利用iTRAQ和基于白腹缺口突变体的新比较系统对水稻垩白相关蛋白进行蛋白质组学分析

背景

垩白是一种影响稻米外观和碾磨品质的复杂性状，因此一直是水稻改良的主要目标之一。由于基因型与环境的复杂相互作用以及分子标记的缺乏，消除水稻白垩病是一项艰巨的任务。此外，垩白形成的分子机制仍不完全清楚。

结果

我们发现了一个缺口腹部突变体(DY1102)，其白腹率很高，只发生在胚胎近端底部。利用该突变体，建立了一种新的比较系统，可以将遗传背景和生长环境的影响降到最低。利用itraq技术对DY1102籽粒底部白垩质部分和上部半透明部分的蛋白质进行了比较显示。共鉴定出113种与白垩质形成有关的蛋白质。其中，上调蛋白70个，下调蛋白43个。这些差异表达蛋白中约有一半参与中枢代谢或调控途径，包括碳水化合物代谢(特别是细胞壁合成)和蛋白质合成、折叠和降解，为垩白形成涉及多种多样但微妙调控途径的概念提供了蛋白质组学证实。蛋白质代谢是差异表达蛋白最多的一类，占总差异表达蛋白的27.4%。此外，在垩白组织中检测到PDIL 2-3和BiP的下调，说明蛋白质代谢在籽粒垩白形成中的重要作用。

结论

利用这一新的比较系统，我们对缺口型突变体的胚乳蛋白质组学的全面调查，为在分子和生化水平上描述促成白垩质形成的途径提供了宝贵的蛋白质组学资源。

白垩是米粒的不透明部分。与玻璃粒相比，白垩粒的淀粉颗粒密度较低，在碾磨过程中更容易破碎。它亦有损产品的外观，影响消费者的接受度及降低整体市场价值[1］．在许多水稻产区，垩白粒率过高是导致稻米品质下降的主要原因。以中国为例，许多早季籼稻和粳稻品种的籽粒垩白度都很高[2］．因此，消除水稻籽粒白垩质一直是水稻育种的首要目标之一。

灌浆过程中的高温以及较高的相对湿度和较低的水汽压亏差是影响籽粒白垩质的最重要的环境条件[3.］．目前的灌浆温度在许多水稻种植县已接近临界水平，导致稻米白垩病的高发，这是目前亚洲国家水稻生产的一个主要问题[4］．因此，了解谷物白垩化的机制对于制定在全球变暖可能的情况下减少白垩化谷物高比率的策略是必不可少的。

垩白度是由数量性状位点(qtl)控制的复杂性状。利用F2分离群体、染色体片段替代系或渐隐系，在水稻基因组中定位了40多个与垩白粒百分比和胚乳垩白程度有关的qtl [2］．这些qtl分布在12条水稻染色体上，其中qPGWC-7而且qPGWC-8已被精确绘制[2］．然而，只有少数qtl被分离和功能分析，少数基因被鉴定[5］．到目前为止，水稻籽粒白垩白形成的分子机制仍不清楚。

在米粒中，淀粉是主要的储存物质，占总干质量的近90%。显微镜观察发现，与半透明部分相比，白垩质胚乳的淀粉颗粒排列松散[6］．因此，淀粉的不完全积累被认为是垩白形成的主要原因。大部分关于谷物白垩白的研究都集中在编码淀粉合成或碳代谢相关酶的基因上，如颗粒结合蔗糖合成酶、丙酮酸正磷酸二激酶、淀粉分枝酶IIb和Liu所述的去分枝酶et al。［5］．

另一方面，水稻胚乳的另一主要成分蛋白质的作用在一定程度上被低估了。最近的数据报告，其他不同的因素，特别是蛋白质也与不透明表型相关。例如，水稻结合蛋白(BiP)的过表达产生了一种不透明的表型种子，胚乳呈粉状[7］．此外,林et al。［8]研究了灌浆过程中高温对贮藏蛋白表达的影响，发现垩白粒中脯氨酸含量减少，提示了脯氨酸与水稻粒中垩白结构的关系。综上所述，这些研究表明蛋白质合成或氮代谢在籽粒白垩白形成中的潜在作用，有待进一步研究。

