下调的acetolactate合酶妥协Ol-1-介导的番茄白粉病抗性

背景

在一项cDNA-AFLP分析中，比较白粉病(粉孢子neolycopersici本研究以番茄品种为研究对象，探讨了番茄抗病基因的遗传机制Ol-1或Ol-4，在NIL-中发现一个转录衍生片段(TDF) M11E69-195Ol-1但在MM和NIL-中不存在Ol-4．该TDF与acetolactate合酶（肌萎缩性侧索硬化症)．ALS是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸生物合成的关键酶，也是商业除草剂的靶标。

结果

三个肌萎缩性侧索硬化症同源染色体ALS1，ALS2，ALS3在番茄基因组序列中进行了鉴定。ALS1和ALS2表现出高度的相似性，然而ALS3更发散。短暂的沉默ALS1和ALS2NIL -Ol-1通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)，导致叶区褪绿，表现出增加的易感性o . neolycopersici（在)．VIGS结果被稳定的转化为NIL-Ol-1使用针对两者的RNAi构造ALS1和ALS2．相反，三个人的沉默肌萎缩性侧索硬化症RNAi构建的单个基因对NIL-的抗性没有影响Ol-1．除草剂氯嘧磺隆在无锈病中的应用Ol-1模拟VIGS表型，导致其抗性丧失在．易感毫米,在多重线NIL -Ol-4携带核苷酸结合位点和富亮氨酸重复序列(NB-LRR)抗性基因的氯磺隆也进行了处理。对MM的敏感性和对NIL的抗性均无影响Ol-4是影响。

结论

ALS既不参与基础防御，也不参与NB-LRR型抗性基因产生的抗性。相反，它是专门涉及Ol-1 -表明als诱导的氨基酸稳态变化对番茄白粉病抗性具有重要意义Ol-1．

在自然环境中，植物经常受到各种病原体的攻击。然而，植物可以通过构成性和诱导性免疫反应检测和逃避大多数感染企图。诱导反应包括两层[1]．第一层由多种病原体相关分子模式(PAMPs)触发。植物模式识别受体(PRRs)对PAMPs的感知刺激了许多细胞事件，包括活性氧的产生、丝裂原激活激酶的激活、防御基因的增强表达和抗菌化合物的产生[2，3.]．第二层诱导反应由可变的病原体特异性效应物激活。植物对效应子的识别主要是由一类含有核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域的抗性蛋白介导的。这两种诱导反应的调节和执行都涉及激素信号通路[4]．

新的证据表明，防御途径不仅受经典激素的调控，氨基酸代谢途径也是植物免疫系统的重要组成部分[5]．此外，一些氨基酸可作为抗菌化合物(例如硫代葡萄糖苷)的前体[6，氨基酸稳态是植物-微生物相互作用结果的关键。大豆抗线虫显性基因编码丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)，该酶在一碳叶酸代谢中起关键作用[7]．与敏感基因型相比，抗性基因型中的SHMT等位基因编码酶的一种亚型，其动力学特性有所改变。这种改变的SHMT酶可能与叶酸途径的干扰有关，从而导致线虫营养缺乏。辣椒的过度表达天冬酰胺合成酶在拟南芥中增强了对细菌和卵菌病原体的抗性，这与增加的天冬酰胺水平相关[8]．拟南芥隐性霜霉抗性(dmr1中有缺陷的突变体高丝氨酸激酶被发现对卵菌有抗性Hyaloperonospora arabidopsidis（下丘脑-垂体-肾上腺轴的)．抗性是高丝氨酸诱导的，并且独立于已知的信号通路[9]．正交曲线的抑制SlDMR1番茄对白粉病的抗性提高粉孢子neolycopersici［10］．抵抗下丘脑-垂体-肾上腺轴的也是在拟南芥中获得的rar1 -抑制器(负责)突变体，其中苏氨酸(Thr)水平高度升高[11]．的rsp1突变体携带突变体天冬氨酸kinase2基因(11，它催化天冬氨酸衍生氨基酸途径的第一步。的rsp2突变体含有功能缺失的等位基因dihydrodipicolinate synthase2［11是赖氨酸生物合成的关键酶。氨基酸转运体的破坏LHT1使拟南芥具有广谱的抗病能力，可能是由于缺乏谷氨酰胺[12]．

