三倍体洋葱的三亲代起源，gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba(Clementi ex Visiani, 1842)，分子、系统发育和细胞发育分析证明了这一点gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

从野生亲本中重建栽培植物的亲本起源，特别是经过长时间的驯化，并不是一项简单的任务。然而，在其他方法中，分子系统发育学的最新进展已被证明对多倍体基因组的起源和进化的分析非常有用。一种已建立的小型园艺作物，三倍体洋葱gydF4y2Ba葱×角草gydF4y2Ba(克莱门提·西西亚尼，1842年gydF4y2BangydF4y2Ba= 3gydF4y2BaxgydF4y2Ba= 24)，广泛分布于亚洲东南部和欧洲。我们先前的细胞遗传学分析证实了其高度杂合的核型，并指出其可能的复杂的三亲本基因组起源。gydF4y2Ba洋葱gydF4y2Bal .,gydF4y2Ba葱属植物royleigydF4y2Ba硬脂被认为是两种假定的亲本种gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba，而第三亲本物种至今仍不为人所知。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

在此，我们报道了35S rDNA的内部转录间隔its -5.8 s - its2和5S rDNA的非转录间隔区(NTS)的系统发育分析gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba和它的亲戚节gydF4y2BaCepagydF4y2Ba．ITS和NTS序列数据均显示了三倍体洋葱的个体内变异，这些数据集中在三个主要分支中，每个分支与其他三个分支中的一个具有高度的序列同源性gydF4y2BaCepagydF4y2Ba：gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba，以及意想不到的亚洲野生物种gydF4y2Ba葱属植物pskemensegydF4y2BaFedtsh。gydF4y2Ba葱属植物pskemensegydF4y2Ba因此被推断为第三种，到目前为止未知的，公认的三倍体洋葱的亲本物种gydF4y2Ba葱×角草gydF4y2Ba．35S和5S rRNA基因定位于黄豆的体细胞染色体上gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba以双荧光法测定其推测亲本种gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交(鱼)。35S和5S rDNA的定位gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba染色体在三个假定的亲本物种中对应各自的位置，gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:roylei。gydF4y2Ba吉斯”(基因组gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba用三个假定的亲本二倍体的DNA进行杂交，证实了系统发育研究的结果。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究获得的分子、系统发育和细胞遗传学数据为三倍体洋葱的一个独特的三亲代起源提供了证据gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba假设有三种亲本物种，gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:roylei。gydF4y2Ba

多倍体和杂交被认为是伴随和促进植物多样化和物种形成的重要过程。异源多倍体是植物进化过程中一个特别重要的驱动力，它涉及这两个过程。推断异源多倍体的亲本起源并不是一项简单的任务，特别是经过长时间的杂交驯化之后。最近的技术进步和DNA序列数据在系统发育重建中的普遍使用使这一领域发生了革命性的变化，并使许多异源多倍体的亲本分类群得以识别[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．大多数已建立的异源多倍体是双亲本起源。很少有关于三亲体多倍体的报道，尽管众所周知的例子包括普通小麦，gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba，为异位六倍体，起源为三亲代[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和四倍体绫玫瑰[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．大多数已知的异源多倍体是建立在偶倍性水平上的，很少有自然界中持续存在的奇倍性水平的类群(如五倍体)gydF4y2Ba狗牙蔷薇gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

三亲本奇倍体植物异源多倍体很少被发现。建立的和营养繁殖的三倍体先前的分析gydF4y2Ba葱×角草gydF4y2Ba(Clementi ex Visiani, 1842)认为这是一种罕见的三亲本同源异体三倍体，基于GISH (genome . GISH)对染色体补体的细胞遗传学分析，提出了两个亲本类群gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交)[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．第三个亲本分类单元仍然未知。三倍体的洋葱gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba传统上种植于克罗地亚南部和沿海地区，名为“Ljutika”(在克罗地亚语中意为“红葱头”)，由于其球茎和叶子美味可口，因此非常受欢迎作为香料和调味品[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．类似的三倍体洋葱在东南亚、欧洲和世界其他地区作为园艺作物种植[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．三倍体洋葱最早被描述为gydF4y2Ba洋葱gydF4y2Bal . var。gydF4y2BaviviparumgydF4y2Ba(Metzg)。Alef。［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba];然而，Friesen < Klaas [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]表明这个名字与另一种胎生洋葱有关gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BaproliferumgydF4y2Ba他们建议使用这个名字gydF4y2Ba葱属植物cornutumgydF4y2Ba克莱门蒂·西西亚尼[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，这是唯一一个明确与三倍体洋葱(triploid onion)有关的名称[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．然而，考虑到它的杂交血统，名字被修改为gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这个名字最初是由Visiani使用的[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，这是在杜布罗夫尼克的岩石上首次观察到的达尔马提亚球根分类单元[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