蛋白质组学是一种直接和全面研究蛋白质表达模式及其翻译后修饰的有效策略。它已被用于高温下谷物白垩白的研究[8］．林et al。［9]分析了包括高垩白型在内的几个不同品种的热胁迫响应，发现sHSP与垩白粒的外观呈正相关。李et al。［10]报道了PPDK和普鲁兰酶异构体的积累容易受到夜间高温的影响。然而，在这些研究中，蛋白质表达模式的比较显示是在品种之间进行的[9或在特定品种不同处理下的籽粒之间[8，10]，这不能避免基因型和环境的影响。本研究以白腹型缺口腹突变体(DY1102)为材料，其缺口腹粒率较高。有趣的是，白腹只出现在胚胎近端下部，而上半部分是半透明的(图1)．基于该突变体，我们开发了一种新的比较系统，可以最大限度地减少遗传背景和生长环境的影响。通过iTRAQ(相对和绝对定量等压标记)的比较蛋白质组学分析，共检测和鉴定了113个与谷物白垩质有关的蛋白质。我们对带白腹的缺口腹突变体的胚乳蛋白质组学进行了全面而深入的研究，为进一步阐明水稻垩白的分子和生化基础提供了良好的起点。

植物材料

乌育粳3号食性好，是中国粳稻的标杆品种，但也存在产量潜力相对较低、易受水稻条纹病毒感染、垩白率高(通常在30%以上)等缺点[6］．2007年，2000 g五育精3号种子在室温(约25℃)下用0.5%甲烷磺酸乙酯(EMS)处理16小时。播种前，种子浸泡24小时，然后排干24小时。米₁种子在田间种植，混合收割。在M_3.收获后的种子₂植物在2009年。在2010年收获后鉴定出一个带白腹的缺口型突变体(DY1102)₄种子)。该突变体具有较高的凹腹粒率，2011年为83.36% (M₅种子)和2012年73.74%₆种子;表格1)．有趣的是，在花开后的第5天，大部分的凹腹粒有白色的腹部。这对于穗的中间初级轴上的颗粒来说是很明显的，本研究将其作为穗内的取样位置(表1)．此外，白腹只发生在胚胎近端的下半部分，即缺口线以下(图1)．

比较系统

利用DY1102，我们开发了一个新的比较系统，旨在评估白垩质对蛋白表达的影响。如图所示2以无白腹的缺口纹粒为对照。首先，比较下半部(T2)和上半部(T1)可以量化胚胎的效果。其次，对比白腹籽粒的下部(C2)和上部(C1)，评价胚和垩白的复合效应。因此，可以通过进一步比较C2 vs C1和T2 vs T1来衡量白垩白的影响，这样可以最小化胚胎效应。重要的是，这些比较是在具有相同基因型或遗传背景的同一粒内进行的，因此比在同一穗内或不同品种的不同粒间进行的比较更有效。

扫描电镜和支链淀粉结构分析

在成熟时，从穗的中间初级轴的谷物被收集，然后脱壳作为糙米。选取典型的带白腹和不带白腹的缺口腹粒。胚去除后，沿缺口线将晶粒切割成两部分，两种晶粒类型均得到两种样品，分别为半透明晶粒为T1和T2，白腹晶粒为C1和C2(图1)2)．扫描电子显微镜(SEM)分析时，样品在低压下完全干燥，然后用刀片横向切割，产生断裂而不是干净的切割。在真空中溅射镀金，用扫描电镜(日立S-3000 N)在15 kV加速电压下观察断口。

四种样品的支链淀粉均采用丁吲哚碱浸法提取纯化et al。［11］．Yang说，支链淀粉是用异淀粉酶(I5284-5MU, Sigma-Aldrich)去支链，然后用高效大小排除色谱分离et al。［12］．脱支支链淀粉线性组分的聚合度(DP)计算为其分子量除以162。对每个样品进行三次重复分析。