粉孢子neolycopersici（在)是一种重要的温室作物生物营养性真菌病害。与大多数针对宿主的白粉病不同，在可以感染多种宿主，包括茄科和葫芦科家庭(13]．从野生物种中寻找抗性等位基因，并将这些等位基因渗入栽培物种中，培育抗病品种，是防治该病的有效策略。在番茄中有九个具有抗性的基因座在已被确认[14，15]．其中之一是——Ol-1 -源于茄属植物habrochaitesG1.1560 [16]，并产生与慢超敏反应(HR)相关的不完全耐药性[17]．它位于6号染色体上[16，18]，并已根据番茄品种Heinz 1706的序列精细定位到包含6个预测基因的区域[19&未公布的结果。这6个基因中没有一个编码具有NB-LRR结构域的蛋白质。揭露的身份Ol-1尚未成功，因为单独沉默预测的候选基因并没有减弱携带Ol-1(NIL -Ol-1)(未发表的结果)。另一种抗性基因Ol-4 -哪个基因已经渗入美国peruvianumLA2172对在与快速人力资源[16]．它已经被映射到Mi-16号染色体上的基因簇[15]．疾病试验表明，无Ol-4是否对根结线虫有抗性，说明存在一种功能Mi-1编码NB-LRR型蛋白的同源物。此外,沉默Mi-1同源染色体在NIL -Ol-4削弱了对两者的抵抗力在还有根结线虫，说明了这一点Ol-4是一个Mi-1同族体(20.］．

在之前的一项研究中旨在阐明在本研究利用cDNA-AFLP方法，在模拟接种或接种白粉病后，鉴定了抗病番茄NILs相对于感病的Moneymaker (MM)的转录衍生片段(TDF)存在或强度差异在［17，21]．利用Sol Genomics Network (SGN)数据库对多个差异表达TDF的序列进行BLAST分析，以鉴定与每个TDF具有最高同源性的非基因序列。随后，以烟草响尾蛇病毒(TRV)为基础的病毒诱导基因沉默(VIGS)构建了针对ungenes的结构。然后对检测TDF的基因型进行VIGS，分析目标基因沉默是否发生改变在阻力。这样，就证明了假定的谷胱甘肽S-transferase基因是必需的Ol-1介导的抵抗在［22]．

在本研究中，我们重点研究了另一个差异表达的TDF (M11E69-195)，并分析了其参与在阻力。M11E69-195在NIL-中特别出现Ol-1但在MM和NIL-中不存在Ol-4［17，21]．该TDF序列与acetolactate合酶（肌萎缩性侧索硬化症)．ALS (EC 2.2.1.6)通常被称为acetohydroxyacid synthase (AHAS) [23在其他研究中。在本研究中，我们基于SGN数据库中的注释将其描述为ALS。ALS催化产生支链氨基酸(BCAAs)的第一步:缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸[24]．由于它是一种商业上成功的除草剂，因此得到了广泛的研究。不同的除草剂分子可以阻断底物进入ALS酶的活性位点[25]．在这里，我们报告肌萎缩性侧索硬化症在Ol-1 -番茄对白粉病的介导抗性。

下调两个肌萎缩性侧索硬化症基因同时妥协Ol-1-介导的抗白粉病在

在Li等人的cDNA-AFLP研究中[17，21TDF片段M11E69-195([附录1第24号]17];[附录1内第71号]21)在防NIL -Ol-1，但没有在易感毫米,在防NIL -Ol-4．在番茄基因组序列公开之前，首先利用SGN数据库对该195 bp的TDF片段进行BLAST分析。单基因SGN-U196237, a甜椒肌萎缩性侧索硬化症基因(附加文件1A).根据U196237序列设计引物，用NIL- PCR方法得到一个全长287 bp的PCR产物Ol-1将cDNA作为模板克隆到VIGS载体TRV2中，得到载体TRV-U196237(图1)．TRV-U196237对NIL-的渗透Ol-1诱导的形态变化，包括矮个子和卷曲的叶片和褪绿区(图2A).随后，对VIGS植物进行接种在．真菌生物量的定量分析表明，与空载体(TRV-EV)相比，TRV-U196237渗入植物的真菌生物量显著增加(3倍)(图)2B)。

