，采集20个样本(1个样本= 1个可可植株顶端分生组织)。将采集时间为1个基因型的20个样本进行汇总;因此，9个接种样品和5个未接种(对照)样品立即在液氮中冷冻，-80°C保存至使用。RNA提取前汇集样本的优势在于减少生物复制和样本处理引起的变异[GydF4y2Ba83.GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

反转录定量PCR分析GydF4y2Ba

可可豆样品在液氮中浸渍，直到获得细粉。根据制造商的说明，使用RNAqueous Kit®(Ambion)从浸渍样品中提取总RNA，并进行修改。在浸渍样品中加入裂解缓冲液后，加入超声步骤(10 s脉冲/min, 70%输出;Gex超声波处理器130,130 W)，以打破多糖在可可组织中存在的高水平[GydF4y2Ba84.GydF4y2Ba];这一步是在冰上进行的。根据制造商的指示（Thermo Scientific），使用Revertaid FISRT链CDNA合成试剂盒进行第一cDNA链的合成。在Genequant Pro UV / VIS分光光度计（Amersham）上进行cDNA定量。对于QPCR分析，三个可可内源参考基因的表达，亚丙酸脱氢酶（MDH），甘氨酸脱氢3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和β-肌动蛋白（ACT），以前确定为GydF4y2Bat .可可GydF4y2Ba管家基因(GydF4y2Ba85.GydF4y2Ba，使用NormFinder程序对可可分生组织进行分析[GydF4y2Ba86.GydF4y2Ba］．特异性引物和扩增区域包含不同大小，熔化温度，GC含量和GC / AT比率被定义，以避免从可可PR4家族基因之间的交叉反应[GydF4y2Ba87.GydF4y2Ba].使用ABI PRISM 7500标准设置和序列检测系统（SDS）软件版本1.6.3（应用生物系统）进行qPCR表达分析。qPCR反应包括10 ng/μl cDNA，200μM来自参考或GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba基因(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)和11 μl的Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)，总积为25 μl。循环条件:50°C 2分钟然后95°C 10分钟,其次是40周期为15秒95°C, 60°C 30年代和60°C 1分钟。来验证每个只有一个PCR引物对所生产的产品,进行了分离分析从60°C到95°C和分析与解离曲线1.0程序(应用生物系统公司)。采用比较Ct法，对Catongo和TSH1188基因型进行6个重复实验，分析基因表达水平(2GydF4y2Ba^{-ΔΔCTGydF4y2Ba})使用：i）MDH和ACT作为参考基因（两个基因表达值的平均值）；和ii）未接种植物（两个基因表达值的平均值）GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba在5个对照样品中(如上所述)作为校准器-因此，对照(=未接种植株)的相对表达值始终为1.0。使用SASM-Agri软件进行统计分析[GydF4y2Ba88.GydF4y2Ba将实验作为完全随机的设计进行测试。GydF4y2BaT.GydF4y2Ba以及和GydF4y2BaFGydF4y2Ba-检验(ANOVA)，临界值为0.01。时的平均分离采用Scott-Knott (P≤0.01)检验GydF4y2BaFGydF4y2Ba- 值得显着。GydF4y2Ba

重组TcPR-4b的表达GydF4y2Ba

这GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2BacDNA被从通过PCR扩增GydF4y2Ba的pDNR-LIB :: TCPR-4BGydF4y2Ba使用200μM TcPR-4bF（5′-GCGGCATATGCCAAGGCTTCCATGTG-3′）进行施工/GydF4y2Ba无损检测GydF4y2Ba我标出了site)和TcPR-4bR (5 ' -GCGGGGATCCTTAGTCACCACAATC-3 ' /GydF4y2BaBamGydF4y2BaHI下划线部位)引物，1.5 mM的氯化镁GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 0.25 μM的dNTPs, 1X Taq buffer containing (NH .GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba）GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba在94°C 4 min, 94°C 30s, 52°C 45 s, 72°C 1 min的条件下35个循环GydF4y2Ba无损检测GydF4y2Ba我和GydF4y2BaBamGydF4y2Ba利用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)对pET28a质粒(Novagen)的HI位点进行连接，并将得到的帧融合质粒用于转化GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba(3)蛋白表达。该系统允许生产重组His-Tag蛋白。TcPR-4b生产建立一个有效的策略,归纳在两个温度下进行(18岁和37°C),两个异丙基-β-D-thio-galactoside (IPTG)浓度(0.4和1毫米)和不同的感应期(16 h为感应18°C, 1、2、3和4 h为感应37°C)。诱导后，离心收集细胞(11000GydF4y2BaGGydF4y2Ba， 20分钟，4℃)和小球在溶解缓冲液(6 M尿素，50 mM磷酸盐缓冲液，300 mM NaCl, 2% Nonidet, 0.1 mg.mlGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba根据制造商说明书(Clontech)，使用TALON®金属亲和树脂(TALON®metal affinity Resin)通过固定化金属亲和层析(IMAC)纯化重组n端组氨酸标记TcPR-4b。TcPR-4b蛋白仅在不溶部分表达，使用HisTrap™FF原油(GE Healthcare)透析以去除尿素。表达、纯化和透析后TcPR-4b蛋白的存在通过15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析，如前所述[GydF4y2Ba89.GydF4y2Ba］．将立方体浸入冰中，在150 V下电泳2 h，用考马斯蓝G 250染色法在电泳凝胶上检测蛋白[GydF4y2Ba90.GydF4y2Ba］．使用Qubit®蛋白质测定试剂盒（Invitrogen）以Qubit®2.0荧光计分析蛋白质浓度。GydF4y2Ba

