沿玉米节间伸长细胞壁组成和转录谱的空间梯度

背景

伸长的玉米节间是禾本科植物营养细胞细胞壁发育的一个有用系统。伸长节间可分为四个发育带，即基部茎间分生组织，其上为伸长区、过渡区和成熟区。基部分生组织和伸长区的细胞主要含有初生细胞壁，而次生细胞壁沉积在过渡区加速，在成熟区占主导地位。

结果

主要壁组分纤维素、木质素和阿拉伯木聚糖(glucuronoarabinoxylan, GAX)在伸长区、过渡区和成熟区均增加，但在伸长区和过渡区之间GAX增加较多。微阵列分析显示，已知参与细胞壁合成或重组的关键糖基转移酶基因的转录丰度与纤维素、GAX和木质素的增加不匹配。相反，这些基因的转录水平在分生组织区和伸长区很低，在过渡区和成熟区下部迅速上升到最高水平，在成熟区上部普遍下降。转录谱显示这种模式的基因包括次生细胞壁中国极限运动协会GT43基因、一些β-扩张蛋白、udp -木糖合酶和udp -葡萄糖焦磷酸化酶、一些木葡聚糖内转糖基化酶/水解酶、参与单脂醇生物合成的基因、NAM和MYB转录因子基因。

结论

这些数据表明，参与细胞壁合成和修饰的基因的酶产物在玉米延长节间成熟区保持活性，尽管相应的转录产物水平在过渡区附近或附近达到峰值较早。

玉米秸秆，由玉米植株的残茎和残叶组成(玉米)，收获后仍留在田间，正成为第二代生物乙醇生产中越来越重要的木质纤维素生物质来源。成分分析表明，几乎完全由细胞壁残留物组成的干玉米秸秆含有高水平的纤维素、木质素和阿拉伯糖醛酸葡萄糖(GAX) [1]。然而，关于这些壁聚合物在成熟植物中的分布或它们在正常生长发育过程中的生物合成、重塑和降解的信息相对较少。同样，对玉米营养组织壁多糖合成的调控也知之甚少。

在这里，我们测量了沿着一个伸长的玉米节间细胞壁组成的变化，这代表了一个有用的模型系统，用于检查不同发育阶段的茎壁。因此，节间的基部区域包括茎间分生组织，茎间分生组织的上方是细胞扩张和初代细胞壁沉积的延伸区[2，3.]。节间进一步向上是过渡区，细胞伸长减慢，次级壁合成开始。节间的上部或末端是成熟区，细胞已停止生长，次生壁沉积占主导地位[2]。在离节间底部1厘米的切片上监测了这个发育系列中孤立壁的组成。与此同时，微阵列分析已被用于确定沿延长节间的基因转录谱，并使壁组成的变化与参与壁多糖、蛋白质和木质素合成的基因的转录活性相协调，以及已知调节负责壁合成和重新建模的基因表达的转录因子基因。

纤维素占玉米成熟茎秆总干物质的50%左右，由纤维素合成酶(CesA)家族的成员合成，在玉米基因组中至少有12个与之相关的基因[4]。纤维素是一种(1,4)-连接β-的线性多糖d -聚合程度从2000到14000不等的葡萄糖吡喃基残基，视来源而定[5，6]。纤维素链采用延伸的带状构象，允许单个分子排列成纤维聚集体，通过广泛的分子间氢键和范德华相互作用稳定，并表现出高拉伸强度。有不同的说法认为，每根微纤维由24或36个单独的纤维素分子组成[7，8]。

玉米秸秆的另一种主要细胞壁多糖是葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖(GAX) [1]。草壁的GAX组分通常由(1,4)-连接的β-主干组成d-木吡喃基残基，其中一些被单个α-取代lC(O)3和C(O)2的-阿拉伯烷呋喃基残基较少。骨架β-d- xylopyranoyl残基也可以在C(O)3位置上被α-取代d-葡萄糖醛基残基或其4- o -甲基醚，或短低聚糖链。羟基肉桂酸残基，特别是阿魏酰残基，可以附着在α-上l-阿拉伯呋喃基残基[6，9，10]。

细胞壁的组成和性质是动态的，因为它们在正常生长和发育过程中以及在非生物和生物胁迫下发生变化[11]。在年轻的、正在膨胀的细胞中，细胞壁相对较薄，并且高度水合。所谓的原代细胞是在这个发育阶段沉积的。新合成的纤维素微原纤维的取向是与细胞伸长轴横向的[12]，这限制了细胞的横向扩张，但允许肿胀驱动的细胞沿着延伸轴扩张。当细胞扩张减慢时，所谓的次生壁形成，但这种转变很可能是在一段时间内发生的，而不是突然发生的事件。在细胞发育的过渡和成熟阶段，细胞壁中的纤维素、非纤维素多糖和木质素浓度增加，非纤维素多糖的结构可以改变，以满足细胞壁功能需求的变化。这些过程对于植物细胞的各向异性生长，更具体地说，对于玉米节间的伸长是至关重要的。