在获得番茄基因组序列后，对VIGS载体中的序列进行了新的BLAST分析。这导致了三个假定的确定肌萎缩性侧索硬化症番茄基因命名ALS1（Solyc03g044330)，ALS2（Solyc07g061940),ALS3（Solyc06g059880)(额外的文件1后者虽然存在于6号染色体上，但并不存在于染色体中Ol-1地区(19]．在氨基酸水平上，ALS1和ALS2预测蛋白的同源性达到94%，而ALS3与ALS1和ALS2预测蛋白的同源性有较大差异(与ALS1和ALS2的同源性分别为75%和78%)1C)。ALS1和ALS2基因被预测包含一个外显子，然而ALS3被预测包含三个外显子(图1)．对TDF序列(源自NIL-Ol-1行)与三个注释肌萎缩性侧索硬化症基因显示TDF可能来源于ALS3直接同源的美国habrochaites (额外的文件1然而，VIGS结构中的克隆片段与三个注释的片段进行比对肌萎缩性侧索硬化症基因的同源性最高ALS2．这种差异可以解释为，在构建VIGS载体时，引物是基于与TDF同源性最高的SGN单基因设计的，而不是基于EST序列的ALS3存在于SGN数据库中。排列表明，VIGS矢量的目标是两者ALS1和ALS2,但不ALS3,基于至少21个核苷酸的相同序列是有效沉默所必需的假设。为了验证沉默的特异性，转录水平ALS1，ALS2和ALS3NIL -Ol-1采用qRT-PCR方法，将每株植物的第三和第四片全叶汇集后，提取RNA，对受VIGS影响的植株进行检测。在这个实验设置中，三个表达水平肌萎缩性侧索硬化症trv - u196237渗透的植株与trv - ev渗透的植株相比，基因含量没有显著降低(数据未显示)，但叶片形态的改变表明存在VIGS效应。然而，我们注意到真菌菌落生长在叶片的褪绿区域比绿色区域更强。因此，转录水平ALS1，ALS2和ALS3比较了trv - u196237渗入植物的绿色区和褪绿区叶片样品的差异。的表达水平ALS1和ALS2褪绿区明显低于绿色区，而ALS3在褪绿区也有一定程度的减少，但不明显(图2C).这表明存在于TRV-U196237 VIGS结构中的片段被特异性沉默ALS1和ALS2,但不ALS3．

为了验证VIGS的结果，我们生成了稳定的NIL-转化子Ol-1在这两个ALS1和ALS2与TRV-U196237相同序列的RNAi结构体(RNAi- als1 + 2)沉默。我们期望当ALS1和ALS2被RNAi有效沉默，转化子将显示与VIGS相同的可见表型，即。具褪绿叶子的小植株。9个初级转化子(T1)自交产生T2家族。对每个T2家族的10个植株进行表型检查。其中一个T2家族(216)在上述表型性状(身材缩小和萎蔫叶片)上表现出明显的分离(图3.A).改变的表型与沉默结构的存在共分离，如图35S启动子的扩增所示(图)3.A).接种后在与未转化的NIL-相比，表型改变的T2植株产孢量增加Ol-1植物(图3.B)，尽管在品种MM中没有达到完全的敏感性。真菌生长和转录水平肌萎缩性侧索硬化症基因在NIL-Ol-1在T2表型改变的植株中。结果表明在与NIL-相比，T2植物的真菌生物量显著增加Ol-1(图3.C).正如预期的那样，两者的基因表达水平ALS1和ALS2在RNAi-ALS1 + 2 T2植株中，ALS3表达没有明显减少(图3.D)。

