的2HA线Medicago truncatula具有弱乙烯不敏感的表观遗传突变体的特征

背景

的Medicago truncatula2HA种子系胚胎发生性强，亲本系杰玛龙很少产生胚胎。2HA系是由一株罕见的杰玛龙再生株系培育而成的，该方法可获得高再生基因型m . truncatula很容易复制，这暗示了一种表观遗传机制。基因芯片转录组分析显示an的下调乙烯不敏感的3-类为研究乙烯信号和2HA表型相关基因的表观遗传调控提供了一种途径。乙烯参与许多发育过程，包括体细胞胚胎发生(SE)，并与胁迫反应有关。

结果

微阵列转录组学分析显示，2HA组织培养中有大量转录本上调，包括结节和胚胎特异性基因和转座子样基因，而只有少数基因下调，包括aEIN3-like我们叫吉恩MtEIL1。这种表达的减少与2HA植物的乙烯不敏感有关，这一点得到了进一步的研究。弱乙烯不敏感影响根和根瘤的发育。测序的MtEIL1发现2HA和野生型植物之间没有差异。DNA甲基化分析MtEIL1结果表明，2HA与野生型植物之间存在显著差异。瓦片阵列显示，在与反义链杂交的2HA植物中，miRNA水平升高MtEIL1基因。aflp样甲基化分析揭示了2HA和野生型之间DNA甲基化的更多差异。分离分析证实了该菌株的隐性性质eil1表型和SE性状的显性性质。

结论

我们已经证明了EIL1的Medicago truncatula（MtEIL1)在2HA种子系中表现为表观遗传沉默。可能的原因是靶向其3'UTR的miRNA水平升高，并且与DNA甲基化有关MtEIL1。的下调MtEIL1在乙烯存在的情况下可能形成根瘤，在正常条件下影响根的生长。分离分析表明MtEIL1但乙烯信号在植物通过SE再生过程中的作用和机制有待进一步研究。这项工作还表明，在培养中诱导的特定基因的表观遗传变化可以在再生植物中固定。

正向遗传学是获得基因功能新知识的一种途径。然而，弱表型常常被忽视。反向遗传学方法是一种更密切地观察可能的表型的方法，特别是在有突变基因数据的情况下。的Medicago truncatula2HA种子系与其野生型(WT)祖系Jemalong的不同之处在于其在组织培养中产生大量体细胞胚的能力[1]。基因表达的研究指向了参与体细胞胚胎发生过程的候选基因。产生体细胞胚胎的能力往往依赖于物种甚至品种，对这一过程中关键基因的研究已经揭示了几个在不同植物物种中刺激或抑制SE的基因[2- - - - - -8]。

乙烯是一种植物激素，参与不同的发育过程:根伸长[9]、侧根萌发[10]，结瘤[11，12]，衰老[13]，果实成熟[14]及SE [15，16]。的乙烯INSENSITIVE3（EIN3）-就像（面纱)基因家族已经通过突变体和过表达实验得到了很好的表征。突变EIN3和EIL1基因引起强烈的乙烯不敏感，而其他基因的突变面纱家族成员与较弱的表型相关，这支持了他们在乙烯反应中发挥伴随作用的观点[17]。三重反应试验是为了区分对乙烯反应受损的突变体而开发的。它涉及幼苗在外源乙烯或其前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)存在下的萌发。在这些条件下，野生型幼苗表现出短、粗、过弯的三重响应表型。广泛接受的乙烯信号模型表明，在缺乏乙烯的情况下，EIN3和其他EIL蛋白会持续降解。乙烯与其受体复合物的结合导致这些蛋白质的稳定并引发下游乙烯反应。EIN3和EIL1是结合的启动子的转录因子小块土地基因和调控它们的表达。ERFs也是转录因子，它们反过来通过与其他基因的启动子结合来促进乙烯反应[18]。