据估计，大约有1200个编码多糖合成酶、糖基转移酶、糖基水解酶和一系列辅助和调节蛋白的基因参与植物细胞壁的生物合成、重塑和降解[13，14]。一些关于参与壁生物学的调控基因的信息也出现了[15]。在拟南芥中，次级壁相关NAC (NAM、ATAF1/2和CUC2)结构域蛋白1 (SND1)调控一系列靶转录因子，包括SND2、SND3、MYB20、MYB42、MYB43、MYB52、MYB54、MYB69、MYB85、MYB103和KNYT7(一种类似于结状同源结构域的蛋白)[16，17]。最近，相互作用的MYB75和KNAT7转录因子被证明可以调节拟南芥茎和种皮的次生细胞壁沉积[j]。18]。在杨树(杨树trichocarpa)，木材相关转录因子(PtrWNDs)是拟南芥SND1的功能同源物[19]。它们调节一系列下游转录因子并控制次生壁的生物合成。松树MYB1和MYB4转录因子和桉树MYB2通过结合木质素生物合成基因启动子的AC元件调节木质素的生物合成[j]。20.- - - - - -23]。

管壁合成和重塑的调节也在蛋白质水平上发挥作用，其中磷酸化是调节酶活性的重要机制。AtCesA1和AtCesA7纤维素合成酶的磷酸化已在拟南芥中报道[24，25]，其中AtCesA1的磷酸化影响了与微管的极性相互作用，AtCesA1是一种参与初级细胞壁纤维素合成的酶[25]，而AtCesA7(次级壁CesA)的磷酸化促进了该酶的降解。

在这项研究中，细胞壁多糖组成的变化沿着延长的玉米节间进行了比较，与细胞壁代谢相关的基因编码酶的mRNA水平进行了比较，并在节间的各个区域观察到许多强相关性。例如，一些转录因子和蛋白激酶基因的转录与玉米的转录密切相关CesA10，CesA11和CesA13基因与木质素代谢基因。

将玉米茎秆第10节间分成10段进行分析

当玉米茎秆第10节间长10厘米时，收割后切成10段，每段约1厘米。此时节间正在积极伸长，通常会在几天内伸长到约15厘米[26]。基切面S1含有间质分生组织细胞。S2和S3段伸长最为活跃，因此在这里被指定为伸长区。细胞伸长在S4和S5段持续存在，但伸长率下降，尤其是在S5段。我们已把S4和S5区指定为过渡区。S6 ~ S10段细胞伸长几乎或完全停止，木质素沉积明显。S6-S10段为成熟带。总体而言，玉米茎秆第10节间的发育和形态外观与Morrison先前描述的一致et al。［26), Kendeet al。［2]和Bosch等人。[27]。

结晶纤维素和木质素沿着延长的节间增加

用醋酸-硝酸分析法测定的结晶纤维素[28]在伸长节间S1切片中相对较低，约为细胞壁脱淀粉醇不溶性残留物(AIR)的20% (w/w)(图2)1)。此后，结晶纤维素浓度在S2段增加到25% w/w，在节间远段继续增加到约40% w/w(图2)1)。木质素浓度沿节间呈类似的模式，从分生带的约16% w/w稳步增加到成熟带的约32% w/w(图2)1)。因此，尽管从基部到节间顶部，木质素和结晶纤维素的重量大约增加了一倍，但在节间的特定区域，没有观察到结晶纤维素或木质素的急剧增加(图2)1)。然而，在S3和S4段之间的曲线明显变平，并且在S6段之后结晶纤维素的增长速度开始逐渐减小(图6)1)。

细胞壁多糖组成和精细结构沿节间发生实质性变化

玉米节间节段脱淀粉醇不溶性残基(AIR)的组成和连锁分析(附加文件)1:表S1)可以推导出主要壁多糖的比例[30.- - - - - -32]。在这些分析中估计的纤维素含量从基段的36% mol/mol到成熟带的41% mol/mol不等(图2)2)。因此，Updegraff方法估算的纤维素含量[28]，测量结晶纤维素(图2)1)和甲基化分析，估计总纤维素(图2)2)，表明纤维素结晶度从延伸区、过渡区到成熟区逐渐增加。

壁面中GAX含量的变化趋势与纤维素相似，但在延伸区和过渡区之间，GAX的增加幅度更大。在延伸区，检测到约34%的GAX，这一比例上升到约34%。在成熟带S8段占46%(图2)2)。这两种多糖占玉米伸长节间细胞壁的70% ~ 86%。其他壁多糖也被检测到，但一般都不到总多糖的10%。在每种情况下，这些在延伸区更丰富(图S2节)2)，并在成熟区下降到相对较低的水平(图S8部分)2)。例如，(1,3;1,4)-β-葡聚糖浓度从约约下降。从基部到节间顶部为12% ~ 4%(图2)。

壁制剂的其他次要成分，包括果胶阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳糖蛋白和半乳甘露聚糖，也从基部到节间顶部减少(图2)2)。总的来说，这些沿玉米节间的壁多糖的发育模式与大麦胚芽的发育模式非常相似，除了在年轻的大麦胚芽中检测到更高水平的果胶多糖。30.]。

整体基因转录模式在延长的节间变化显著

所有基因的微阵列数据主成分分析(PCA)揭示了样本基因转录谱的三个特性(图2)3.A).首先，样品重复聚为单组，表明样品制备具有可重复性，微阵列数据可靠，可用于进一步分析。其次，分生组织、伸长区和过渡区片段的转录模式存在差异。第三，成熟区的S6 ~ S10段转录本形成一个单簇(图2)3.一个)。