蛋白质的提取

按丁氏法提取四个部位的蛋白质et al。［13］．简单地说，样品研磨约0.1 g，用10% (w/v)三氯乙酸在含有10 mM二硫代苏糖醇和1 mM苯甲基磺酰氟的丙酮中冰镇悬浮，然后在- 20℃下孵育1 h，然后在冷藏高速离心机中4℃下20000 × g离心30 min。沉淀物悬浮在冷丙酮中洗涤三次。真空干燥后，将沉淀(~ 40mg)溶解在1 ml 0.5 M的碳酸氢铵缓冲液中。以牛血清白蛋白为标准，用Bradford法测定蛋白浓度。

溶液中胰蛋白酶消化和iTRAQ程序

胰酶消化和iTRAQ分析由北京基因组学研究所完成。加入二硫苏糖醇至终浓度为10 mM，孵育1 h，然后与55 mM碘乙酰胺在室温下烷基化1 h，每个样品的总蛋白(约100 μg)降低。样品用测序级胰蛋白酶溶液(10 ng/μl在25 mM碳酸氢铵中)在37°C消化12小时。消化后的肽段在离心速度真空浓缩器中冷冻干燥。

每个样品重复两次进行iTRAQ分析。根据制造商手册(AB Sciex Inc.， USA)，使用iTRAQ 8-plex试剂盒对每个样品的肽段进行标记。如图所示2分别用113和117试剂标记T1, 114和118试剂标记T2, 115和119试剂标记C1, 116和121试剂标记C2。标记和淬火后，样品组合和冻干，然后重新溶解在4 ml缓冲A (25 mM NaH)中₂阿宝₄25%乙腈，pH 2.7)。采用高效液相色谱法(Shimadzu LC-20AB)在Ultremex SCX柱上进行强阳离子交换层析。混合样品用缓冲液A洗脱10分钟，然后用梯度为5%-80%的缓冲液B (25 mM NaH)洗脱₂阿宝₄， 1 M KCl在25%乙腈，pH2.7) 12分钟，流速为1 ml/min。同时用214 nm的吸光度来监测这个过程。按峰面积收集得到的12个组分，用StrataX脱盐柱脱盐，进行冻干处理。

质/ MS分析

UPLC (nanoACQuity, Waters)与串联质谱(TripleTOF 5600, AB SCIEX, Concord, ON)相结合的体系用于多肽的鉴定和定量。数据采集是根据Wang进行的et al。［14］．简单地说，TripleTOF 5600系统安装了一个Nanospray III源和一个拉石英尖端作为发射器，用于串联质谱。使用2.5 kV的离子喷雾电压获得数据。MS采用TOF-MS扫描。对于信息依赖的获取，MS调查扫描在250 MS内获得，并选择前30个产品进行MS/MS扫描。

生物信息学分析

用MASCOT软件(Matrix Science, UK;版本2.3.02)。对于生物复制，12个组分的光谱被合并到一个文件中并进行搜索。搜索参数如下:(1)允许在蛋白胰蛋白酶消化物中遗漏一个裂解;(2) Cys上的固定氨基甲基化修饰，Met和iTRAQ 8-plex上的可变氧化修饰;(3)肽容差设置为±0.1 Da, MS/MS容差设置为±0.05 Da。肽电荷设定为Mr，选择单同位素质量。在搜索过程中选择iTRAQ 8-plex进行量化。

在导出数据前对搜索结果进行过滤。过滤器用于蛋白质鉴定，选择如下选项:显著性阈值P < 0.05(95%置信度)，离子评分或预期截止值小于0.05(95%置信度)。对于蛋白质定量，过滤器的设置如下:(1)蛋白质比例类型选择“中位数”;(2)前体最小电荷量设置为2，最小肽段设置为2，只使用唯一的肽段进行定量;(3)中值强度归一化，异常值自动去除。肽阈值设置如上，以进行鉴别。1.2倍的变化被设定为识别显著差异表达蛋白P值< 0.05。

利用基因本体论数据库和京都基因与基因组百科数据库对差异表达蛋白进行分类。

白垩质胚乳的形态和支链淀粉结构

扫描电镜照片显示，具有白色腹部的颗粒垩白组织的典型特征(图3.)．淀粉颗粒松散地包裹在不透明的胚乳细胞中3.C)，与无白腹粒的半透明组织或有白腹粒的半透明上部相比(图3.A).此外，与野生型相比(图3.B)， DY1102的白垩质组织在制样过程中容易在机械应力作用下断裂，说明DY1102与野生型的白垩质组织在化学成分或微观结构上存在差异。