除了生产稳定的变压器ALS1和ALS2同时沉默，稳定的NILOl-1转化子是由三个肌萎缩性侧索硬化症基因被单独沉默以评估它们的参与Ol-1阻力。没有观察到交叉沉默(附加文件2)．转化的T1植株自交得到T2家族。一个T2族ALS1,三个ALS2，二为ALS3被获得。通过PCR分析，筛选出含nptii的转基因T2植株。转基因T2子代的靶蛋白表达显著降低肌萎缩性侧索硬化症基因(图3.F).三个人的沉默肌萎缩性侧索硬化症单个基因不导致形态学改变，真菌丰度与未转化的NIL-相比没有提高Ol-1植物(图3.E).压制个人的事实肌萎缩性侧索硬化症基因不会妥协Ol-1-介导的抵抗，但至少抑制两种肌萎缩性侧索硬化症基因的抗折性表明其功能肌萎缩性侧索硬化症基因可能是重叠的。

我们并没有试图生成一个同时针对所有三个基因的结构，因为当对这三个基因的完整编码序列进行比对时，不存在至少21个相同的核苷酸的连续延伸肌萎缩性侧索硬化症基因(额外的文件1B)。

肌萎缩侧索硬化症Ol-1介导的抗性

乙酰乳酸合成酶是一种众所周知的商业除草剂靶点，它可以阻断底物与ALS酶活性位点的结合[25]．我们利用该系统来确定ALS是一般参与白粉病抗性还是专门参与白粉病抗性Ol-1介导的耐药性。采用除草剂氯磺隆作为ALS抑制剂。首先，我们研究了除草剂处理对无公害油菜的影响Ol-1植物。由于氯磺隆溶解在丙酮中，我们将只施用丙酮的植物和用水的植物作为对照。除草剂的施用抑制了植株的生长和整体褪绿(图)4A).真菌DNA的定量显示，与丙酮对照相比，除草剂处理导致真菌生物量显著增加(图2)4A和B)。

由于白粉病真菌依赖于活组织来吸收营养，我们想知道是否可能由于沉默而扰乱氨基酸稳态肌萎缩性侧索硬化症可能被病原体利用，进而影响基础防御。为解决这一问题，我们用氯磺隆处理敏感番茄MM。如果ALS对白粉病的基础防御很重要，那么可以预期孢子产生的增加。除草剂处理后，MM植株的形态发生了类似于NIL-的变化OL-1植物。然而，氯磺隆处理的MM植物的真菌生物量与水处理和丙酮处理的MM植物的真菌生物量相似，表明ALS不参与基础防御(图)4B).氯嘧磺隆也适用于无-Ol-4以确定ALS是否普遍参与白粉病抗性信号通路。真菌生物量的定量分析表明，除草剂处理的NILOl-4植株对白粉病的抗性水平与对照无Ol-4这表明ALS对植物的抗性是可有可无的Ol-4，编码NB-LRR型蛋白(图4B)。

与VIGS和RNAi植物的结果相似，我们观察到，虽然NILOl-1ALS功能受损的植物对ALS的敏感性增加在，未达到品种MM的完全敏感性。如图所示4C，其中真菌生物量在NIL-Ol-1和NIL-Ol-4植物被校准到水处理MM的水平。

的表达肌萎缩性侧索硬化症白粉病发生的基因Ol-1和毫米

调查三个人的反应肌萎缩性侧索硬化症在NIL-中测定其转录水平Ol-1和MMALS1和ALS2在两种基因型中均检测到，且均不受接种白粉病的诱导(图5)．方差分析表明，两组间表达水平无显著性差异ALS1和ALS2NIL -Ol-1和毫米。ALS3仅在NIL-中检测到表达Ol-1，而在MM中，它可能在检测水平以下弱表达，或者根本不表达(图)5)．我们可以排除引物量化的可能性ALS3由于以基因组DNA为模板获得了预期大小的PCR产物，因此不适合MM的表达。进一步，RNA-seq数据ALS3（Solyc06g059880)源自番茄栽培海因茨[26)确认ALS3不是用番茄叶表示的(附加文件3.)．