Ribonuclease和Reoxyribonuclease重组TCPR-4B的活性GydF4y2Ba

以5、10、15、20和25 μg的蛋白浓度与5 μg番茄RNA (GydF4y2BaSolanum lycopersicum.GydF4y2Ba变种。微汤姆）根据制造商的说明（Ambion公司）使用RNAqueousKit®叶子。将反应物在25下温育℃下30分钟，并在1.5％琼脂糖凝胶电泳分析该产物。牛血清白蛋白（25微克; BSA，Sigma）和RNA酶A（25微克; Thermo Scientific）进行被用作阴性和阳性对照，分别。使用的RiboLock RNA酶抑制剂（; Thermo Scientific的40U /微升）的RNase活性的抑制作用进行评价。重组纯化TCPR-4B蛋白的DNA酶的活性在二价钙的存在或不存在（被测试的CaGydF4y2Ba^{＋２GydF4y2Ba}）和镁（MgGydF4y2Ba^{＋２GydF4y2Ba}）离子。所述测定用1μg纯化质粒DNA的（的pGEM-T®Easy载体; Promega）中执行具有不同TCPR-4B量（2，4，6，8，10，12，14，16，18和20μg）温育在氯化镁的10mM的存在或不存在GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(来自Taq DNA聚合酶试剂盒，Thermo Scientific)在25°C过夜。将质粒DNA与5、10、15和20 μg TcPR-4b蛋白在1 mM的CaCl中孵育GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(高浓度导致蛋白质沉淀)。为了抑制DNase活性，在含有10 mM MgCl的反应中加入10 mM的螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和10或20微克TCPR-4b的。DNase活性也在基因组DNA（gDNA中）通过TCPR-4b的6微克的温育1微克的gDNA的测试GydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆GydF4y2Ba在存在或不存在10 mM de MgCl的情况下GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在25℃下过夜。GydF4y2Ba

重组TcPR-4b的抗真菌活性GydF4y2Ba

重组纯化的TCPR-4B用于GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba对双核生物的抗真菌活性测定GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba(来自分离株4145的菌丝体维持在ceplacc /CEPEC植物病理学中GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2BaWFCC)断裂菌丝的数量为921。在固体矿物培养基(0.1% NH)上培养15天的菌丝体，取一厘米圆盘塞GydF4y2Ba_4.GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba[w/v]， 0.02%氯化钾，0.02% MgSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba.7HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO [w/v]， 0.001% CuSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba.5HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-O [W / V]，0.001％的ZnSOGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba.7HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO [w/v]， 0.5%酵母提取物[w/v]和1.5%琼脂[w/v])在强烈漩涡下用玻璃珠(Sigma, G1277)破碎60 s，并在CPD液体培养基(2%葡萄糖，2%蛋白胨)中生长7天，在25°C，如上文所述[GydF4y2Ba91.GydF4y2Ba］．然后，取1 ml破碎的菌丝悬液，分别加入5、10、20或40 μg TcPR-4b在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中孵育2 h;ii)仅PBS(对照)。为了评估在TcPR-4b存在下真菌存活与RNase活性之间的关系，将1 ml破碎的菌丝悬液用以下方法孵育2小时:i) PBS(对照);ii) PBS加800u核糖核酸酶抑制剂(Thermo Scientific);iii) 40 μg/ml TcPR-4b;iv) 40 μg/ml TcPR-4b + 800u核糖核酸酶抑制剂。为了评估在TcPR-4b存在下真菌存活与DNase活性之间的关系，将1 ml破碎的菌丝悬液用以下方法孵育2小时:i) PBS(对照);ii) PBS加10毫米氯化镁GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba；iii) 40 μg/ml TcPR-4b;IV）40μg/ ml TCPR-4B加10mm MgClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba。然后，在CPD固体培养基（CPD液体培养基加2%琼脂倒入培养皿）上施用1 ml各处理液，并在25°C下培养7天。培养期结束后，通过计算三个实验重复（三个培养皿）上的假菌落数检查存活率此外，还进行了三个独立实验，共九次重复用于统计分析。数据采用Shapiro-Wilk正态性检验，然后采用Tukey检验（α）进行方差分析 = 使用BioStat v4.0进行分析[GydF4y2Ba92.GydF4y2Ba]和SAMS-AGRI[GydF4y2Ba88.GydF4y2Ba)软件。GydF4y2Ba