在玉米芯片上的17,200个功能注释基因中，约有5%(930个)编码基因与细胞壁多糖合成、木质素合成或导致细胞壁成分合成的代谢途径有关。当对这些基因进行PCA分析时，它们被分组成与整个基因集观察到的相似的簇，尽管S5簇与S6-S10簇合并(图6)3.B)。正如预期的那样，数据揭示了分生组织区、延伸区和过渡区与壁合成、重塑和降解相关的基因转录模式的空间差异，但过渡区和成熟区之间的差异不太明显(图2)3.B)。

通过比较，进一步证明了沿节间参与细胞壁生物学的基因的转录模式非常不同。与第S1部分(表第2列)相比，任何部分转录的细胞壁基因中约有40%的转录丰度发生了两倍或更多的变化1)。这种模式的例外是在section S1和S2之间，其中相对较少的“细胞壁”基因的转录水平发生了变化(表2)1)。相邻节间切片的序列比较表明，细胞壁基因的差异转录由节间下部向上部区域递减(表2)1)。

CesA基因的转录谱沿节间表现出不同的模式

玉米基因组至少包含12个中国极限运动协会基因，其中一些被认为参与初级细胞壁沉积过程中的纤维素合成(第1组)，而另一些则参与次级细胞壁沉积过程中的纤维素合成(第2组)[4]。成绩单水平具有代表性ZmCesA与次生细胞壁2组基因相比，初代细胞壁1组基因的表达普遍偏低(图2)4A参考图4B)，从底部到节间顶部变化不大(图2)4A).然而，ZmCesA7基因的检测水平与其他细胞壁相似中国极限运动协会在分生组织和低伸长区部分，但在过渡区增加到相对较高的水平，并在整个成熟区保持较高水平(图2)4一个)。

的中国极限运动协会2组基因的转录模式差异较大。在每种情况下，转录本丰度都从S1段的低水平上升到过渡区S3和S4段的高水平，然后在成熟区S6-S10段稳步下降(图6)4B)。这些数据与S5和S6段后晶体水平的明显变平一致(图6)1)。总的来说，ZmCesA11(图4B)和ZmCesA12(未显示)转录本很低。这些记录的档案ZmCesA通过实时荧光定量PCR (QPCR)对基因进行检测，结果与微阵列数据吻合良好(另附文件)1:图S1)。

纤维素合酶样基因的转录谱也显示出可变的模式

纤维素类合酶(Csl)基因在微阵列上的表现不足，但转录水平很少ZmCsl图中比较了被注释和高度转录的基因5。其中，ZmCslE3mRNA在玉米节间最丰富，接近或超过了记录的最丰富水平中国极限运动协会成绩单(图5)。与大多数的中国极限运动协会转录本，水平ZmCslE3转录本在S5和S10节之间没有明显减少(图5)5)。的功能CslE这组基因还没有被定义。的转录模式ZmCslA1在分生切片S1中转录量高，在延伸区迅速减少，随后在切片S3至S10的过渡区和成熟区再次增加(图10)5)。至少一些成员里昂证券基因亚家族被认为编码甘露聚糖合成酶[33，34]。另一个ZmCslA基因存在于微阵列上，但其转录水平低于40- 200倍ZmCslA1(附加文件1:图S2)。的转录模式ZmCslA3基因与观察到的特征模式非常相似ZmCslA1基因(附加文件)1:图S2)。

两个ZmCslF基因被表示在微阵列上。它们的转录物水平普遍较低，但在S3和S4节中相对较高(图2)5和附加文件1:图S2)。玉米基因组被认为至少还有另外5个基因该论坛和几个CslH基因，但这些在微阵列上没有显示。两个ZmCslD基因在微阵列上表现出来，但它们的转录水平极低(数据未显示)。

与细胞壁合成有关的糖基转移酶基因沿节间有差异转录

除了上述章节中描述的GT2基因外，其他几个糖基转移酶(GT)基因家族也与细胞壁多糖的生物合成有关。特别是GT8、GT43、GT47及GT61的成员(http://www.cazy.org/) [35]一些基因家族被认为与高等植物中GAX的合成有关[36- - - - - -41]。因此，在沿玉米第10节间的10个区段中，对这些基因家族的成员进行了微阵列监测。其中，两个GT43基因的转录水平最高(图2)6A)，转录本丰度通常在包含延伸区和过渡区的S4至S6区段达到峰值，但在某些情况下，转录本在较低的区段较高(图2)6A)。GT8、GT47和GT61基因的转录本水平在节间的所有切片中都相对较低(图2)6B)。

参与细胞壁扩展和重塑的基因在节间的所有区域都大量转录

利用微阵列技术对扩增蛋白家族成员的转录进行了监测。扩张蛋白参与生长素诱导的细胞伸长[42，43]，也在玉米的各向异性向地性响应中起重要作用[44]。微阵列上有几个β-扩张蛋白和一个α-扩张蛋白基因，其转录水平如图所示7A.转录本在伸长区非常高，这与它们在细胞伸长过程中作为壁松动剂的功能一致。在这些情况下，转录水平在章节S3和S4达到峰值(图2)7一个)。

木葡聚糖内转糖基酶/水解酶(XET)被认为在生长素诱导的细胞伸长中起作用[42，45]。它们的功能包括对现有多糖结构的修饰，特别是木葡聚糖，以及可能的不同多糖的共价交联，如木葡聚糖、纤维素和(1,3;1,4)-β-d葡聚糖(46- - - - - -48]。在微阵列上发现了几个推测的XET基因。来自不同XET基因的mRNA的相对丰度差异很大，它们的转录模式也有很大差异(图2)7B)。在某些情况下，S1切片分生组织中的转录水平相对较高，而在其他情况下，从节间基部到远端特异性XET基因转录水平仍然很高(图2)7B)。