在比较抗白粉病nill和敏感MM时显示存在或强度差异的差异表达转录本的筛选中，确定了TDF M11E69-195 [17，21]，表示与acetolactate合酶．这个TDF在NIL-中特别存在Ol-1，但MM和NIL-均不存在Ol-4［17，21]．通过VIGS、RNAi和除草剂的靶向乙酰乳酸合成酶，我们证明了ALS活性特别重要Ol-1 -基于电阻(图2B,3.C和4B).根据除草剂处理MM后敏感性不变的结果表明，ALS似乎不参与基础防御，也不需要由nb - lrr型抗性基因控制的抗性，根据除草剂处理NIL-的结果表明Ol-4(图4B)。

参与的可能性ALS3在Ol-1介导的抗在

事实TDF M11E69-195是在NIL-Ol-1，但MM和NIL-均不存在Ol-4可能仅仅是由MM和NIL之间的核苷酸多态性引起的Ol-1．然而，我们已经证明了相应的ALS3基因是真正的差异表达，如ALS3在NIL-的叶片中观察到转录产物Ol-1但不在MM叶片中(图5)．M11E69-195序列来源于NIL-Ol-1与ALS3比ALS1和ALS2从美国lycopersicum(附加文件1一个)。ALS3（Solyc06g059880)位于6号染色体的长臂上，但不在Ol-1地区。ALS1和ALS2分别位于第3和第7染色体上。NIL -Ol-1只包含(部分)的6号染色体美国habrochaitesG1.1560而其他所有染色体来自美国lycopersicumMM，我们预料到了ALS1和ALS2基因从NIL -Ol-1这确实是在测序完成后观察到的ALS1和ALS2互补脱氧核糖核酸NIL -Ol-1(数据没有显示)。相反，排序完整ALS3互补脱氧核糖核酸NIL -Ol-1在NIL-中发现了大量的SNPs和indeleOl-1与SGN数据库中Heinz番茄品种的预测序列进行比较(附加文件)1NIL - B)Ol-4，包括从美国peruvianum加入LA2172 [19，显示出遏制ALS1和ALS2序列与来自MM的相同，而ALS3序列从NIL -Ol-4区别于MM和NIL-Ol-1．

VIGS和RNAi结构具有针对性ALS1和ALS2,但不ALS3(数据2C和3.D)。ALS1和ALS2在所有三种基因型中是相同的，但沉默的效果是针对NIL-的Ol-1,我们想知道是否ALS3对番茄白粉病具有抗性作用Ol-1．虽然ALS3是同源acetolactate合酶ALS3蛋白的确切功能尚不清楚。在植物中，ALS是一种杂聚物，由催化和调节亚基组成[25，27，28]．番茄ALS1、ALS2和ALS3三种蛋白都与已知的催化亚基同源，如番茄的SuRA和SuRB蛋白烟草［29]．在基因组序列可用的茄科物种中有三个肌萎缩性侧索硬化症有编码催化亚基的基因。相反，拟南芥中只有一个肌萎缩性侧索硬化症基因编码催化亚基，例如At3g48560．

用MM和NIL-表示Ol-4只有ALS1和ALS2都表示为叶子，而ALS3不是。类似的ALS3在美国pimpinellifolium和美国tuberosum不是用叶子表示的(附加文件3.)．NIL -Ol-1是例外吗，比如这个基因型ALS3是用叶子表示的，加上ALS1和ALS2，因此ALS3可以并入ALS全酶中。可能的是，ALS全酶中不同催化亚基的存在赋予了不同的功能或底物特异性。虽然沉默的只有ALS3NIL -Ol-1并没有增加易感性在(图3.E)，这并不排除ALS3与抵抗有关。得到的变换器表现出显著的沉默ALS3(图3.F)，但没有实现与敲除突变相媲美的完全沉默。还需要额外的实验来说明ALS3在NIL-的叶子中Ol-1的表达式美国habrochaites ALS3MM背景基因。