本研究以无白腹的缺口腹粒为对照。采用上述方法部分的比较体系，通过C2与C1、T2与T1的比较来评价白垩度对淀粉细结构的影响。结果显示，与半透明组织相比，白垩质组织的短链(DP≤12)较多，中、长链较少(图)4)．这一发现与刘的发现一致et al。［5Patindol和Wang [15］．

iTRAQ鉴定的蛋白质及其功能分类

4个样本(T1, T2, C1，和C2)中的总蛋白使用iTRAQ技术进行2个生物复制。对这些样品的蛋白质提取物进行分析，检测和鉴定出1503(4031个独特肽;额外的文件1)．本研究鉴定的水稻胚乳蛋白数量比2-DE要多，Li鉴定的约为500个点等。［10和302et al。［16］．它比多维蛋白质识别技术得到的蛋白质要多，据Koller报道为822个蛋白质et al。［17］．

根据尼尔森的理论，蛋白质被认为是差异表达的et al。［18]，它们的折叠变化都超过20%，p值也低于0.05。通过比较C1 vs C2和T1 vs T2，总共有113个蛋白表达差异，即负责白垩质形成的蛋白(表2而且3.)．其中，上调蛋白70个，下调蛋白43个。根据基因本体论(GO)数据库，这些蛋白质分为13大类。如图所示5其中，参与蛋白质合成、折叠和降解的种类最多(占总差异表达蛋白的27.4%)。第二丰富的一类由功能尚未确定的蛋白质或与数据库中其他预测蛋白没有检测到同源性的蛋白质组成(占总差异表达蛋白的24.8%)。第三个丰富类别属于碳水化合物代谢，占总差异表达蛋白的15.0%。此外，还检测到7种与氧化还原稳态相关的蛋白质。

总之，我们确定了113个负责谷物白垩质形成的蛋白质。其中，52.1%的蛋白质参与碳水化合物代谢、氮代谢(包括氨基酸生物合成和蛋白质合成、组装和降解)以及氧化还原稳态。

与碳水化合物代谢相关的蛋白质

发现了17个与碳水化合物代谢相关的差异表达蛋白。这些蛋白是直接参与淀粉合成和水解、细胞壁生物发生、糖酵解、磷酸戊糖途径和TCA循环的代谢酶。如图所示6，除了三种酶在TCA循环(联合酸水合酶)、磷酸戊糖途径(转酮酶)和淀粉水解(α-葡萄糖苷酶)中的表达上调。

值得注意的是，参与淀粉积累的蛋白质得到了促进。负责支链淀粉长链合成的酶Dull1被上调。相比之下，参与淀粉水解的α-葡萄糖苷酶下调。此外，我们还发现了5种与细胞壁合成相关的上调酶，包括鼠李糖生物合成酶、udp -葡萄糖4-表异构酶、udp -葡萄糖6-脱氢酶、udp -阿拉伯吡喃糖变酶和udp -葡萄糖醛酸脱羧酶。这一发现提示了细胞壁合成在胚乳白垩质的形成中的潜在作用。

参与蛋白质合成、组装和降解的蛋白质

我们获得了31个与蛋白质合成、折叠和降解相关的蛋白质(图7)．在蛋白质合成中，核糖体的基本成分，主要是60S核糖体蛋白(L3和L13a-4)被鉴定为下调蛋白，而40S核糖体蛋白(S7、S19、S20和S27)被鉴定为上调蛋白。此外，eIF 4A-3和eIF 5A-2蛋白表达上调。在内质网中发现了4种下调的分子伴侣，包括BiP1 (dnak型分子伴侣BiP)、BiP2(发光结合蛋白2)、PDIL 2 - 3(蛋白质二硫异构酶样2 - 3)和Hsp40 (dnaJ同源亚家族B成员11)。在蛋白质降解的主要部位泛素/26S蛋白酶体系统中发现了6个蛋白质。其中RPN10、RPT6和Hsp 90表达上调。然而，泛素结合酶E2、Skp1和RPT5a下调。既往研究表明，敲除PDIL 1-1等PDIL基因可导致籽粒白垩白[19]，且BiP基因过表达或敲低的突变体表现为不透明表型[7］．因此，本研究发现的PDIL 2-3和BiP蛋白的下调可能与胚乳白垩白的发生有关。