与大多数在开花期间叶子开始衰老的开花葱不同，三倍体洋葱是多年生植物;它们的叶子全年都是绿色的。植株是不育的，通过地下鳞茎和由花序形成的鳞茎进行营养繁殖。从表型上看，三倍体洋葱非常相似gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba在花序发育之前，有时很难区分这两种类型。三倍体洋葱的花序由较少而略大的花组成gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba花序。在花序成熟期间，形成小的生殖球茎，花逐渐枯萎。成熟的花序可能包含20-30个小的生殖鳞茎。其他可靠的性状，允许区分三倍体葱和gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba是三倍体洋葱地下鳞茎的形态特征，鳞茎细长，呈梨形;10-20个或更多的球茎通常生长在一起。三倍体洋葱的叶子是半圆形和圆形之间的中间形状，带花序的茎只在底部略扁平，而洋葱的茎则在底部略扁平gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba底部膨胀[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

的核型gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba由2个组成gydF4y2BangydF4y2Ba= 3gydF4y2BaxgydF4y2Ba= 24条染色体[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．染色体之间的同源性是微弱和偶然的，因此，即使不是不可能，也很难识别同源染色体[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．最常见的减数分裂染色体关联gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba是异三价，这表明三个基因组至少部分同源[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．此外，还观察到复杂多价体的频繁出现，提示三倍体核型可能是由于进化过程中的易位和其他染色体重排[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．本构异染色质的映射gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2BaGiemsa c -带显示其杂交基因组结构，只有一组8条染色体携带典型的异色标记gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．此前，三倍体胎生洋葱被推测为同种异体(AAB)中的一种[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]或节段异体三倍体(AA 'A ")起源[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．一些独立的分子研究指出gydF4y2Ba洋葱gydF4y2Ba作为推测的亲本种之一gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba(叶绿体DNA和核rDNA的RFLP分析[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，同工酶分析[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]， RAPD分子标记分析[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

要确定gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba起源、基因组gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba应用杂交(GISH) [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．弗里森<克拉斯[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)确认gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba作为一个三倍体洋葱的亲本种，并得出结论，大部分的DNA和染色体gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba起源于gydF4y2Bacepa。gydF4y2BaPuizinagydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba的基因组DNAgydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba每个只有或主要标记只有一个染色体组(含有C - A基因组DNA的8个染色体)。gydF4y2BacepagydF4y2Ba还有8个R - A。gydF4y2BaroyleigydF4y2Ba)．其余三倍体核型染色体未被这两个基因组探针标记(或仅部分或弱标记)。这些GISH结果首次表明，三倍体洋葱可能是复杂的三亲代起源。gydF4y2Ba

植物亲本种鉴定的新进展gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2Bacornutum,gydF4y2Ba一种“神秘的植物”[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]，由于缺乏关于普通洋葱及其野生亲缘之间的系统发育关系的信息，该研究受到了阻碍gydF4y2BaCepagydF4y2Ba属gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba)．最近，源自中亚的大量普通洋葱亲缘的ITS序列(18S-5.8S-26S rDNA的内部转录间隔子1和2)被存入GenBank [gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]以及5S rDNA的NTS(非转录间隔)序列[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ITS序列经常被用作推测各种野生植物类群之间的系统发育关系的首选标记，特别是用于推测二倍体和多倍体杂种的起源(例如，[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba])。ITS 1和ITS 2是18S-5.8S-26S核糖体DNA的一部分，以高拷贝数的串联重复出现在每个真核基因组中，每个单倍体基因组中有一个或多个位点[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．rDNA单元容易通过不平等的交叉和/或基因转换而均质化[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．杂交生物的亲本rDNA拷贝可能以不同的方式进化:(1)两种亲本rDNA类型可能被保留，独立进化，并为历史杂交提供直接证据，包括多倍体或非多倍体(二倍体同倍体杂交与异源多倍体杂交);(2)杂交种基因组中可能只保留一种亲本rDNA类型，这通常可以通过将所有rDNA类型转化为一个亲本基因组rDNA来实现，或者从杂交种基因组中删除一个亲本基因组的rDNA;(3)杂交种可能进化出新的rDNA单元类型，可能(也可能不)代表不同亲本rDNA单元的组合(见[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