关键的糖核苷酸相互转换基因转录在过渡区达到峰值

玉米秸秆主要细胞壁多糖的生物合成需要糖核苷酸，如UDP-Glc、UDP-GlcA、UDP-Xyl和UDP-Ara，因此在玉米节间切片中检测了相互转化途径中重要基因的转录水平。UDP-Glc焦磷酸化酶(UGPP)通过葡萄糖1-磷酸和UTP形成UDP-Glc来控制碳进入糖核苷酸库。其中一种玉米的转录水平UGPP基因(Q6Y643)在S1切片分生组织中含量非常高，在延伸区和过渡区S2-S4切片中含量显著增加(图2)8)。糖核苷酸相互转化途径中的另一个重要基因是UDP-Xyl合成酶(UXS)，它催化UDP-GlcA的不可逆脱羧形成UDP-Xyl。因此，UXS酶将碳转化为戊糖，这是玉米GAX多糖的主要成分。的转录水平之一用户体验基因(Q6J683)的表达量比基因(Q6J683)低约5倍UGPP基因，但在节间处显示出相似的模式。UXS基因转录本在过渡区S3和S4段也达到峰值(图2)8)。

检测到多糖内水解酶基因的高转录水平

有大量的证据表明，纤维素的合成需要水解酶(1,4)-β-葡聚糖酶或纤维素酶的参与et al。［49表明这类酶影响水稻节间伸长。同样，(1,3;1,4)-β-葡聚糖内水解酶不仅与(1,3;1,4)-β-葡聚糖解聚有关，还与(1,3;1,4)-β-葡聚糖合成有关[50]。相应的多糖内水解酶基因以及(1,3)-β-葡聚糖酶基因的转录本水平因此沿着玉米节间进行监测(图2)9)。一个纤维素酶基因的转录本在节间的任何区域都不是特别高，但某些(1,3)-β-葡聚糖酶基因在伸长区和过渡区转录活跃，其中一个基因的转录本也在成熟区被检测到(图2)9A).两个(1,3;1,4)-β-葡聚糖酶基因的转录本沿节间呈现出截然不同的模式。在一个案例中(基因Q9ZT66)，转录本在S1切片的分生组织中最高，但在伸长、过渡和成熟阶段稳步下降(图2)9B)。这种模式与节间壁中(1,3;1,4)-β-葡聚糖水平从节间下部到节间顶部的减少是一致的(图2)2)。然而，第二个(1,3;1,4)-β-葡聚糖酶基因(Q7DLM1)的转录本在Section S1中未检测到，但在过渡区Section S3和S4中丰度增加，达到峰值(图4)9B)。

木质素途径基因转录量在过渡区和低成熟区较高

芯片上的120多个探针代表了参与木质素代谢的基因。其中许多木质素代谢基因的转录本水平在分生切片S1和早期过渡区片段中较低，但很快上升到相对较高的水平，在过渡区片段S3和S4达到峰值。此后，转录物水平普遍下降到成熟区顶部Section S10的较低水平(图2)10)。这些基因包括苯丙氨酸解氨酶(PAL, Q7X720)、4-香豆酸-辅酶a连接酶(4CL, Q6Q297)、2个咖啡酰基辅酶a 3- o甲基转移酶基因(CCoA-OMT, Q7XYW7和Q6VWH0)、肉桂醇脱氢酶(CAD, Q24562)、过氧化物酶(PO, Q653X4)和2个肉桂酰基辅酶a还原酶基因(CCR, Q84JD0和Q84J56)(图2)10)。PAL基因(Q7X720)的mRNA在节间处丰度最高，在过渡区丰度也最高(图2)10)。

其他一些木质素相关基因沿节间段转录增加，并在成熟区保持高水平(附加文件)1:图S3)。其中包括2个CCR基因(Q84JG9, Q24563)， 3个过氧化物酶基因(Q43416, Q5I3F1, Q9ZTF7)和阿魏酸5-羟化酶(F5H, Q109F2)。其中一个木质素代谢基因Q8W2X2在片段S1和S2中有较高的转录水平(附加文件)1(图S3)，但在过渡区和成熟区转录物水平较低。

检测转录因子基因转录物

nac结构域基因编码植物特异性转录因子，并调控包括器官分化、发育、植物病害和抗逆性在内的广泛活动。一些nac结构域转录因子在拟南芥和杨树次生细胞壁生物合成的启动中起着非常重要的作用[j]。16，17，19，51]。玉米节间微阵列包含30多个nac结构域探针，其中大部分在伸长节间的转录水平很低。然而，三个NAM基因(Q5NKQ3、Q5QMP4和Q5NKS7)在延伸区和过渡区表现出转录升高(图2)11另外两个nac结构域基因(Q4QWQ6和Q6Z1G9)具有不同的转录模式，在茎间分生组织中转录水平较低，在伸长区转录水平升高，并在成熟区达到平台水平(图2)11一个)。