与氧化还原稳态相关的蛋白质

Asc/GSH循环由谷胱甘肽、抗坏血酸和相关代谢酶组成，是ROS清除机制减少过氧化物的重要组成部分[20.］．刘et al。［5]报道了胚乳中ROS浓度的失衡可能导致了籽粒白垩白的发生，而谷胱甘肽- s -转移酶、乙草酸酶、脂氧合酶-5和硫氧还蛋白(TRX)则负责维持ROS的内稳态。我们发现了四种参与水稻白垩质胚乳ros清除机制的蛋白质(图8)．其中过氧化氢酶同工酶B、硫氧还蛋白O、戊烯还蛋白- c8表达下调，过氧化物酶2表达上调。我们的发现与刘的发现一致et al。［5]，表明氧化还原稳态与籽粒垩白度密切相关。

与谷物白垩质有关的额外蛋白质

除了参与碳氮代谢和氧化还原稳态的蛋白质外，还应提到另外五个代谢过程的蛋白质。(1)与无机离子转运相关的蛋白，如蛋白CutA1和硫转移酶。(2)信号转导相关蛋白，如钙调素-2和钙调素-2介导钙对大量酶、离子通道和其他蛋白的控制^{2 +}。(3)参与细胞防御的蛋白，如胚胎晚期丰富蛋白Lea14-A、致病相关蛋白、花粉主要过敏原Bet v 1-D/H等。(4)种子贮藏蛋白脯氨酸蛋白PPROL 17D。(5)除碳、氮外参与其他代谢的蛋白质，包括脂质代谢(非特异性脂质转移蛋白和酰基辅酶a结合蛋白)、辅酶代谢(c -1-四氢叶酸合成酶)和次生代谢物生物合成(4-羟基-3-甲基丁基-2-根-1-二磷酸合成酶)。综合分析表明，垩白的形成与多种生物过程和多种遗传途径有关。

基于缺口腹型与白腹型突变体的比较系统的实用价值

垩白一直是水稻育种和栽培的主要目标。这是一种相当复杂的性状，由遗传和环境因素共同控制。到目前为止，基因组学、转录学和蛋白质组学的方法已经被用来探索与垩白形成有关的基因或生化途径，从而拓宽了我们对谷物垩白的认识[5，9，21］．然而，只有少数qtl或基因被鉴定和功能分析。胚乳白垩白的分子机制尚不完全清楚。

蛋白质组学方法已用于阐明谷物白垩白的生理基础，高温的影响已被广泛研究[9，10］．然而，在这些研究中，蛋白质表达的比较要么是在品种之间进行的，要么是在特定品种的垩白粒和完美粒之间进行的。这些比较有其局限性，即不能避免品种间籽粒基因型的影响以及同一品种籽粒生长环境的影响。即使来自同一穗，不同的位置意味着不同的花期，这就导致了灌浆的气象条件不同。

我们在2010年发现了一个带白腹的缺口型突变体(DY1102)。这个突变体有很高比例的凹腹纹。缺口线在开花后第五天可见，这使我们能够追踪白垩质组织形成的过程。值得注意的是，白腹只出现在接近胚胎的下部，而上半部分是半透明的。此外，约15%的缺口腹粒没有白腹，可作为对照进行比较。利用该突变体，我们开发了一种新的比较系统，从而确定了负责白垩质形成的酶或生化途径，包括碳水化合物代谢途径、蛋白质合成途径、折叠途径和降解途径以及ROS清除途径。这些途径证实了之前其他研究的发现[5，8，9]，并应在今后的研究中进一步加以检验。