rRNA基因的另一个亚家族包含5S rDNA重复序列，在基因组的一个到几个位点上排列成长串联阵列。5S rDNA单元由一个长度约为120 bp的编码区(基因)和一个非转录间隔区(NTSs)组成，NTSs在植物中长度和碱基组成从约100到700 bp不等[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．5S RNA的编码区高度保守，而NTS的进化要快得多。在某些植物类群中，NTS碱基替换率很高，这一区域为分子系统发育分析提供了大量信息，常常有助于鉴定二倍体和多倍体杂交种的亲本类群[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．5S rDNA不经历均质化，除非从染色体上物理删除，否则所有类型的亲本重复序列都可以在杂交种中检测到[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．缺乏有效的均质化导致单个阵列内5S rDNA间隔区之间存在相当大的序列异质性，这在几个植物群中已被报道过[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

本文对同种异体的亲本起源进行了推断gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba利用35S rDNA的内部转录间隔子(ITS1-5.8S-ITS2)和5S rDNA的非转录间隔子(NTS)进行分子系统发育分析。这两类核糖体基因在体细胞染色体上的位置也已被确定gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba，而推测的亲本物种则由系统发育分析推断(gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba)．的三亲本起源gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba是用基因组证实的吗gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交(GISH)技术。根据先前发表的关于三倍体洋葱基因组起源、结构和进化的数据，对新获得的数据进行了讨论gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2Bacornutum。gydF4y2Ba

ITS和NTS序列的分子系统发育分析gydF4y2Ba

四种分析的ITS1-5.8S-ITS2区域的长度gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba个体(每一个代表一个不同的群体;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)范围为627至642 bps。48个序列(克隆)的最终ITS比对gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba有583个常量字符;17个是吝啬-无信息型，27个是吝啬-有信息型。总共发现了19种不同的核型，其中最常见的核型(以GenBank登录号KC783412表示)由来自所有四个个体的24个克隆所代表(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．可变性状在ITS1区为18个，在5.8S rRNA区为4个，在ITS2区为22个gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

ITS区域的序列gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba与其他ITS序列数据对齐gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba断面种类gydF4y2BaCepagydF4y2Ba可在GenBank中获得(见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba有关详情)。ITS1-5.8S-ITS2序列中有三个不同的分支gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba基因组(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa、附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。大部分序列(41条序列)形成了一个大的分支，其中还包括亚洲野生种的ITS序列gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba因此被命名为xas clade P ("gydF4y2BapskemensegydF4y2Ba“类型)。第二枝，包含六个ITS序列gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba的序列组合在一起gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba并被指定为R分支("gydF4y2BaroyleigydF4y2Ba“类型)。一个序列的gydF4y2Baa×cornutumgydF4y2Ba(来自Hvar的个体)表现出与gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:vaviloviigydF4y2Ba序列，因此，整个演化支被命名为演化支C ("gydF4y2BacepagydF4y2Ba“类型)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa) 7个gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba由演化支R和C组成的ITS序列在ITS2区有一个可清晰区分的13碱基(CTGTAAACATACT)插入，由两者共享gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba但不在gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。gydF4y2Ba

存在不同的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA重复类型gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba基因组和它们与假定亲本物种的遗传相似性gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba经系统发育分析证实。系统发育算法最大似然(ML)和贝叶斯推理(BI)得到了几乎相同的树拓扑结构。只显示BI树(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa)，它总结了BI的拓扑和后验概率(PP)和ML分析的自举支持(BS)。所有的ITS序列gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba聚集成三个分支:P, R和C(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa).进化支P和R均得到两种分析的强烈支持(进化支P: 1.0 PP, 98% BS;枝R: 0.98 PP, 97% BS)。包含单个的枝CgydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba序列(Hvar 21)和序列gydF4y2BaA. cepa, A. vaviloviigydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:asarensegydF4y2Ba支持度较低(1.0 PP;69% BS)。gydF4y2Ba