本研究对2HA和Jemalong 4周龄培养物微阵列研究中表现出差异表达的基因进行了分析，其中约117个基因在2HA中上调幅度大于1.5倍。只有少数基因在2HA中下调。其中之一是EIN3-like基因(MtEIL1)在2HA植物中表达量大幅下降。对2HA系乙烯不敏感的不同方面进行了分析，确定了弱乙烯不敏感。对2HA的表型分离、DNA无突变和其他表型的分析促使我们进一步研究2HA与野生型之间的表观遗传差异。组织培养已知能够诱导许多基因组扰动和表观遗传突变[19]。我们使用一种称为扩增甲基化多态性(AMP)的任意引物甲基化敏感PCR分析方法发现了2HA和WT植物之间差异DNA甲基化的许多例子[20.]。甲基化的差异MtEIL1在2HA和WT植株之间也发现了基因。甲基化MtEIL1在2HA中，与dna 3 '区同源的小RNA丰度增加有关MtEIL1。综上所述，我们认为2HA种子系是WT Jemalong的一个表观遗传变异，其一些独特的表型很可能是由于基因的下调MtEIL1。提出的表观遗传性质的表型进行了讨论。

胚性和非胚性组织培养中基因表达的比较

为了更充分地表征2HA系，使用Affymetrix基因芯片进行了基因表达的比较。2HA和Jemalong的愈伤组织是在培养4周后，在2HA的体胚肉眼可见前不久收集的。我们之前使用了单个2HA细胞的过渡阶段培养[15]，这一阶段之前没有进行过2HA和野生型基因表达比较的研究[21]。在2HA胚胎组织培养中，有117个基因>上调1.5倍，只有7个基因>下调1.5倍。在2HA培养中，34个转录本上调2倍以上，只有2个转录本下调2倍以上。所有这些差异表达基因(t检验p值≤0.05)根据其折叠变化值绘制如图所示1。

对上调或下调至少2次的转录本进行更详细的分析(附加文件)1:表S1和附加文件2表2)。每个转录本的注释和表达式都根据数据库上的可用数据进行了检查Medicago truncatula基因表达图谱(http://mtgea.noble.org/v2/index.php) [22]，显示了基因在不同植物器官和不同实验条件下的表达。检索相应的TC或EST序列，并将预测的氨基酸序列用于BlastP搜索，以找到预测的蛋白质结构域和与其他已知蛋白质的匹配(附加文件)2表2)。的分析m . truncatula基因表达图谱显示，在2HA中上调的34个转录本中，18个为豆类特异性转录本，15个在根瘤中高表达，其中4个为根瘤特异性转录本，10个在发育种子中高表达，3个为预测转录因子。7个预测转录本编码的转座酶样蛋白含有hAT家族二聚化和/或BED锌指结构域。hAT家族二聚化结构域存在于属于hAT超家族的转座中[23]。BED锌指结构域是一种DNA结合结构域，也存在于转座酶和染色质边界元件结合蛋白中[24]。

RT- qPCR验证芯片结果

为了验证芯片结果，我们检查了7个上调的表达(图2)2)和叶片、愈伤组织和SEs中两个下调的预测转录本(RT- qPCR)。在整个培养过程中表达的两个上调的2HA转录本(Mtr.47631.1 . Mtr.10847.1.S1)是假定的转座。地铁49328.1。S1转录本在2HA愈伤组织期和m.r .47691.1高表达。s1在胚胎发生阶段的过渡阶段高度表达。两者都以nodulation(附加文件)表示2表2)。

两种预测的下调转录本在RT- qPCR中显示出几乎相同的结果(探针m .10439.1)。(1); (1);不同引物组合(F1-F6/R1-R6，附加文件)进行PCR扩增2表S4)，然后测序显示两个转录本是相同的一部分EIN3-like基因(附加文件)3.图1)，我们称之为MtEIL1并以登录号GQ914771存入NCBI GenBank。这EIN3-like基因在2周2HA胚性愈伤组织中也被列为下调，但没有详细研究[21]。第2周为早期愈伤组织阶段，开始诱导SE，第4周为愈伤组织向胚胎发生过渡阶段[25，26]。

分析EIN3-like基因MtEIL1它的蛋白质

有趣的是，只有一个基因被下调两次以上，这个基因与乙烯信号有关。乙烯已被证明是硒的重要调节因子[15，16]。RT- qPCR分析下调基因的表达MtEIL1利用2HA和WT植物不同器官的材料进行转录(图2)3.一个和3.b).在Jemalong愈伤组织的生长过程中，该基因的表达增加，但在2HA的情况下，该基因的表达仍然很低(图2)3.a).两系在愈伤组织中的表达差异可达30倍。

FGENESH程序预测了更多的ein3样蛋白(http://www.softberry.com) from availablem . truncatula基因组序列。植物ein3样蛋白的蛋白质比对及系统发育分析m . truncatula和其他蛋白质拟南芥和其他一些植物物种，然后进行(附加文件3.:图S2和图4）.其中之一m . truncatulaein3样蛋白，命名为MtEIL2(图4)，显示与MtEIL1和先前从绿豆中鉴定的EIL蛋白有密切的同源性[27]。

2HA系弱乙烯不敏感

的下调MtEIL1,我们检测了2HA系与乙烯不敏感相关的表型。我们还研究了镰状突变体的m . truncatula与WT和2HA平行，因为它们具有非常强的乙烯不敏感表型。的镰状基因突变EIN2基因，在生物化学上，是…的上游面纱乙烯反应途径中的基因m . truncatula［28]。

乙烯三重响应实验表明，在乙烯前体ACC的10 μM处，Jemalong与2HA之间无显著差异。然而，在较低水平的ACC (0.5 μM和1 μM)下，Jemalong和2HA萌发子叶的弯曲度明显不同(图2)5a - c)。即使在0.5 μM ACC下，2HA和Jemalong的根系生长也受到类似的抑制。然而，在不添加ACC的情况下，7天龄幼苗的根在2HA中比在WT中更长。在这种情况下，2HA表现出介于WT和强乙烯不敏感突变体之间的中间表型镰状(图5d e)。

因为乙烯不敏感对结瘤有强烈的影响镰状比野生型植物形成更多的根瘤[11]，我们对2HA植株进行了结瘤试验。2HA在标准条件下形成的根瘤数量与WT相近。乙烯抑制剂氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)的添加使WT和2HA植株的结瘤量增加了两倍(图2)6a)，在avg处理的两系根中，结瘤区变宽，尽管这种差异仅在野生型中显著(图2)6b)。然而，添加ACC，在WT (A17品种)中完全抑制了根瘤的形成，并没有消除2HA植物的根瘤形成(图2)6a).经acc处理的2HA上形成的根瘤在根部呈狭窄的簇状分布(图2)6b).乙烯对侧根数的影响与根瘤数成反比。ACC刺激侧根总数，而AVG对侧根总数没有显著影响(附加文件)3.:图S3)。然而，我们确实观察到野生型和2HA植物的短侧根比长侧根的比例发生了变化。avg处理的根的特点是增加了短侧根，而ACC增加了短侧根和细长侧根的数量(图2)6c和6d)。虽然乙烯对两种植物品系侧根数的影响相似，但ACC仅使野生型植物的短侧根数显著增加，而ACC在2HA突变体中引起的增加不显著(p < 0.05)(图2)6c)。相比之下，在野生型中，ACC并没有引起较长(> ~ 5mm)侧根数量的显著增加，而在2HA突变体中，较长侧根数量的增加是显著的(P < 0.05)6d).这些结果表明2HA改变了根瘤和侧根形成的乙烯敏感性。对于侧根的发育，在2HA突变体中，伸长阶段似乎是受到不同影响的阶段。

2HA系的其他发育表型与乙烯不敏感一致。延迟衰老的花，一个非常明显的特征镰状有规律地观察到2HA，但没有观察到WT Jemalong。2HA愈伤组织和镰状与WT愈伤组织相比，添加1 μM ACC的培养基对愈伤组织生长有不利影响。(附加文件2表S3)。表中总结了2HA和WT之间可以用乙烯不敏感来解释的所有表型差异1。

2HA表型的分离分析

为了深入了解2HA表型的分子性质，我们进行了研究MtEIL1WT Jemalong与2HA杂交F2和F3植株分离群体的转录本水平。在F2代和F3代分别分析了45株和85株单株(图2)7和附加文件3.:图S4)。此外，9株植物以Jemalong和2HA作为对照(图2)7）.从后代分析中可以清楚地看出，由于f1或F2杂合子的自交后代的分离约为1:8 (2HA:WT)，因此2HA表型并不是作为一个或两个孟德尔基因模型遗传的。同时，产生SE的能力是主要特征，分离比为3:1(图1)8）.SE分离数据证实了非胚性Jemalong与高胚性2HA种子系杂交的结果;F1在SE中占主导地位，F2的比例为3:1 [29]使用Rose等人1999年定义的2HA类[1]。

2HA表型的分子基础

最初，我们检查了2HA核型与野生型的大规模重排，没有发现差异(附加文件)3.:图5)。接下来，我们使用AMP，一种任意引物的甲基化敏感PCR [20.]来评估2HA和WT的全基因组DNA甲基化模式(图2)9a).很明显，在2HA中发生了许多DNA甲基化变化，但没有检测到基因组序列的变化。为了进一步研究乙烯不敏感的分子基础，我们对其进行了全长测序MtEIL1从两株2HA和两株Jemalong植物中提取基因，并发现它们之间没有核苷酸差异。我们还对该基因的启动子(2kb)进行了测序，结果也显示2HA和Jemalong之间没有差异。因为没有核苷酸突变EIL1我们检查了EIN2, MtEIL2一个预测EIN3样基因在培养WT Jemalong和2HA中的表达。在WT Jemalong和2HA植株之间没有发现差异(附加文件3.图S6，引物序列在Additional file中2:表S4)。

来自AMP PCR的数据，加上没有核苷酸突变MtEIL1，促使对DNA甲基化的详细检查MtEIL1。我们比较了甲基化MtEIL1及其在2HA和Jemalong叶片中的启动子。基因组DNA被甲基化敏感的内切酶消化，并在引物周围进行qPCR。我们发现WT和2HA在启动子甲基化上没有差异MtEIL1。2HA和WT Jemalong编码区的甲基化程度不同，2HA编码区的甲基化程度较强，而Jemalong编码区的甲基化程度较低(图2)9b, c)。利用Jemalong和2HA植物的DNA进行亚硫酸测序，证实了在消化分析中证实的甲基化分析，并显示在2HA编码区有额外的甲基化，而在Jemalong中没有(附加文件)3.:图S7)。

编码区的甲基化通常与转录后基因沉默有关[30.，31因此，我们进行了调查，以确定任何可能导致沉默的小RNA物种。一个40-nucleotideMtEIL1将20个核苷酸重叠的平铺阵列与来自2HA和野生型的小RNA杂交。通过与序列“TTCCCTT”杂交，鉴定出一个在2HA中更丰富的反义小调控RNATGGGCCAAAAAGGTGTATTCA“atttttcttcgac”位于3 '端MtEIL1(数据9b,图10a、“附加文件”3.:图S8)。利用qPCR和一系列重叠引物，将一个推测的小调控RNA缩小到40 nt序列内的较短区域(斜体)，并证实了2HA和Jemalong之间小反义RNA的表达差异(图2)10b)。

2HA植物对乙烯不敏感

an的下调EIN3-like在2HA植物的所有器官中都发现了该基因的转录本，并进一步研究了该基因的表达缺失和可能的表型。该转录物GQ914771是拟南芥的同源物EIN3我们称之为MtEIL1。的家族面纱拟南芥中的基因参与了乙烯反应途径。在六EIN3-like在拟南芥中，只有两个(EIN3和EIL1)对乙烯反应和双重反应至关重要吗ein3 / eil1突变体表现出完全的乙烯不敏感。同时，还发现了其他几个拟南芥突变体表现出较弱的乙烯不敏感[17]。的EIN3和EIN3拟南芥中的like基因功能主要通过相应蛋白的稳定性来调控[32]。

与WT植株相比，2HA系表现出较弱的乙烯不敏感性(表2)1和附加文件2表S3，图5和6)，很可能是由于MtEIL1基因。最有趣的是在外源添加的乙烯前体存在的情况下形成结核的能力(图2)6a). 2HA和WT之间的差异在标准生长条件下并不明显，除了7天龄幼苗的主根伸长增加。与拟南芥乙烯不敏感突变体命名法类似，我们提出2HA种子系具有aMedicago eil1突变体。

内源乙烯浓度较低，整个植物系统调节良好，因此差异很小(图2)6)可以导致根瘤形成完全被抑制(在1 μM ACC的情况下，WT植物)或导致根瘤数量增加两倍(在0.1 μM AVG的情况下)。乙烯可能控制感染部位的数量，因此其作用的轻微减弱会导致结节数量增加，而不会影响结节发展的一般系统[11，28]。与2HA相比，AVG在野生型中使结瘤区变宽更明显，这使人联想到AVG在乙烯不敏感型中不能使结瘤区变宽镰状突变体(33]。弱的乙烯不敏感可能是植物的优势，因为即使在乙烯浓度升高的胁迫条件下，它们也可以形成根瘤。乙烯对侧根形成和出苗的影响不明显，但在野生型和2HA之间存在显著的相对差异。乙烯对侧根形成和出苗的不同影响已在拟南芥在美国，高浓度的ACC抑制侧根原基的形成，但促进其伸长。低ACC浓度则相反，表明最佳乙烯浓度窗口很窄[34]。我们发现，在野生型植物中，较高浓度(1 μM)的ACC会导致短侧根显著增加，但较长侧根的增加不显著，与拟南芥相反，说明不同类型植物的乙烯适宜水平不同Medicago和拟南芥。令人惊讶的是，AVG对短侧数的影响与ACC相似，强调了乙烯在根内严格浓度窗口中的重要性。与野生型相比，2HA系对ACC的反应不同，侧根伸长而不短。这可能表明与野生型植物相比，2HA中乙烯的最佳窗口有所不同。

胚性愈伤组织2HA与非胚性愈伤组织WT基因表达差异

通过微阵列获得的转录谱分析揭示了相对较少的差异表达基因。与此同时，与WT相比，2HA的转录水平普遍上调(图2)1)可能对细胞命运产生累积效应，并介导进一步的发育变化[35]。带BED和hAT结构域的转座子样基因的上调BEDHAT1和BEDHAT 2（BH1存于NCBI GenBank，编号为KF679497，推测为转座酶)，在2HA培养中发现(图2)2)，可能是2HA组织培养中染色质普遍“开放”的一个指标[36]。有趣的是,BH2在合子胚胎发生和BH1根据Medicago基因表达图谱显示，在结节形成和合子胚胎发生过程中，22]。在愈伤组织培养早期(2周)，2次截止时上调和下调的基因较多，但超过99.5%的探针组在2HA和Jemalong中相似。转座酶和结节蛋白表达上调EIN3-like基因被下调[21]。似乎数组按周周期排列(如图6所示)2对于个体基因)将提供额外的见解。

在34个在2HA胚性4周愈伤组织中表达≥2倍上调的转录本中，我们发现了几个胚胎特异性基因，尽管它们的表达可能仅限于少数细胞。这些基因可作为进一步研究SE的良好标记。一些胚胎特异性基因和一些在合子胚胎发生和结节形成过程中优先表达的基因(附加文件1表S1和附加文件2(表S2)在2HA组织培养或SE中也上调。这表明这三个过程之间的共性:合子胚胎发生，体细胞胚胎发生和结节形成。在所有这些情况下，都需要重新分化，并且需要一定程度的多能性或“干性”。

2HA的SE表型与MtEIL1表达式

2HA与WT高水平杂交的F2植株MtEIL1仍然能够发育成体细胞胚胎(图2)8）.因此,低MtEIL1表达似乎并不是SE的绝对要求。2HA种子系的发育涉及到在组织培养中从体细胞胚再生植株，而SE和eil1性状研究仅限于组织培养研究，因此体细胞胚再生植株的成功率尚不清楚。由于原来的2HA线具有较低的水平MtEIL1尽管如此，修饰的乙烯信号仍然有可能在体细胞胚胎的2HA发育过程中发挥作用，并且需要进一步的研究来发现为什么这两种表型在2HA种子系中共存。一个有趣的观察显著SE (37结果表明，在四种表现出乙烯不敏感表型的植物品系中，胚胎发生性最高的品系也表现出花的延迟衰老——一种乙烯不敏感表型。我们观察到2HA延缓了花瓣的衰老。在拟南芥中也有研究表明，渗透胁迫诱导叶片中的乙烯，而不上调EIN3，分生组织被诱导[38]。乙烯已被证明是转录因子MtSERF1的激活剂，MtSERF1对SE蛋白至关重要m . truncatula［15]以及大豆和拟南芥[16]。由于在2HA中通过MtEIL1的信号传导是有问题的，它可能通过密切相关的不下调表达的MtEIL2发生。

2HA种子系的分子特性研究MtEIL1基因

MtEIL1蛋白簇与MtEIL2及其最接近的同源物是绿豆中的两个EIL蛋白(图2)4）.这两种蛋白可能同样参与了原论文中提出的乙烯信号转导途径[27]。来自拟南芥的EIN3和EIL1形成了类似的一对。在拟南芥中，EIL1与EIN3协同工作，但与EIN3不同，以调节无数的乙烯反应[39]。蛋白质比对显示，这两个mteil含有与之前发现的相同的功能域(附加文件)3.:图S2)在绿豆和拟南芥中[40]。MtEIL1和MtEIL2之间唯一的区别是在末端结构域，它们分别有9个和6个Gln/Asn残基。

的MtEIL1对基因及其启动子进行了测序，但未发现突变。用甲基化敏感限制性内切酶进行酶切，发现2HA和Jemalong植物的甲基化存在差异MtEIL1基因。DNA甲基化影响的编码区MtEIL1而不是启动子。这与2HA中小反义RNA的丰度增加有关，这是通过与平铺阵列的杂交证明的MtEIL1,RT-qPCR证实了该小RNA的存在。很有可能司机MtEIL1down regulation是一种靶向3 ' -UTR并引起下调的miRNA。为了明确后一个结论，需要一种抗mirna方法。

DNA甲基化分析和2HA表型的表观遗传性质

AMP实验获得了Jemalong和2HA基因组DNA甲基化的差异(图2)9a).尽管AMP只能对一小部分基因组进行采样，但它是WT和2HA之间DNA甲基化广泛差异的良好指标。同时，AMP谱与2HA和Jemalong基因组的等同源性一致，因为未消化DNA的谱没有发现差异。DNA甲基化变化的结果是在体外文化有很好的记录[41]，但关于个体基因变化导致表型变化的研究却很少。尽管在2HA中高度甲基化的区域(如MtEIL1)存在，2HA中的低甲基化区域可能负责转座子样基因(BH1和BH2)在2HA培养中发现。花粉重编程到体细胞胚胎发生的整体低甲基化变化已被记录[42]。我们的观察结果与2HA的起源是一致的，2HA是从经过组织培养循环的再生植物中选择出来的[1，31这表明，培养中针对特定基因的表观遗传变化可以在再生植物中固定下来。

转录基因沉默(TGS)和转录后基因沉默(PTGS)在组织培养过程中可以相互转化[31]。它们在后代中的显性和分离性差异很大，而不是简单的孟德尔比例。这些过程可能是导致2HA种子系出现的原因。

基于微阵列的转录谱分析显示，与WT相比，2HA种子系中只有一个基因下调了2倍，但有34个基因显著上调。它们大多是胚胎和结节特异性基因以及一些转座子样基因。核型未见大范围变化。甲基化分析显示2HA和WT在DNA甲基化上存在一定差异MtEIL1基因与靶向3 ' - UTR区域的小反义RNA丰度增加有关，可能导致转录后沉默MtEIL1表达式。MtEIL1下调对结瘤、根生长、根分枝等表型的影响，与弱乙烯不敏感一致。由于通过MtEIL1的信号传导尚不明确，它可能通过密切相关的表达不下调的MtEIL2发生。这些观察结果与2HA起源于经过组织培养循环的再生植物的选择一致[1，28这表明培养中的表观遗传变化可以在再生植物中固定。最后，偏析分析表明eil1性状与SE没有直接联系。

植物生长和组织培养

植物材料取自温室栽培植物。温室的光周期为14 h，昼夜温度为23/19°C。杰玛龙2HA (2HA)是一种高度再生的种子系[1]， Jemalong和Jemalong A17 (WT cv Jemalong种子的代表)为WT。WT Jemalong很少产生体胚，本研究未形成胚。在其他研究中，WT Jemalong和WT Jemalong A17是可以互换的，例如Rose等。[43]。标准组织培养程序如下所述[44]。在P4 10:4 (10 μM NAA, 4 μM BAP)培养基上培养3周，再转入P4 10:4:1 (10 μM NAA, 4 μM BAP, 1 μM ABA)培养基。培养是在黑暗中培养的。胚胎性愈伤组织发育序列的时间进程先前已被记录[25，26]。第一周发生去分化，第一周结束时可见愈伤组织，第二、第三和第四周愈伤组织继续形成，并发生SE的诱导过程。第4周开始由愈伤组织向胚过渡。这就是2HA和WT在形态上开始分化的地方。

根系生长与乙烯三重响应试验

种子浸泡在浓H中₂所以₄用水冲洗2分钟，用稀释的漂白剂(0.5%次氯酸钠(w/v))消毒6分钟，然后用无菌水冲洗3次，铺在滤纸上，放在P40培养基的培养皿中[45]。每种基因型使用60 - 80粒种子。发芽7天后测量根长。Tukey-Kramer试验证实(p < 0.05)三种基因型(Jemalong、2HA和镰状)差异显著。乙烯在萌发后4天进行了三重响应测量。在P40培养基和0.5 μm ACC和1 μm ACC的P40培养基上观察到子叶弯曲。子叶与茎形成的角度< 90°的子叶被视为弯曲。这个实验重复了三次。

结瘤和侧根测定

将A17 (WT)和2HA的种子在砂纸上割下，用6% (w/v)的次氯酸钠在摇床上灭菌10分钟，在无菌水中洗涤5次，然后在水琼脂板上进行电泳。种子在4°C下放置两天，然后转移到25°C过夜发芽。然后将种子转移到fatehreus培养基中[46琼脂板，每板5株苗，每次处理5株苗(即每次处理25株苗)。幼苗在生长室内生长3天，光照强度约为100 μE，温度为25℃，昼夜周期为16 h/8 h。一种文化Sinorhizobium meliloti菌株1021在Bergensen改良培养基中培养[47在28°C的振动培养箱中过夜，并调整到外径₆₀₀0.1。第3天，将根转移到含有1 μM ACC、0.1 μM AVG或溶剂(1 μL/L的甲醇)的fa hreus培养基琼脂板上作为对照。在植物生长室内培养24 h以适应改变后的激素培养基后，将根接种10 μL的美国meliloti在出现根毛的区域(即发芽后第4天)。将培养皿送回植物生长室(条件同上)，静待生长四周。

在解剖显微镜下对结节进行计数。对侧根数进行计数，并将其分为长度小于5mm或小于5mm。用尺子测量被根瘤覆盖的根长(沿根第一个到最后一个根瘤)。使用InStat version 3.06 for Windows (GraphPad Software)对所有数据进行统计分析。由于大多数数据不是正态分布，比较采用Kruskall Wallis检验和Dunn多重比较后验检验。

mRNA微阵列分析

使用RNAqueous™-4PCR Kit (Ambion，http://www.ambion.com/）.根据Affymetrix手册(Affymetrix，http://www.affymetrix.com/）.数据处理按上文所述进行[21]。使用GCRMA算法对原始数据进行背景校正、归一化、汇总和log2变换。2.2.0)使用affy生物导体软件包[48使用默认参数。规范化数据在附加文件中提供1表S1。结合标准，通过评估胚性和非胚性组织培养的log2比值来鉴定差异表达基因t以及。

RT-qPCR

提取总RNA用于微阵列分析。利用SuperscriptII (Invitrogen)合成cDNA;http://www.invitrogen.com/）.PCR主混合物使用白金Taq聚合酶(Invitrogen)与提供的缓冲液和1.5 μM的SYTO9染料，引物在0.4 μM和3 mM dNTPs。Corbett Rotor-Gene 6000 (Qiagen，http://www.qiagen.com/)机器进行实时PCR。qPCR循环条件包括95°C初始变性2 min，然后95°C 10 s, 60°C 30 s和72°C 30 s的40个循环。每次运行进行解离分析(0.5°C步)，并通过凝胶电泳检查产品以确保产品均匀性。数据分析采用Q-Gene软件[49]。的GAPDH吉恩被用作校准器。GAPDH是否有合适的参考基因m . truncatula基于geNORM软件[50]和我们之前对SE的微阵列和RT- qPCR研究[15]。三次生物重复实验一式三次。引物序列在附加文件中列出2表S4。

氨基酸排列和系统图

利用ClustalX 2.0.10对全长氨基酸序列进行比对[51]。使用PHYLIP [Phylogeny Inference Package Version 3.69;［52]，并以树镜绘制[53]。

染色体组型

从发芽的种子中收集活跃生长的根尖(2cm)，放置在冰上22小时。根尖在3:1乙醇:丙酸中固定3天，其中溶解0.2% (w:v)六水氯化铁作为催熟剂。固定后，将根尖在60°C的1n HCl中水解6分钟，并在醋酸乙醇(1% (w:v)乙醇在45% (v:v)乙酸中染色5天。然后用1% (w:v)果胶酶在25°C下处理1 mm分生组织区域30分钟，然后在45% (v:v)乙酸中处理5分钟。南瓜在45% (v:v)醋酸的载玻片上进行，盖盖用石蜡密封。使用蔡司Axiophot显微镜和蔡司Axiocam HRc数码相机拍摄照片。

启动子分离

隔离MtEIL1使用改良的基因行走技术(Clontech;http://www.clontech.com)，其中第一个基因特异性引物被生物素化。第一轮PCR后，将所得产物固定在Dynabeads M-280 (Invitrogen)上，用所提供的缓冲液洗涤，并使用嵌套引物进行第二轮PCR。的序列MtEIL1启动子存于NCBI GenBank，编号为EU499308(附加文件)3.:图S1)。

甲基化分析

采用CTAB法从4株Jemalong和4株2HA植株叶片中分离基因组DNA [54]。用于任意检测基因组DNA甲基化变异的AMP (amplification methylation polymorphism，放大甲基化多态性)方案在[20.]。检测体内的差异甲基化MtEIL1在2HA和Jemalong55]， DNA (10 μg)用AciI (New England Biolabs;http://www.neb.com)，并通过PCR净化柱(Promega，http://www.promega.com）.测量、调整DNA浓度，并使用围绕酶切位点的引物(引物对F2/R2和F4/R4)进行后续qPCR。归一化是使用部分的MtEIL1没有这些酶位点的基因。引物F5和R5与研究区F2/R2和F4/R4相邻。包含这三个片段的整个位点短于2kb，被AciI位点包围，易于分离。未消化的DNA被平行使用，所有产品都在凝胶上进行检查，并进行熔化曲线分析，以证明产品的特异性。引物序列在附加文件中列出2表S4。

对于亚硫酸盐测序，使用methylleasy™bisulphite Kit (Human Genetic Signatures, Australia)制备DNA。http://geneticsignatures.com/)从3周龄的组织培养物或从3个生物重复的叶片中提取。部分MtEIL1编码区和启动子用几对引物扩增(附加文件2:表S4)。PCR产物直接测序，在2HA中检测到CpG >位点的TpG转化，但在Jemalong中未检测到甲基化。用bFor2和bRev2引物扩增的片段甲基化差异最大。

小rna分析

一个40-nucleotideMtEIL1贴片阵列由LC Sciences (Houston, Texas, USA)定制，有20个核苷酸的步骤，与2HA和野生型愈伤组织培养的RNA杂交两周。提取RNA，用荧光团Cy5标记，并按前面描述的方法与阵列杂交[56]。采用miScript PCR系统(Qiagen)，用一组引物(附加文件中的M1 ~ M7)进行qPCR扩增2(表S4)，跨越潜在的miRNA序列。基因特异性引物与miScript PCR系统(Qiagen)提供的接头引物一起使用。M5引物用于比较2周龄组织培养中分离的2HA和Jemalong RNA(图5)10b)。

支持数据的可用性

支持本文的所有数据集都可以在本文和其他文件中获得。微阵列数据存储在NCBI GEO存储库中，GEO登录号为GSE58223http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58223。

这项工作由澳大利亚研究委员会(CEO348212)通过ARC综合豆类研究卓越中心(CILR)资助。我们感谢Mary Liu和S.J. Sim提供的技术援助，Larry Croft博士提供的平铺阵列，Feky Mantiri博士提供的愈伤组织生长分析，Olga Berking提供的帮助。

从属关系

1. 纽卡斯尔大学环境与生命科学学院，澳大利亚新南威尔士州卡拉汉

   谢尔盖·库久科夫，金·E·诺兰，迈克尔·B·谢汉和雷·J·罗斯

2. 澳大利亚国立大学生物研究学院植物科学部，堪培拉

   Ulrike Mathesius & Nicolas Goffard

3. 澳大利亚布里斯班，昆士兰大学化学与分子生物科学学院

   伯纳德·J·卡罗尔

4. 澳大利亚新南威尔士州圣伦纳兹皇家北岸医院科林医学研究所

   谢尔盖Kurdyukov

5. Enterome生物科学，巴黎，法国

   尼古拉斯Goffard

相应的作者

对应到雷·罗斯。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SK进行了实验工作，数据库挖掘，并起草了手稿。UM进行了侧根生长和结瘤分析，并参与了手稿的撰写。KEN进行了一些qPCR实验和分析，并参与了稿件的撰写。MBS进行了系统发育分析并讨论了结果。NG进行了与微阵列实验相关的生物信息学研究。BJC监督AMP测定，平铺阵列，讨论结果并对手稿做出贡献。RJR监督分析，讨论结果并严格修改手稿。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

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