需要注意的是，本研究的一些结果与以往的研究相反，这可能与所使用的材料有关。以细胞壁合成为例。刘et al。［5]对高白垩白的近等基因系CSSL50-1与其正常亲本Asominori籽粒胚乳白垩白进行了转录比较。他们的研究结果表明，clsl 50-1籽粒中蔗糖和淀粉合成的增强是以细胞壁相关的非储存多糖为代价的，这表明碳水化合物代谢紊乱可能在胚乳白垩质的形成中发挥了作用。相比之下，我们的研究结果显示，淀粉合成的促进伴随着参与细胞壁合成的五种酶的表达增加(表5)2)．有趣的是，这一结果是通过T1 vs T2和C1 vs C2的比较得出的，以无白腹的籽粒为对照，以此评价胚胎的效果。然而，如果不使用这个对照，C1和C2的比较会得到相反的结论，这五种蛋白在白垩质组织中下调。该实例突出了基于dy1102的对比系统在探索白垩质形成机制方面的重要价值。

碳代谢与籽粒白垩质的关系

淀粉合成

支链淀粉占淀粉重量的65-85%。在水稻胚乳中负责支链淀粉生物合成的主要淀粉合成酶(SS)同工酶是SSI, SSIIa和SSIIIa。SSI从短的DP 6-7链生成DP 8-12链[22］．相比之下，SSIIIa通过DP >30延长支链淀粉B2-4链[23］．本研究的蛋白质组学分析显示DULL1 (SSIIIa)上调。然而，DULL1表达的增加并没有引起长链比例的增加。HPSEC结果显示，与半透明部分相比，白垩质部分含有更多的短链(DP≤12)，中长链较少。藤田et al。［24]报道了SSI或SSIIIa是水稻胚乳淀粉生物合成不可或缺的同工酶，当缺少相应的同工酶时，这两种同工酶可以很强地相互补偿。因此，短链水平的提高是否是SSI等其他SSs补偿的结果还有待进一步研究。

细胞壁合成

细胞壁是植物干重量的主要组成部分，在快速生长时期，它们的合成可能是细胞资源的主要消耗，占细胞碳水化合物代谢的30%或更多。本研究检测到五种负责细胞壁合成的酶，包括鼠李糖生物合成酶、udp -葡萄糖4-表异构酶、udp -葡萄糖6-脱氢酶、udp -阿拉伯吡喃糖变酶和udp -葡萄糖醛酸脱羧酶。此外，这5种蛋白在白腹粒的白垩质胚乳中均上调表达。这一发现与刘的发现不一致et al。［5]，显示出负责细胞壁合成的基因(两个纤维素合成酶基因)下调，负责细胞壁水解的基因(α- l -阿拉伯糖苷酶和α- d -木糖苷酶)上调。这部分是由于:(1)所使用的材料，如上所述;(2)蛋白质组学与转录组学之间的方法[5］．然而，这两项研究共同表明了细胞壁合成对阐明白垩质的形成的意义。

淀粉降解

除了淀粉合成外，人们越来越认识到淀粉水解在谷物白垩质的发生中所起的作用。结果表明:(1)扫描电镜照片显示复合颗粒表面存在大量微孔。气孔被认为是α-淀粉酶攻击的证据，表明淀粉降解酶参与了谷物白垩质[25，26］．(2)不透明胚乳的葡萄糖含量明显高于完美粒的半透明部分，说明淀粉水解酶在白垩粒的不透明部分存在并起作用[27］．(3)的mRNA表达Amy1A，Amy1C，Amy3D,Amy3E基因和α-淀粉酶活性在高温胁迫下增加，表明高温诱导α-淀粉酶降解淀粉与籽粒白垩质的形成有关[28，29］．α-葡萄糖苷酶将α-淀粉酶和β-淀粉酶、麦芽糖、短链葡聚糖和麦芽糖或极限糊精的产物降解为葡萄糖。蛋白组学分析表明，淀粉水解与垩白形成之间存在一定的关系。