目的:分析小鼠5S rRNA基因非转录间隔(NTS)的变异性gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba从3个样本中获得19个克隆gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba个人(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．NTS区序列变异较ITS1和it2区高。几乎所有的克隆序列都是独一无二的。5S rDNA单元包括非转录间隔区(NTS)的长度为339 ~ 346 bps。保守的5S rRNA编码区被排除在进一步分析之外。NTS区域由224-231个字符组成，其中常量148个，变量73个(包括53个简约无信息字符和20个简约信息字符)。在对齐中，总共有13个位置包括间隙(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。gydF4y2Ba

NTS克隆的系统发育分析gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba以及从GenBank中检索到的潜在近亲属的NTS序列gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)支持的分组gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2BaNTS序列转化为三个支持良好的分支(P, R和C;数字gydF4y2Ba1gydF4y2Bab).最大的演化枝由11个序列组成，与的NTS序列组合在一起gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BaproliferumgydF4y2Ba(88-92%的相似性)，该演化支被命名为演化支p。第二大演化支(R)由的5个NTS序列组成gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba，它们与gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba新界南地区(相似度89%)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba最小的演化支(C)仅由三个NTS序列组成gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba的NTS序列同源性99%gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:vavilovii。gydF4y2Ba最大的分支P，由11个NTS序列组成gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba已经与它最近的亲戚的NTS序列明显分离，gydF4y2Ba答:altaicumgydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BaproliferumgydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2Bab)。gydF4y2Ba

5S rDNA和35S rDNA基因的染色体定位和基因组gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交gydF4y2Ba

在两个克隆中分析5S和35S rDNA位点的数量和定位gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba(Dubrava和Vis)和在系统发育分析中确定的三个假定的亲本二倍体类群:gydF4y2Ba洋葱gydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:roylei。洋葱gydF4y2Ba在两个卫星染色体对中有两个35S rDNA位点和两个5S rDNA位点，均位于第7号染色体的短臂上(图gydF4y2Ba2gydF4y2Baa, b). 35S rDNA位点的强度(和可能的重复拷贝数)不同。gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba有一个35S rDNA亚末端位点位于一个卫星染色体对上，5S rDNA在第6号染色体上最多有两个位点(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, d)。5S rDNA的一个较大的位点位于6号染色体短臂的间质内，另一个较弱的位点位于同一染色体长臂的中心周围区域。两条携带5S rDNA的同源染色体在长染色体臂的周熵区存在一个小的5S rDNA信号，表现出杂合性(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bac, d)。gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba在一个携带卫星的染色体对上拥有一个35S rDNA位点(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bae, f)和7号小稳心染色体上两个大小相近的5S rDNA位点。其中一个5S rDNA位点定位在靠近中心周围区域，另一个定位在同一手臂内部(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Bae、f)。gydF4y2Ba

在三倍体gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba，在两个亚远心卫星染色体的短臂上检测到35S rDNA的两个主要亚末端定位信号。第三个35S rDNA信号在一些播散中被检测到，位于一个小的亚稳定中心染色体的次端粒区域(图中白色箭头)gydF4y2Ba2gydF4y2Bag, h, i).最大的卫星染色体(类似于gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba)缺乏35S rDNA信号。三个35S rDNA信号的强度和大小不同，中等大小的染色体携带的信号最强。gydF4y2Ba

5S rRNA基因在3条不同大小的染色体上被检测到gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bag, h, i)。携带5S rDNA信号的最大染色体与典型的相似gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba2个5S rDNA位点位于第7号染色体长臂内。中等大小的染色体携带5S rDNAgydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba有2个5S rDNA位点，其大小和强度不同，较强的信号位于短臂的中间部位，较弱的信号对应于长染色体臂的近熵区。该染色体与携带5S rdna的染色体相似gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba染色体。三倍体中携带5S rDNA的最小染色体gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba在短染色体臂的近熵区只有一个信号(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bag, h, i)。该染色体可能代表一个截断和/或重排的7号染色体gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bae、f)。gydF4y2Ba