由肌萎缩侧索硬化症活性改变引起的氨基酸稳态Ol-1 -介导的抗性

虽然乙酰乳酸合酶是几种除草剂的已知靶点，但除草剂结合如何影响植物中的氨基酸代谢尚不清楚。Scheel和Casida [30.]，发现氯磺隆处理大豆悬浮液可使大豆中缬氨酸和亮氨酸含量降低，但对其他氨基酸无影响。他们表明，通过提供外源缬氨酸或亮氨酸，或缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的组合，氯磺隆的生长抑制可以缓解。与影响als的除草剂Ray [31观察到在豌豆离体根培养物中添加缬氨酸和异亮氨酸可以逆转除草剂诱导的生长抑制。生长迟滞也可由个别最终产物的反馈抑制引起。Chen等[28结果表明，在生长培养基中添加缬氨酸或亮氨酸对拟南芥幼苗的根生长有抑制作用，而添加异亮氨酸对拟南芥幼苗的根生长没有影响。当在培养基中加入缬氨酸+异亮氨酸或亮氨酸+异亮氨酸时，根系生长抑制不明显，表明异亮氨酸抵消了缬氨酸和亮氨酸的抑制作用[27]．Royuela等人[32]检测到氯磺隆处理后的小麦和玉米中除BCAAs外的某些氨基酸的相对比例增加。Höfgen等[33]沉默肌萎缩性侧索硬化症在马铃薯中通过反义抑制，导致ALS活性下降高达85%。强烈的沉默肌萎缩性侧索硬化症导致严重的生长迟缓和发育不良，叶片褪绿。用咪唑啉酮类除草剂处理也可得到类似的表型改变。氨基酸测定表明，反义和除草剂处理后的植物中总游离氨基酸和干扰成分均有积累。出乎意料的是，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸的含量非但没有降低，反而升高了，特别是在较老的库叶中。

最近，报道了另一个除草剂抗性、增加的氨基酸水平和对真菌的抗性之间的联系。专利US8383887 [34揭示了玉米植株表达这种细菌gdhA基因(nadph依赖的谷氨酸脱氢酶)对黄曲霉毒素的积累具有抗性曲霉属真菌感染。此外，玉米和烟草植物随着gdhA基因对根腐病具有抗性镰刀菌素virguliforme感染。此前，已有研究表明，烟草植物与gdhA基因显示出对除草剂谷膦酸盐的抗性增强[35这些植物中的游离氨基酸总量也增加了[36，37]．

综上所述，ALS抑制对单个氨基酸水平的影响很难预测，因为它似乎取决于不同组织中的残馀ALS活性水平，以及单个氨基酸(组合)的反馈抑制效应。尽管如此，我们还是研究了BCAAs含量是否影响番茄品种MM和NIL-对白粉病的敏感性或抗性Ol-1通过外源施用亮氨酸异亮氨酸缬氨酸[10&附加文件4．实验还包括了高丝氨酸和苏氨酸，因为它们被发现影响植物的免疫力，而苏氨酸是异亮氨酸的前体。如果高水平的BCAAs有助于Ol-1-介导的抗性，我们希望通过提高BCAAs水平在MM中获得一定程度的白粉病抗性。真菌DNA定量分析表明，外源施用高丝氨酸显著降低了对MM的敏感性，提高了NIL-的抗性Ol-1来在而施用其他氨基酸对MM和NIL-无明显影响Ol-1来在［10&附加文件4．我们也没有观察到生长迟缓，这可能是由个别最终产物引起的，可能是因为浓度不够高而导致这种情况。结果表明，BCAAs含量的降低或单个氨基酸组成的改变可能与BCAAs含量的升高有关Ol-1-介导的白粉病抗性。氨基酸剥夺被认为可以激活拟南芥的防御系统。例如，BCAAs饥饿诱导了病原体诱导的抗菌素camalexin的积累[38]．另一种假说是氨基酸衍生的信号参与防御信号通路，如拟南芥基因所建议的ALD1和AGD2编码转氨酶(39]．此外，对植物激素缀合物的研究表明茉莉酸酯(JA)可以缀合BCAAs [40]，特别是ja -异亮氨酸是激素的主要生物活性形式[41]．此外，参与接合的一种酶的表达改变会影响水杨酸介导的抗病能力[42]．