MYB转录因子在基因转录调控中具有多种功能，其中少数MYB转录因子被认为是nac结构域转录因子的靶标[52- - - - - -54]。在微阵列上发现了100多个推测的MYB转录因子注释。其中11个在伸长节间有非常高的转录物水平(图2)114个MYB基因(Q2A702、A2X8K7、Q8S415和Q4L214)的mRNA水平在S1区较低，在S2区升高，在S3区或S4区达到峰值，在S5区下降，在S6至S10区保持较低水平(图6)11)。MYB基因(Q7XC51)的转录活性在S1段也较低，在S2段升高，在S4段达到峰值，在S5和S6段下降，在S7段再次达到峰值。该MYB基因的转录水平在所有MYB基因中最为丰富(图2)11B)。

当测定V16期玉米植株第10节间伸长的10段细胞壁组成时，可以明显看出，晶体纤维素的含量从节间下部分生组织区域的约20%增加到成熟区上部S9段的40%以上，尽管在S6段之后增加的速度有所下降(图6)1)。基于甲基化的连锁分析估计纤维素含量为(1,4)-葡萄糖基残基[31，32]的值普遍高于结晶纤维素的值(比较图2)1和图2)，包括结晶和非结晶纤维素(参见[13])，但在节间较低、较年轻的区域，结晶纤维素的比例减少。因此，在Section S2中测量了大约70%的结晶纤维素，在Section S8中测量了95%。木质素在节间也表现出类似的稳定增长速度，从成熟带下部约15%的重量增加到上部约30%的重量增加。在这两种情况下，当节间细胞从分生组织发育到延伸区、过渡区和成熟区时，纤维素或木质素的浓度都没有突然变化。绝对的，斯考比et al。［3.]表明成熟区细胞壁总浓度高于节间下部。

从10个节间切片制备的细胞壁中，主要的非纤维素多糖是GAX，这是根据先前发表的这些多糖结构的链接分析估计出来的[31]。分离壁中GAX的含量在延伸区S1段约为32%，但在过渡区和成熟区急剧增加至约45-50%(图1)2)。细胞壁的一个重要特征是植物可以调节组成多糖的理化性质，从而调节其在细胞壁中的作用。例如，在GAX的情况下，(1,4)-β-木聚糖主链的取代度可以改变。较低的取代度将使链与其他GAX分子的(1,4)-β-木聚糖主链或与纤维素形成分子间氢键[10]。在这里，木聚糖主链被阿拉伯糖基残基取代的程度沿着节间明显下降，但在延伸区和过渡区之间尤其明显。GAX中Xyl:Ara的平均比值，取自三个生物重复，S2切片为1.6:1,S4切片为6.6:1,S6切片为8.2:1,S8切片为7.5:1(数据未显示)。从这些值可以预测，GAX的溶解度将沿节间急剧下降，而通过分子定位和分子间氢键与其他多糖相互作用的能力将大大增加，特别是在延伸区和过渡区之间。从切片中糖醛酸的整体比色分析可以估计，在延伸区S2切片中，GAX的木聚糖主链被GlcA残基取代的程度约为30%，但在过渡区和成熟区S4、S6和S8切片中，这一程度降至约10%(数据未显示)。节间总尿酸含量为重量的3.5%至5%，与大麦皮报道的4%相当[10]。这些醛酸含量被推断为主要是GlcA，因此作为末端残基存在于gax上，因为羧基还原/甲基化分析(数据未显示)显示末端或4-GalA残基的水平可以忽略不计，这表明只有低水平的果胶半乳糖醛酸/RG1存在，与糖分析中Rha残基的缺失一致。

细胞壁的少量多糖包括木葡聚糖、(1,3;1,4)-β-葡聚糖、半乳甘露聚糖、阿拉伯半乳甘露聚糖和II型阿拉伯半乳甘露聚糖。沿节间伸长方向变化相似;在每一种情况下，它们的水平都从节间的下部向上部稳步下降，同样，在伸长区、过渡区和成熟区所代表的不同发育阶段之间也没有任何突变(图2)2)。

随后，我们尝试将上述细胞壁组成的变化与基因表达的变化相协调，通过在延长节间的十个部分中测量转录物丰度。在进行这些比较时，重要的是要注意转录丰度不一定与编码酶的水平直接相关，同样，也不一定与合酶的多糖产物的水平成正比。然而，在转录物水平和细胞壁组成之间观察到许多一致的趋势。微阵列技术应用于这个问题，当分析总基因转录本和与细胞壁代谢相关的基因转录本水平时，很容易识别的转录本谱在节间切片之间的差异变得明显。主成分分析(PCA)突出了这些差异(图2)3.A参考图3.B)，我们认为，为了更全面地了解不同发育阶段基因转录的变化，有必要将伸长的玉米节间进行分段。这种方法可能与博世的方法形成对比et al。［27他们在微阵列实验中比较了伸长和不伸长的整个玉米节间。

纤维素的生物合成至少由两组CesA酶催化。一组被认为负责初级壁的纤维素合成，另一组负责次级壁的纤维素合成[55]。在玉米基因组中有12个中国极限运动协会基因已被鉴定[4]。成绩单的CesA10，CesA11和CesA12维管束中含有丰富的基因，这些基因与次生壁纤维素的合成有关。4]。玉米基因组DNA序列揭示了另一次生壁中国极限运动协会基因，有相似的序列CesA12基因被指定为CesA13。