5S rDNA的FISH定位结果支持了三亲本的5S和35S rDNA系统发育分析的推论gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba三倍体。携带5S rDNA基因的三条染色体gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba很可能起源于三个不同的二倍体gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba物种(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基因组的组合gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba采用GISH和FISH方法尝试鉴定5S rdna染色体的基因组起源(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba模拟;5b, c)。携带两个5S rDNA位点(标记为P)的单个染色体被明确标记为gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba相比之下，携带5S rDNA信号的另外两条染色体(命名为R和C)仍未被标记或仅被弱标记(图gydF4y2Ba4gydF4y2Bab)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba基因组DNA的杂交gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba的不完全中期板gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba存在过多的未标记gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba总基因组DNA作为阻断DNA(图gydF4y2Ba4gydF4y2BaC)允许标记三倍体洋葱的6条染色体，用箭头标记。在带有。标记的染色体中gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba基因组DNA，一条携带5S rDNA的染色体(标记为R;数字gydF4y2Ba4gydF4y2Bad).该染色体对应最小的5S rdna携带染色体，可能是截短的gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba-起源染色体(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．目的是同时区分三个基因组gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba(假设的C, R和P基因组)，我们进行了基因组gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba以两个标记的亲代DNA序列为探针进行杂交(gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba基因组DNA标记为绿色;gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba基因组DNA标记为红色)，而gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba仍未被标记，并被用作阻断DNA(图gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b). 8条染色体标记以gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba基因组DNA (P-genome;绿色的;数字gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个);此外，8条染色体主要与gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba基因组DNA (R-genome;红色)，还有8条染色体几乎没有标记(c基因组，蓝色)。随后用35S和5S rDNA探针重新检测染色体。图的比较gydF4y2Ba5gydF4y2Bab和c证实了gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba属于三个不同的亲代基因组。gydF4y2Ba

三亲本异源多倍体起源gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba以及其推测亲本种的鉴定gydF4y2Ba

关于三倍体洋葱的起源已经发表了两项相互矛盾的研究gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba(6, 11;复习12]。曾有人提出三倍体的三亲本起源，但只提出了两个假定的亲本类群(gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba)，第三个亲本分类单元仍然未知(所谓的“X基因组”;［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba])。本研究为三亲本杂交起源提供了系统发育证据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba分析了拟亲本类群和杂交种染色体上的5S和35S rRNA基因。此外，第三个假定的亲本种，亚洲野生种gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2BaFedtsh。，has been identified. These data support the complex hybrid origin ofA. ×角gydF4y2Ba并允许拒绝之前的假设[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba的起源gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba作为gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba．目前的研究清楚地证明了这一点gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba包含ITS和NTS序列的三种类型，每一组包含三个假定的亲本类群中的一个，gydF4y2Ba葱属植物pskemensegydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

尽管存在一定程度的交叉杂交，但GISH可以检测到杂交种中的三个亲本基因组。利用GISH和FISH的组合分析表明，该杂种的5S和35S rdna携带染色体分别来自于假设亲本的染色体。gydF4y2Ba

ITS序列变异与35S rDNA作图gydF4y2Ba

植物ITS区系统发育分析gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba揭示了ITS的三种主要类型，分别为P、R和c。这些类型在组合分析中被恢复为独立的分支，并显示出与三种二倍体具有高度的序列相似性gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba物种/血统:gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba/gydF4y2Ba答:vavilovii。答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:vaviloviigydF4y2Ba密切相关的，与gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba只被认为是栽培分类单元的;gydF4y2Ba答:vaviloviigydF4y2Ba被推断为其最接近的野生亲缘[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