在…的情况下Ol-1，通过沉默来扰乱氨基酸平衡肌萎缩性侧索硬化症或者除草剂处理可能会损害信号网络的完整性，导致失去抗性Ol-1．未知的身份Ol-1这让我们更难理解两者之间的联系Ol-1 -介导的抗性和氨基酸稳态。克隆Ol-1,氨基酸稳态的测定和激素信号通路的变化的解剖将有助于理解ALS活性的需求Ol-1并阐明了氨基酸代谢与植物免疫的相互作用。

番茄基因组编码三个肌萎缩性侧索硬化症基因。他们每个人的沉默并没有减弱Ol-1-介导的番茄白粉病抗性，同时下调两者ALS1和ALS2同时或抑制肌萎缩性侧索硬化症活性导致丧失Ol-1-介导的番茄白粉病抗性。进一步研究克隆Ol-1氨基酸稳态与ALS活性的关联可能为氨基酸代谢在番茄抗白粉病中的作用提供线索。

植物材料，真菌分离和接种

所有的近等基因系(NIL)已在前面进行了描述[15]．它们是通过与含有抗性基因的野生番茄品种杂交获得的美国lycopersicum品种Moneymaker (MM)，与MM进行3次回交，然后是2次自交(BC3S2植株)。Ol-1introgressed从美国habrochaitesG1.1560,而Ol-4introgressed从美国peruvianum(或美国秘密) LA2172。粉孢子neolycopersici（在在21/19°C(昼/夜)条件下的生长室中，对感病的MM植株保持分离株荷兰。用自来水冲洗严重侵染番茄叶片上的真菌孢子，稀释至2.5 × 10浓度⁴将接种物均匀喷洒在3 ~ 4周龄植株上。

病毒诱导基因沉默(VIGS)

VIGS使用基于trv的载体系统进行[43]．针对SGN-U196237的TRV2结构的引物为Fw-U196237-caccCAATGGGAGGATCGGTTCTA和Rv-U196237-ATCTCCCATCACCCTCTGT。从NIL-的cDNA中扩增出一个290 bp的片段Ol-1克隆到pENTR/D-TOPO载体(Invitrogen)。序列验证后，将片段引入pTRV2-attR1-attR2载体[43通过LR重组。将得到的TRV-U196237矢量转化为农杆菌属应变GV3101。用TRV1和TRV-U196237(按1:1的比例组合)对10日龄植株的子叶进行农业浸种，建立VIGS。作为对照，使用TRV1和空TRV2载体(TRV-EV)的混合物。浸水后三周，对植株进行喷洒在培养液。进行了三个独立的实验。在两个实验中，通过计算叶片上真菌菌落的数量，疾病症状目视评分为21 dpi。在一个实验中，利用5株TRV-EV和10株TRV-U196237的RNA，定量测定了沉默水平和真菌生长情况。

产生稳定的静音线路

同时抑制ALS1和ALS2通过RNAi，将与VIGS构建的TRV-U196237相同的片段引入pHellsgate8载体[44]．以达到瞄准的目的ALS1和ALS2分别根据3 ' UTR序列设计引物。为ALS1弗兰克-威廉姆斯:ALS1-caccGCCAAAAGTGTTCGATTTGT和Rv -ALS1-AGTGAACATAAATACCAAGTAGAAGAT。ALS2: Fw -ALS2- cacctgtttacttaaaagtttttc ATTGTG和Rv-ALS2-TTAGTCATACTAAATAGAGCTCCAAA。抑制ALS3，根据编码区Fw-序列设计引物ALS3-caccTTATCTTGGAAATCCTTCTAACAA和Rv -ALS3-TTCTTATGAATCACTTGAGCA。将上述引物扩增的片段导入pHellsgate8载体[40，最后变成了农杆菌属菌株AGL1 + virG。对于消声线的生成，采用了Huibers等人描述的协议[10使用了)。自体转化子(T1)产生T2家族。对于每个分离T2家族，CaMV 35S启动子引物Xho-Fw-TGCTGACCCACAGATGGTTA和35S2-GATAGTGGGATTGTGCGTCA [45利用NPTII引物fl -NPTII- ttcccctcggtatccaatta和rt -NPTII- gattgtctgttgtgcccagt扩增170 bp片段，筛选转基因T2植株。