转录水平ZmCesA沿着延长的第10节间确定基因家族，特别注意转录水平ZmCesA先前与初级或次级细胞壁中纤维素合成有关的基因[4]。有人可能会期望转录本为主壁中国极限运动协会基因在节间的分生组织区和伸长区最高，随后在过渡区和成熟区减少，但没有观察到这一点。的ZmCesA这些基因代表了那些被认为参与初级壁纤维素生物合成的基因，大多数沿着节间的转录水平相对较低(图2)4A)，这里有一个明显的例外ZmCesA7在节间的过渡区和成熟区检测到相对较高的转录水平(图2)4A).在这个阶段，我们无法解释的成绩单模式ZmCesA7基因。

次级细胞壁的转录物水平ZmCesA基因在分生组织和伸长区相对较低，如预期的那样，但在上伸长区和过渡区迅速增加，在过渡区表现出相当明显的峰值，随后稳步下降(图2)4B).同样，编码参与单木质素生物合成和木质素生物合成其他步骤的酶的基因的转录水平[56]在节间下部较低，如预期的那样，但在过渡区增加到一个显著的峰值，然后在成熟区稳步下降(图2)10)。纤维素合成酶和木质素合成基因的这些特征性转录模式必须与纤维素和木质素从节间较低伸长区到较高成熟区稳定增长相协调(图2)1)。一种解释是，CesA酶和那些参与木质素合成的酶相对稳定，一旦合成，可以在成熟区持续几天产生纤维素和木质素。另一种可能性是木质素单体池被生成，它们聚合成木质素的过程持续数天。在纤维素的情况下，结晶形式的形成可能落后于新生纤维素链的合成，尽管次级壁的减少中国极限运动协会成熟区mRNA水平(图2)10)与S5和S6段后较慢的纤维素增加速率相匹配(图6)1)。无论解释如何，很明显，在节间的不同区域观察到的转录物水平的波峰和波谷是“平坦的”，以允许晶体纤维素和木质素从底部到顶部的稳定增加(图1)1)。

据信介导GAX合成的基因转录本的发育模式有些难以解释，主要是因为我们目前对杂氧胺合成的理解是不完整的。尽管如此，许多基因已被证明与此有关。糖基转移酶的GT43和GT47家族成员被认为参与了木聚糖主链的延伸[36，38，41，57，58]， GT8酶已被证明参与了木聚糖链的葡萄糖醛基取代[39，59，60]和GT61酶可能是阿拉伯糖基或木糖基转移酶[61，62]。这些基因群中转录量最多的是编码GT43酶的基因，它们具有发育模式(图2)6A)与次级细胞壁纤维素合酶非常相似(图2)4B).在这两种情况下，转录本在过渡区和较低成熟区达到峰值。这些观察结果与GT43酶介导(1,4)-β-木聚糖链延伸的观点一致。然而，据信参与木聚糖主链取代的酶，即GT8和GT61酶的基因转录本水平在整个节间长度上仍然很低(图2)6B)。

UXS基因编码一种酶，该酶对重要的GAX糖供体底物(即UDP-Xyl和UDP-Ara)的合成起核心作用，其转录水平与GT43基因和次级壁的模式相似中国极限运动协会基因(图8)，而更普遍地将碳转化为糖核苷酸合成的UGPP基因，在节间的转录水平很高，但在过渡区也有一个峰值(图2)8)。

在与少量非纤维素壁多糖的生物合成有关的基因中，CslE3基因转录本最为丰富;CslE酶的功能尚未明确。惊人的高水平CslA1在S1切片的分生组织中检测到转录本，但这些转录本在伸长区迅速下降，然后在成熟过程中再次上升(图2)5)。如前所述，里昂证券基因被认为参与甘露聚糖和葡甘露聚糖的合成[33，34]，但延伸区壁面中甘露聚糖含量仅为3% (w/w)左右，此后这一比例降至并保持在非常低的水平(图1)2以及我们未发表的数据)。其他地方也观察到甘露聚糖水平和里昂证券在大麦胚乳发育的早期阶段，转录本相对较高[63]和大麦胚芽[30.]，但数据表明，甘露聚糖可能在非常年轻的组织壁沉积的早期阶段更为重要。

在各向异性细胞生长的伸长阶段，许多酶和蛋白质，包括扩张蛋白和木葡聚糖内转糖基化酶(XETs)，被认为介导了细胞壁松动过程，这被认为是细胞扩张所必需的。42]。编码这两类蛋白的基因转录本在玉米节间处被高水平检测到(图2)7)。许多扩增蛋白基因转录在次生壁形成之前中国极限运动协会和木质素相关基因(图27A参考图4A和图10)，在延伸区有峰值水平。这与节间区细胞的扩张是一致的。相比之下，XET转录物的发育模式是高度可变的，不能轻易地与节间发育阶段或细胞壁组成的变化联系起来(图2)7B).植物中的XET基因家族通常很大[64]并且这些酶不仅与木葡聚糖修饰有关，而且还与纤维素和各种非纤维素壁多糖的修饰或共价交联有关[46- - - - - -48，65]。参与一系列壁多糖的重新建模将与在伸长的玉米节间观察到的高度可变的转录谱一致(图2)7B)。