同时，在三倍体洋葱的三个不同染色体上检测到三个35S rDNA位点，与之前的报道一致[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，可以被分配到三个假定的亲本基因组。我们之前的GISH分析[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]表明携带最大35S rDNA位点的中等大小NOR染色体也不与的基因组探针杂交gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba或gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba，因此被分配到未知的X基因组。目前的研究表明，该位点起源于gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba并且是ITS克隆序列的大部分区域(48个ITS克隆中的41个)的来源。主要的35S rDNA位点起源于gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba基因组要么在三倍体基因组进化过程中丢失，要么只包含极少数低于FISH检测极限的拷贝。第二(小调)gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba在三倍体杂交种中检测到的位于中等亚中心染色体上的位点，其拷贝数非常小，可能处于丢失过程中。CgydF4y2Ba-gydF4y2Ba型(克隆Hvar 21)从三倍体洋葱基因组中恢复可能代表gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba小35S rDNA位点gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

早期用银染色法对三倍体洋葱NOR区活性的分析表明，所有3个35S rDNA位点都是活跃的，在所有5个克罗地亚无性系的间期核中最多检测到3个核仁gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．相比之下，Pran是三倍体的印度克隆体gydF4y2BaA. ×角，gydF4y2Ba在一个中等大小的卫星染色体上只有一个活跃的NORgydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．这一结果表明，三倍体洋葱的rDNA在整个物种分布范围内不断进化。根据Pran、Ljutika和其他三倍体洋葱无性系的独特基因组大小、同工酶、RAPD和RFLP模式，目前排除了该三倍体杂交种的多重起源[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

NTS序列变异与5S rDNA定位gydF4y2Ba

在几个记录良好的异源多倍体系统中，NTS序列的发散被证明对确定的亲本种的鉴定非常有用:即，gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba［gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，gydF4y2BaZingeriagydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba海葵multifidagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:baldensisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),而gydF4y2BaMelampodiumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．5S rDNA NTS序列gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba聚成3个主枝(C、P、R)，与3个推测的亲本种具有高度的序列同源性gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba,分别。而进化支C (gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba)和R (gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba)得到了很好的支撑，支系P (gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba)未能与它最近的亲缘动物形成一个完整的分支，gydF4y2BaA. pskemense, A. altaicumgydF4y2Ba,gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2Baproliferum。gydF4y2Ba这一结果可能是由NTS区域内显著的个体内部变异引起的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]以及体内5S rDNA的高遗传变异gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba和它的亲戚在他们广阔的地理分布。gydF4y2Ba

NTS序列分析结果与5S rDNA的细胞遗传学定位结果基本一致gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2Bacornutum,gydF4y2Ba在3条不同形态染色体的不同位置检测到5S rDNA位点。两个较大的5S rdna携带染色体与假定的亲本染色体非常相似gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:pskemense。gydF4y2Ba携带5S rDNA的染色体，其5S rDNA位点的分布方式与中相似gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba还被贴上了gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2BaGISH实验中的基因组DNA。最小的含5S rdna染色体gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba已经被证明与基因组DNA杂交gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba([gydF4y2Ba6gydF4y2Ba];)，从而证实其起源于R基因组(gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba)．然而，该染色体与携带5S rdna的亲本染色体不同gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba在染色体短臂的近熵区只有一个5S rDNA位点，而不是两个。至少有两种不同的情况可以解释观察到的截断:i)最小的5S rdna携带染色体和整个R基因组可能起源于一个二倍体祖先密切相关gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba，其特征是染色体较小，只有一个5S rDNA位点;和二)染色体gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba来自R基因组的基因在杂交后发生了重排，并在这个过程中丢失了一个5S rDNA信号。基于我们目前对异源多倍体化后基因组重组的理解，以及5S和35S rDNA位点二倍体化的总体趋势，第二种假设更有可能[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba57gydF4y2Ba的顺序，尤其因为gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba在演化支“R”中有非常相似的gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba．的三倍体基因组gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba可能遭受了额外的基因组重排，如染色体间易位、缺失和/或倒置。gydF4y2Ba

35S和5S rRNA基因的FISH定位gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba并在剖面上推断系统发育关系gydF4y2BaCepagydF4y2Ba