活性氧检测GydF4y2Ba

检测线粒体超氧阴离子（OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba）在活细胞中GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba， 1 ml破碎的双核菌丝悬液(如上所述获得)与10 μg TcPR-4b在PBS中25°C孵育过夜。作为对照实验，菌丝仅用PBS孵育。然后,GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba用TcPR-4b蛋白预处理的菌丝在25°C下与10 mM二氢乙胺（DHE；Sigma）孵育30 min。化学反应涉及DHE与OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^-GydF4y2Ba，形成乙硫，与DNA插入，然后发出红色荧光[GydF4y2Ba93.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba95.GydF4y2Ba］．菌丝被安装在载玻片和下荧光显微镜BX51（奥林巴斯）进行观察。Images were captured using × 40 and × 100 objectives under fluorescent filters using the Image Pro software v.6.3. (Olympus).

几丁质酶活性GydF4y2Ba

用紫色染料标记的生物聚合物底物cm -几丁质rbv (Loewe生化，德国)比色法测定几丁质酶活性。作为阳性对照，被感染的可可分生组织GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba并在Universidade Estadual de Santa Cruz (Ilhéus, Bahia, Brazil)的地里收获[GydF4y2Ba96.GydF4y2Ba]。在液氮中研磨可可分生组织，使用5mL提取缓冲液A（10mM乙酸钠pH 5.0，5mM苯甲磺酰氟PMSF，1%聚乙烯吡咯烷酮PVP）或提取缓冲液B（10mM Tris-HCl pH 7.0，5mM PMSF，1%PVP）提取1g浸渍组织用于蛋白质提取.样品经超声处理（10 s脉冲/分钟，70%输出；Gex超声波处理器130，130 W）并在20000℃下离心 GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C下培养20分钟；收集上清液。重组TcPR-4b在50 mM PBS（pH 8.0）中纯化使用Spectrum/Por®透析膜在缓冲液A或缓冲液B中透析。根据制造商的建议（Invitrogen），使用Qubit®蛋白质分析试剂盒在Qubit®2.0荧光计上测量总可可提取物和TcPR-4b的蛋白质浓度。含有200μl蛋白质提取物（可可或TcPR-4b）的反应在不同浓度（20、40、80、100μg）、400μL醋酸钠缓冲液（10 mM，pH 5.0）或Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 7.0）和200μL CM甲壳素RBV下，在40°C下培养2 h。通过添加200 mL 2 mHCl停止反应。将样品在冰上冷却10 min，然后在20000℃下离心 GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C下放置10分钟，以去除未降解的底物。收集上清液，并在550 nm处进行分光光度测定（SpectraMax范式，多模式检测平台）使用SoftMax Pro v.6.3。几丁质酶活性用单位/h表示。一个单位的几丁质酶活性对应于吸光度增加0.1[GydF4y2Ba97.GydF4y2Ba］．每个样品使用4个独立的重复。GydF4y2Ba