其他与细胞壁重塑有关的基因，也与细胞的周转和降解有关，包括多糖水解酶。例如，观察到β-葡聚糖外水解酶的高水平转录本，在过渡区达到最高水平(图2)9A). β-葡聚糖外水解酶是一种非特异性外作用酶，能够水解多种低聚葡萄糖苷，并且可能需要将各种β-葡聚糖完全降解为其组成糖[49]。相反，(1,3;1,4)-β-葡聚糖酶基因中的一个从节间下部向上部成熟区稳步下降(图2)9B)。这与沿节间壁(1,3;1,4)-β-葡聚糖浓度的降低是平行的(图2)2)。然而，另一个(1,3;1,4)-β-葡聚糖酶基因在过渡区和下成熟区转录(图2)9B)，当(1,3;1,4)-β-葡聚糖水平确实很低时。编码(1,3)-β-葡聚糖酶的几个基因的转录本也被检测到(图2)9A)，但这些酶是由一个非常大的基因家族编码的，并在植物中发挥广泛的功能[66]，与玉米节间伸长的发育模式范围一致(图2)9一个)。

值得注意的是，本文观察到的5个β-扩张蛋白基因和其中一个XET基因(Q5JZX2)也在玉米叶片重力诱导的细胞伸长中发挥作用[44]。这些基因的转录水平在较低的pulvini中显著增加，那里的细胞伸长是由重力胁迫诱导的[44]。(1,3;1,4)-β-葡聚糖酶和β-1,3-葡聚糖酶基因也参与了重力诱导下玉米下部细胞伸长的过程[44]。因此，在本研究中通过在伸长的玉米节间正常生长和发育中高转录水平鉴定的基因似乎也在对重力胁迫的响应中转录。

鉴于上述许多基因的转录模式相似，我们进行了全球相关性分析，发现基因转录物与次生细胞壁高度相关ZmCesA基因列于表中2。这些基因中的大多数Pearson协效率值接近或大于0.9，包括参与非纤维素壁多糖合成、重塑和解聚合的基因，以及介导木质素合成的基因。与几个转录因子基因和蛋白激酶基因也有相关性(表2)2)。在转录因子基因中，特别有趣的是NAM (Q5QMP4)基因和MYB (Q2A702)基因，因为这些基因显示的发育模式与许多非洲人的发育模式相似中国极限运动协会、木质素和糖基转移酶基因(图210A和图10B).一些来自拟南芥的MYB和NAM转录因子已被证明可以控制次生壁的生物合成[17，52]以及NAM和次级壁的协调转录ZmCesA在受重力胁迫的玉米中也观察到基因[44]。

在二次壁之间也观察到高度相关ZmCesA基因转录物和各种蛋白激酶(表2)。虽然这些激酶在纤维素合成调控中的作用尚未得到进一步研究，但从其他研究来看，CesA酶的磷酸化或去磷酸化可能会影响其活性。例如，次级壁CesA复合物亚基拟南芥AtCesA7蛋白的磷酸化可使该蛋白降解，而参与初级壁纤维素合成的拟南芥AtCesA1酶磷酸化位点的突变会影响CesA复合物与微管之间的极性相互作用[24，25]。在伸长的玉米节间，两种蛋白激酶(Q653F8和Q75V63)的转录与次级壁的转录高度相关中国极限运动协会基因(表2)。

通过对玉米植株第10节间1 cm剖面的细胞壁组成和转录本谱的分析，揭示了一些意想不到的发育模式。首先，纤维素、GAX和木质素3种主要细胞壁成分相对稳定地增加，在伸长节间的伸长区、过渡区和成熟区之间没有突变。其次，已知参与这些主要壁组分合成或重组的基因的转录谱与上述纤维素、GAX和木质素的稳定增长不匹配。相反，这些基因的转录水平在分生组织区和伸长区很低，在过渡区和成熟区下部迅速增加到最高水平，在节间顶部的成熟区上部普遍下降。转录谱显示这种模式的基因包括次生细胞壁中国极限运动协会基因，GT43基因，部分β-扩张蛋白，UXS和UGPP，纤维素酶，导致单脂醇合成的代谢途径中的大部分基因，以及NAM和MYB转录因子基因。事实上，这些基因中的许多基因的转录沿着成熟区下降，而纤维素、GAX和木质素的水平继续增加，这表明这些基因的酶产物在成熟区保持活性，尽管相应的转录水平下降了。此外，这些分析使我们能够识别可能参与细胞壁合成调节的转录因子和蛋白激酶，其中一些基因的功能目前正在研究中。

植物材料

玉米植株(O9B)在自然光条件下，在17/27°C的温室中生长。玉米V16发育时期的伸长节间(长约10厘米)[67收获]株，切成10段，立即在液氮中冷冻，制备细胞壁多糖和mRNA。

细胞壁制备和分析

细胞壁多糖的测定方法如前所述[44]。玉米秸秆切片在液氮下研磨，80% v/v乙醇全浸，残渣(AIR)用胰α-淀粉酶彻底脱淀粉[31]。乙醇不溶性残留物(脱淀粉AIR)用甲醇和丙酮进行溶剂交换干燥，并与干燥的硅胶一起储存在真空干燥器中。采用Updegraff醋酸/硝酸法测定结晶纤维素[28]，并按照Pettolino所述进行修改et al。［31]。该程序的精确度约为3%。用哈特菲尔德描述的乙酰溴法比色法测定木质素et al。［29]，并作以下修改。约2mg细胞壁材料(一式两份)在70℃下用0.5 mL 25%乙酰溴在醋酸中(v/v)水解2.75 h，然后加入4.4 mL 10ml 2m NaOH与12ml乙酸的预混溶液，重量为10ml。在280 nm处测量吸光度，并根据消光系数20计算木质素^gL-1cm-1。