另一方面，石丸et al。［30.]报道了在灌浆过程中白垩质组织中未检测到α-淀粉酶mRNA，提示α-淀粉酶降解淀粉不是白垩质颗粒形成的原因。然而，这些作者认为，通过淀粉降解α-淀粉酶形成白垩质可能发生在后期[30.］．在本研究中，醛糖还原酶(AR)被鉴定为在白垩质组织中下调。它催化d -葡萄糖转化为d -山梨醇，并在灌浆后期的耐脱水过程中发挥功能作用[31］．因此，为了评估淀粉降解酶或AR等晚表达蛋白对垩白形成的个体贡献，应充分研究蛋白质的时间表达模式。

蛋白质积累在籽粒垩白形成中的作用

蛋白质约占水稻胚乳重量的8%，填补了淀粉粒之间的空隙。蛋白质在谷物垩白形成中的作用已得到越来越多的认识。例如，林的结果et al。［9提出了蛋白质(小热休克蛋白)积累与高温下白垩质的形成之间的关系。在本研究中，我们发现蛋白质折叠和降解蛋白在凹腹粒的垩白和半透明部分有差异表达，说明蛋白质在颗粒垩白形成中的重要作用。

蛋白质折叠

蛋白质必须折叠成精确的三维结构来执行它们的生物功能，这是由一组被称为分子伴侣的蛋白质调节的。伴侣分为两大类。第一组，Hsp70家族，如BiP1和BiP2保持多肽处于展开状态。第二个家族是伴侣蛋白，包括蛋白质二硫异构酶(PDI)，促进适当的多肽折叠。有证据表明，BiP蛋白水平的变化诱导内质网应激，而BiP过表达导致水稻整个胚乳不透明表型[32］．pdi样蛋白(PDIL)是多基因家族的成员，属于硫氧还蛋白(TRX)超家族[19］．PDIL基因表达的失败导致水稻的粉状胚乳和内质网应激反应。汉et al。［21]报道了一种突变体T3612，其编码一种蛋白质二硫异构酶样酶(PDIL1-1)的基因缺失，这种酶产生的小颗粒具有粉状胚乳。此外，PDIL1-1的缺失与胚乳内质网应激有关，这可能是突变体粉质胚乳形成的基础。本研究在白垩质组织中检测到BiP1、BiP2、PDIL2-3等分子伴侣蛋白下调，证实了蛋白折叠与白垩质形成的关系。结合其他研究结果，我们认为PDIL和BiP的表达与垩白形成之间有很强的相关性，这些伴侣蛋白在垩白形成的研究中应得到重视。

蛋白质的降解

蛋白质降解在细胞中发挥着许多重要的生理作用，可以清除异常蛋白质，促进氨基酸的循环利用，并通过消除不再需要的分子来调节蛋白质活性。真核生物中一个主要的蛋白水解途径涉及泛素/26S蛋白酶体系统，该系统利用泛素对蛋白质的翻译后修饰。泛素与蛋白质的结合是通过泛素化酶复合体进行的，该复合体由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)组成。其中E3和E2被认为在泛素化的特异性中起着至关重要的作用。在泛素/26S蛋白酶体系统中检测到6个蛋白，其中Skp1 (E3)和E2下调，表明蛋白质降解参与了籽粒白垩白。此外,张et al。［33报告说变异人在OsVPS22负责泛素介导的膜蛋白降解的基因在籽粒中有一个白垩质胚乳，支持蛋白质降解与籽粒白垩质形成有关的假说。

C - N代谢平衡在今后垩白研究中的重要性

到目前为止，大多数关于谷物白垩质的研究都集中在淀粉上，将淀粉的积累或降解与白垩组织的形成联系起来[28，34］．我们之前的研究表明，蛋白质体积累不足，不能完全填充淀粉粒之间的空隙，这可能是垩白发生的一个解释，Del Rosario也报道过et al。［35］．因此，淀粉和蛋白质对垩白的形成同样重要。

在大米中，淀粉和蛋白质是碳(C)和氮(N)代谢的产物。在水稻种子发育过程中，从来源器官运输的糖和氨基酸被分配到C和N代谢中，以精确的数量和比例生产淀粉和蛋白质，这需要淀粉合成和储存相关基因的协调表达谱[36］．碳氮平衡紊乱或破坏可能是垩白形成的可能原因。