虽然12个种之间的系统发育关系gydF4y2BaCepagydF4y2Ba已从质体区和ITS的分析中推断出[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]，目前只确定了三个物种的35S和5S rDNA的染色体位置:gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:fistulosumgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:altaicumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba58gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．两个5S rDNA位点gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba位于7号染色体的较长臂(我们的数据证实了这一点)，而在gydF4y2Ba答:fistulosumgydF4y2Ba在第7号染色体短臂间质中检测到单个5S rDNA位点。天然二倍体同倍体杂种gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:fistulosmgydF4y2Ba洋葱(gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba×gydF4y2BaproliferumgydF4y2Ba(Moench) Schrad。而且gydF4y2Ba葱属植物wakegigydF4y2Ba荒木(2gydF4y2BangydF4y2Ba= 16)，两条携带5S rDNA信号的染色体对应亲本种的携带5S rDNA染色体[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．本研究首次在二倍体体细胞染色体上定位了35S和5S核糖体基因gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba．这两个物种在第7号染色体上的35S rDNA位点数量相同，但5S rDNA位点位置不同。5S rDNA的定位gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba7号染色体与gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba,而gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba更类似于gydF4y2Ba答:fistulosumgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:altaicum。gydF4y2Ba这一发现支持了孙兴慜的假设gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba更密切相关gydF4y2Ba到A. fistulosumgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:altaicum。gydF4y2Ba因此，5S rDNA位点的数量和位置，被证明是进化信息的物种分析gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba从部分gydF4y2BaCepagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

本研究获得的分子系统发育和细胞发育数据为三倍体洋葱的一个独特的三亲代起源提供了证据gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba并鉴定了所有三种二倍体亲本物种，gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba，gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba,gydF4y2Ba答:roylei。gydF4y2Ba这些结果与先前发表的数据一致[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba并为独特而复杂的奇倍体异源多倍体的起源提供了新的更有力的证据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba．导致三倍体洋葱起源的事件序列和它的系统地理学还无法阐明，将使用其他分子方法来解决。gydF4y2Ba

植物材料和DNA提取gydF4y2Ba

四个克隆gydF4y2Ba一个。gydF4y2Ba×gydF4y2BacornutumgydF4y2Ba(在克罗地亚被称为Ljutika)是从克罗地亚海滨地区(Dubrava和kattela)和岛屿(Vis, Hvar)四个相隔很远的地方的当地花园和葡萄园中获得的。gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2BaFedt。(CGN21442)和gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba硬脂(CGN20520)种子由荷兰瓦赫宁根植物育种和繁殖研究中心提供。商品品种gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Bacv， ' Holland Yellow '用于获得的DNA和染色体互补gydF4y2Ba答:cepagydF4y2Ba根据Saghai Maaroof的方法，用CTAB法从幼叶中提取基因组DNAgydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

PCR扩增和克隆gydF4y2Ba

35S rDNA的ITS1-5.8 s - its2区使用通用引物ITS1和it4进行PCR扩增，步骤由beziic描述gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．用Weiss-Schneeweiss的引物和条件扩增了5S rDNA基因的整个编码和非转录间隔区(NTS)gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．通过1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行可视化和确认，从凝胶中提取，连接到pGEM-T Easy载体(Promega, Madison, Wisconsin, USA)，并克隆到有能力的JM109gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba细胞。使用质粒Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从携带插入物的单个质粒中分离DNA。纯化的质粒DNA被送到Macrogen (Seoul, Korea)对插入物进行测序。gydF4y2Ba

序列分析gydF4y2Ba

使用BioEdit ver对DNA序列进行组装和预对齐。7.0.5.3 [gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．然后它们在ClustalW中对齐[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]，并在MEGA5中实现[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba)，然后手动优化对齐。序列保存在GenBank (TablegydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．为了避免相同序列的多次提交，我们只发送每种类型的一个序列。根据新获得的ITS和NTS序列推断其系统发育关系gydF4y2BaA. ×角gydF4y2Ba和其他密切相关的gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba使用NCBI(国家生物技术信息中心)的BLASTN网络服务对非冗余核苷酸序列数据库进行相似性搜索。新扩增区域和其他相关序列的序列比对gydF4y2Ba葱属植物gydF4y2Ba保存在GenBank中的物种使用MEGA5 [gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．使用DnaSP Ver生成多态和可变位点以及不同的单倍型。gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．采用MrBayes 3.1进行贝叶斯分析[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba4个1,000,000代的链条，每100代采样一次，并且烧焦值设置为采样树的25%。采用赤池信息准则确定的最佳拟合替代模型[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba在jModelTest 0.1.1中实现[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba］．使用PAUP* 4.0b10 [gydF4y2Ba71gydF4y2Ba］．引导复制的数量设置为1000。系统发育树显示在FigTree v1.3.1中。gydF4y2Ba