支持这篇文章的结果数据集包括在项目和其他文件中。GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

行为:GydF4y2Ba

β肌动蛋白GydF4y2Ba

BSA：GydF4y2Ba

牛血清白蛋白GydF4y2Ba

戴:GydF4y2Ba

接种后的一天GydF4y2Ba

COC：GydF4y2Ba

草酸钙晶体GydF4y2Ba

DHE：GydF4y2Ba

DihydroethidiumGydF4y2Ba

等:GydF4y2Ba

乙烯GydF4y2Ba

GAPDH：GydF4y2Ba

甘油醛-3-磷酸脱氢酶GydF4y2Ba

海:GydF4y2Ba

小时后接种GydF4y2Ba

IPTG：GydF4y2Ba

异丙基-β-D-thio-galactosideGydF4y2Ba

是:GydF4y2Ba

JasmonateGydF4y2Ba

MDH：GydF4y2Ba

苹果酸脱氢酶GydF4y2Ba

兆瓦:GydF4y2Ba

分子量GydF4y2Ba

子:GydF4y2Ba

开放阅读框架GydF4y2Ba

pI:GydF4y2Ba

等电点GydF4y2Ba

PBS:GydF4y2Ba

磷酸缓冲盐GydF4y2Ba

PCD：GydF4y2Ba

程序性细胞死亡GydF4y2Ba

RMSD:GydF4y2Ba

均方根偏差GydF4y2Ba

活性氧：GydF4y2Ba

活性氧物种GydF4y2Ba

山:GydF4y2Ba

水杨酸。GydF4y2Ba

SPM，AOS和LSLL的工作是由Coordenação德Aperfeiçoamento德Pessoal德NIVEL高级（CAPES）的支持。EML的工作是由Conselho国立DesenvolvimentoCientíficoËTecnológico（的CNPq）的支持。EMAS的工作由中心代合作国际歌连接RECHERCHE农学倾吐leDéveloppement公司（CIRAD），然后由支持的CNPq。这项研究是由Renorbio / Renobruxa网络的支持下，的CNPq（项目470714 / 2010-7通过FM协调）和银行做诺尔德斯特（跨省FUNARBE / BNB / Produtoras德moleculas antifungicas通过FM协调）。作者感谢弗朗西斯费托萨Jucá（UESC / Ceplac）和路易斯·阿劳霍·索萨（Ceplac）技术帮助植物接种实验中，珍博士利马和Danielle奥利维拉多斯安若斯（UESC）在ROS实验的技术帮助，博士克劳迪娅福特斯费雷拉的手稿的批判性阅读。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 阿雅科学城德Biológicas（DCB），炫酷德BiotecnologiaË遗传学（CBG），金边大学获得圣克鲁斯（UESC），RODOVIA伊列乌斯，伊塔布纳，16公里，伊列乌斯，BA，45662-900，巴西GydF4y2Ba

   Sara Pereira Menezes, Edson Mario de Andrade Silva, Eline Matos Lima, Aurizângela Oliveira de Sousa, Carlos Priminho Pirovani & Fabienne MicheliGydF4y2Ba

2. Av. José Moreira Sobrinho, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (usb)， Jequié， Bahia, 45206-190，巴西GydF4y2Ba

   布鲁诺•席尔瓦安德雷德GydF4y2Ba

3. 可可研究中心，ceplacac /CEPEC, Itabuna, BA, 45600-970，巴西GydF4y2Ba

   Livia Santos Lima Lemos & Karina Peres GramachoGydF4y2Ba

4. Dealtamento de Biologia Molecular，Greatapa Mandioca E Frutudera，Rua Brabapa，S / N°，Cruz Das Almas，Bahia，Bahia，Cep44380-000，巴西GydF4y2Ba

   阿贝尔蒙·达席尔瓦·格斯特拉GydF4y2Ba

5. 法国蒙彼利埃UMR AGAP西拉德F-34398GydF4y2Ba

   Fabienne MicheliGydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaFabienne MicheliGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

竞争利益GydF4y2Ba

没有利益冲突的声明。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

SPM和FM负责实验的概念和设计，数据分析和稿件的重写;SPM负责生物信息学（Phylogyy除外）和所有实验的执行;EMAS参与TCPR4生产和纯化;EML参与RNA提取和cDNA生产;AOS帮助QPCR实验设计和分析;BSA开发了系统发育分析;LSLL获得并善待GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2BacDNA克隆;KPG负责植物材料的生产和接种GydF4y2Ba恶性疟原虫GydF4y2Ba；ASG帮助了GydF4y2BaTCPR-4BGydF4y2Ba克隆;CPP有助于所有的生化步骤的工作，并有效的实验室基础设施;FM负责研究的财政支持，并为SPM, EMAS和EML提供建议。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。GydF4y2Ba

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