迄今为止，植物接收和转导与C、N状态相关的信号，进而调节C、N代谢的机制仍未明确。在今后的研究中，对调控谷物C、N代谢的三种酶应给予更多的关注。(1)己糖激酶(HXK)。最近对植物的研究揭示了己糖激酶介导的糖传感和信号系统是一种不依赖己糖激酶的葡萄糖传感器[37］．(2)天冬氨酸氨基转移酶(AAT)。它催化氨基从天冬氨酸到α-酮戊二酸的可逆转移，生成草酰乙酸酯和谷氨酸。AAT能够相互转化这些重要的C和N化合物，这使它在植物新陈代谢的再生中处于关键位置。例如，利用包括AAT和AS在内的酶，植物直接将氮同化为惰性的天冬酰胺，它的N: C比谷氨酰胺高，因此可以在碳骨架限制的情况下更有效地运输和储存氮。(3)硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)。据报道，TRXh靶向参与C和N代谢的蛋白质，如蔗糖合成酶，磷酸甘油酸激酶，丙氨酸氨基转移酶和BiP。硫氧还蛋白增加h表达导致异常表型，如水稻在高温下的垩白和皱缩特征[38］．这部分与C和N代谢平衡的破坏有关，导致贮藏材料的生物合成异常。

在本研究中，我们检测到上述三种蛋白HXK1、AAT和TRX在白垩质胚乳和半透明胚乳中存在差异表达。对调控C和N代谢的蛋白质或基因，特别是HXK1、AAT和TRX的广泛研究，应该扩展我们对白垩质形成机制的认识。

利用iTRAQ和新的比较系统，我们比较了白垩质部分和白腹凹腹突变体的半透明部分。与以往的研究一致，我们的比较蛋白质组学分析揭示了大米颗粒白垩白背后的巨大复杂性的机制。值得注意的是，近一半已识别的蛋白质参与几个中枢代谢或调节途径，包括碳水化合物代谢、蛋白质合成、折叠和降解以及ROS代谢。然而，我们感兴趣的关键蛋白质，特别是那些涉及细胞壁合成和蛋白质折叠的蛋白质，需要使用其他方法如Western blotting来确认。该研究为在分子和生化水平上表征谷物品质途径提供了宝贵的蛋白质组学资源。进一步细化DY1102作为遗传物质将有助于最终克隆和工程与水稻垩白发生相关的主要基因。

支持数据的可用性

质谱蛋白质组学数据已存入ProteomeXchange联盟[1]通过PRIDE合作伙伴存储库使用数据集标识符PXD001030。

AAT:

天冬氨酸转氨酶

基于“增大化现实”技术:

醛糖还原酶

为:

天冬酰胺合成酶

毕普:

结合蛋白

DP:

聚合度

EMS:

乙甲烷磺酸盐

功能性:

的特性,6-bisphosphate醛糖

走:

基因本体论

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

HPSEC:

高效排垢色谱法

HSP:

热休克蛋白

HXK:

己糖激酶

iTRAQ:

等压标签的相对和绝对定量

质/女士:

高效液相色谱串联质谱法

PDI:

蛋白二硫化物异构酶

PDIL:

蛋白质二硫化物isomerase-like

PPDK:

丙酮酸正磷酸盐dikinase

经济价值:

数量性状位点

ROS:

活性氧

扫描电镜:

扫描电子显微镜

sHSP:

小热休克蛋白

TPI:

磷酸丙糖异构酶

硫氧还蛋白:

硫氧还蛋白

UPLC:

超高效液相色谱法。

国家自然科学基金项目(31171485)、国家高技术研究与发展计划项目(2014AA10A605)和国家科技支撑计划项目(2012BAD04B08)为本研究提供了部分资助。

从属关系

1. 南京农业大学农学院/农业部作物生理、生态与生产管理重点实验室，南京210095

   Zhaomiao Lin新城,小雨,Ganghua李,她唐,延锋丁Shaohua Wang和刘商谈

2. 江苏省现代作物生产协同创新中心，南京，210095

   丁艳峰，刘正辉

相应的作者

对应到商谈刘。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

ZL、XZ、ZL构思设计了实验;GL、ST和SW完成了部分实验;ZL, YD和ZL准备了手稿。所有作者已阅读并认可最终稿。

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