除草剂的应用程序

氯嘧磺隆购自Aldrich-Sigma (PS-1065)，粉剂用丙酮溶解(0.2 mg/ml)。将除草剂溶液施用于30日龄的MM和NIL-的植株Ol-1在普通盆栽土壤中生长在约14厘米的花盆中。使用前暂停浇水两天，以确保溶液完全吸收。以水和丙酮作为对照。用移液管向土壤中加入氯磺隆溶液、丙酮和水(每罐8 ml)。在此之后，植物受到白粉病的侵袭在同一天施用除草剂。每基因型用氯嘧磺隆处理15株，用水或丙酮处理5株。

定量逆转录PCR (qRT-PCR)及数据分析

定量的真菌生物量，从番茄叶片中提取DNA或RNA。对于转录水平的定量，使用RNA。用DNeasy plant mini kit (Qiagen)分离DNA。用RNeasy试剂盒(Qiagen)从单叶中提取总RNA。用DNase I (Invitrogen)去除DNA后，用SuperScript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)合成1 μg总RNA。采用iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad)和CFX96 real-time系统(Bio-Rad)进行实时定量PCR。PCR扩增由最初的变性步骤3分钟在95°C,其次是变性为15秒95°C,退火和延伸为1分钟60°C 39周期,然后最终融化从65°C到95°C匝道与每周期监控特异性0.5°C的增量。用于真菌定量的引物为Fw-在-CGCCAAAGACCTAACCAAAA和Rv -在-AGCCAAGAGATCCGTTGTTG。引物对番茄延长因子1α（英孚)是弗兰克-威廉姆斯-英孚-GGAACTTGAGAAGGAGCCTAAG和Rv -英孚-CAACACCAACAGCAACAGTCT [46]．的相对转录水平检测肌萎缩性侧索硬化症基因引物为Fw-ALS1-CGCTCAACATAATCGTCGTG和Rv -ALS1-ACGGGAAACGAATGTTTCAG为ALS1；弗兰克-威廉姆斯,ALS2-CCCTTCTTCCCAAATCTACCT和Rv -ALS2-TTGAAACAGTGAAACGGCTATG为ALS2；弗兰克-威廉姆斯,ALS3-TTTGCTGCTAGCATTTGGAG和Rv -ALS3——GGAGTCGATATCAATGTGAACAAALS3．为时间过程实验中三个表达式肌萎缩性侧索硬化症接种后对基因进行监测在，采用同一套引物检测各基因的相对转录水平肌萎缩性侧索硬化症基因沉默后。为分析相对表达量和真菌生物量，2^——ΔΔCt如Livak和Schmittgen所描述的方法[47使用了)。采用独立样本t检验、单向方差分析或基于事后比较的组间双向方差分析对数据进行统计检验，采用Tukey的HSD检验(P< 0.05)。所有的分析都是按照SPSS生存手册4的指导使用SPSS Statistics 20进行的^th版(48]．

高东丽获得国家留学基金委资助。

作者指出

1. 罗宾的P Huibers

   现住址:荷兰，恩克惠泽，DB, 1602

从属关系

1. 瓦赫宁根UR植物育种，386，瓦赫宁根，AJ, 6700，荷兰

   Gao Dongli, Robin P Huibers, Annelies EHM Loonen, Richard GF Visser, Anne-Marie A Wolters & Bai Yuling

相应的作者

对应到玉玲白．

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

DG进行了实验。AEHML参与除草剂实验。DG, RPH和YB设计了实验。YB起草了手稿的提纲，DG和AMAW撰写了论文。YB和RGFV对手稿进行了评论。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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