按照Ciucanu和Kerek的描述，在氢氧化钠和DMSO中用碘化甲酯甲基化进行双份单糖连锁分析[68]然后是水解、还原和乙酰化，数据计算为总空气的摩尔百分比，如前所述[31，32]。单糖键(摩尔%)和相对多糖比例由部分甲基化的糖醇乙酸酯推断出来，这些糖醇乙酸酯经GC-MS分离和分析，如前所述[31，32]。使用这些方法和已知的壁组分结构，可以将单个部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物或其部分分配给不同的壁多糖。例如，4链葡萄糖基残基可以被分配到木葡聚糖、纤维素和/或(1,3;1,4)-β-葡聚糖上，而半乳糖残基可能被分配到果胶、阿拉伯半乳糖蛋白、木葡聚糖等上。在Pettolino中提供了用于这些计算的公式的完整描述et al。［31]。

根据Filisetti-Cozzi和Carpita [69做了一些修改。简单地说,d以-葡萄糖醛酸为标品(1 mg/mL)。在4℃条件下，在10 mL管中加入0.4 mL水，在浓H中加入80 μL 4 M氨基磺酸-氨基磺酸钾(pH 1.6)和2.4 mL 75 mM四硼酸钠，制备样品管₂所以₄是补充道。在另一根试管中称取约2mg样品，用200 μL 75 mM的四硼酸钠在浓H中水解₂所以₄。将20 μL水解后的样品加入到含有氨基磺酸-氨基磺酸钾和四硼酸钠的样品管中。所有试管在离心机中脉冲，并在水浴中加热到90°C 20分钟，同时确保水位不超过试管内的水位超过1厘米。管在冰上冷却，在525 nm处测量吸光度。然后在0.5%氢氧化钠中加入80 μL 0.15% m-羟基联苯。将试管混合，静置10分钟使颜色显现，然后在525 nm处测量吸光度。

微阵列转录物分析

如前所述进行微阵列分析[44]。玉米节间切片在液氮下研磨，根据制造商的说明，用TRIZOL试剂(Invitrogen, Sydney)提取总RNA。使用Illustra mRNA纯化试剂盒(GE Biosciences)纯化多腺苷化mRNA。使用安捷伦生物分析仪评估样品质量和RNA浓度。使用Agilent Low RNA Linear Amp试剂盒，将mRNA反转录成双链cDNA，用Cy3或Cy5荧光染料标记。用Cy3或Cy5交替标记生物重复，以防止染料偏倚。将cDNA与Agilent 4 × 44 k玉米基因芯片杂交[70并根据安捷伦标准方案对微阵列进行清洗。用Agilent G2505B DNA微阵列扫描仪在两种激光功率设置(100%和10%)下扫描微阵列芯片。使用Agilent feature Extraction Software (v 9.5.1)提取、过滤和归一化特征强度。采用分位数归一化(BOLSTAD)对数据进行归一化http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12538238)。规范化数据用于比较细胞壁组成相关基因的表达水平。

玉米细胞壁基因的定量RT-PCR分析

采用实时荧光定量PCR (real - time PCR, Q-PCR)对玉米细胞壁基因进行转录分析et al。［71]。用于微阵列分析的同一批RNA用于cDNA的合成。用于Q-PCR的引物序列列在附加文件中1表S2。

这项工作得到了澳大利亚研究委员会的资助。我们感谢切丽·沃尔什、娜塔莉·基布尔和杰西卡·史密斯提供的专业技术援助。

从属关系

1. 澳大利亚研究委员会植物细胞壁卓越中心，阿德莱德大学农业、食品和葡萄酒学院，阿德莱德，南澳大利亚，5064

   张其森、尼尔·J·雪莉、吉莉安·泰勒、瑞秋·A·伯顿和杰弗里·B·芬奇

2. 澳大利亚研究理事会植物细胞壁卓越中心，墨尔本大学植物学院，维多利亚帕克维尔3010，澳大利亚

   Roshan Cheetamun和Antony Bacic

3. 先锋杂交国际公司作物遗传研究与开发遗传发现小组，7300 NW 62 Avenue, Johnston, IA, 50131-1004, USA

   Kanwarpal S dugga, Kevin Hayes和Mary Beatty

4. 杜邦作物遗传研究，遗传发现组，杜邦实验站，E353楼，威尔明顿，DE, 198803，美国

   J Antoni Rafalski & Scott V Tingey

相应的作者

对应到杰弗里·B·芬奇。

相互竞争的利益

我们不能确定与本手稿中描述的工作相关的任何财务或非财务利益。

作者的贡献

QZ:完成了大部分的实验工作，包括实验设计和数据分析和解释。RC:执行联动分析。KSD:对工作的构思和设计、实验设计和数据分析有重大贡献。JAR:对数据的分析和解释做出了重大贡献。SVT:对作品的构思有实质性的贡献，并最终批准出版。NJS:完成成绩单概况和数据分析。JT:完成了大部分的实验工作和数据分析。KH:进行微阵列数据分析。MB:进行微阵列分析。AB:分析联动数据。 RAB: Substantial contribution to the experimental design and analysis of the data. GBF: Substantial contribution to the conception and design of the work, experimental design and analysis of the data. All authors read and approved the final manuscript.

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