染色体制备、荧光gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交(FISH)和基因组gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba杂交(吉什)gydF4y2Ba

按照Puizina的描述制备FISH和GISH染色体gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．克隆pTa794包含完整的5S rRNA BamHI片段410 bp，小麦间隔区[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba作为5S rDNA探针。2.4 kbgydF4y2Ba后gydF4y2Ba18S rRNA部分基因和ITS1片段gydF4y2BaCucurbita浆果gydF4y2Ba，克隆到pUC19 [gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]，作为18S rDNA探针。5S rDNA探针使用digg -nick翻译试剂盒(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)标记为地加氧蛋白，而18S rDNA使用BIO-nick翻译试剂盒标记为生物素(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)。根据供应商的说明，使用BIO-nick翻译试剂盒(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)用生物素标记基因组DNA (1 μg/反应)。gydF4y2Ba

FISH方法遵循Weiss-Schneeweiss中概述的程序gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba［gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．简单地说，重新固定和风干，染色体DNA在70% (v/v)去离子甲酰胺2× SSC中变性，pH 7.0, 70°C，通过乙醇系列脱水和风干。混合混合物包含标记的探针(100 - 150ng /载玻片)，20-100x过量的阻塞DNA (GISH)或鲑鱼精子DNA (FISH)， 50%甲酰胺，2倍SSC, 10%葡聚糖硫酸盐和0.15%十二烷基硫酸钠(SDS)，在75°C变性10分钟。将探针应用于载玻片，在37°C的潮湿室中孵育一夜。随后，载玻片在39℃2x SSC中洗涤5分钟，在39℃0.1x SSC中洗涤5分钟，在39℃2x SSC + 0.2%吐温20中洗涤5分钟。生物素和双氧合素标记的探针分别使用Extravidin-Cy3 (2.5 μg/mL)和抗双氧合素- fitc (5 μg/mL)检测，均在2% BSA 2x SSC + 0.2%吐温20缓冲液中，37℃洗涤60 min。随后，载玻片在2x SSC中洗涤两次，在42℃洗涤7 min，在2x SSC + 0.2%吐温20中洗涤7 min，在42℃洗涤7 min。最后，将它们安装在20 μL含0.5 μg/mL DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)的抗褪色溶液Vectashield中，并在4℃保存。使用蔡司Axioimager M1 epi荧光显微镜和高分辨率显微镜相机(Carl Zeiss AxioCam MR Rev3)，使用Axio Vision Rel. 4.7软件(Karl Zeiss，维也纳，奥地利)检查载片。对于rDNA定位，每个物种平均分析15-20个中期板。使用相同的协议进行GISH杂交和检测。gydF4y2Ba

我们真诚地感谢Todd Stuessy教授对稿件的批判性阅读和提出的有益建议。我们感谢遗传资源中心(CGN，荷兰)提供的样本gydF4y2Ba答:pskemensegydF4y2Ba而且gydF4y2Ba答:royleigydF4y2Ba用于本研究。这项工作得到了克罗地亚科学、教育和体育部通过给Jasna Puizina (no。177-11911196-0829)。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 斯普利特大学理学院生物系，克罗地亚斯普利特特斯利纳12号，21000gydF4y2Ba

   Željana fredotoviic, Ivica Šamanić， Juraj Kamenjarin & Jasna PuizinagydF4y2Ba

2. 维也纳大学系统与进化植物系，Rennweg 14，维也纳，A-1030，奥地利gydF4y2Ba

   Hanna Weiss-Schneeweiss & Tae-Soo JanggydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaJasna PuizinagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明没有竞争利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

实验设计由JP和HWS共同构思。实验由ZF、IS、JK和TY完成，数据由JP在HWS和IS的协助下进行分析。本文由JP、HWS和ZF共同撰写。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd.授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用授权协议(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，只要原始作品的名称正确。创作共用公共领域奉献放弃书(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba