GIGANTUS1 (GTS1)是转导蛋白/WD40蛋白超家族成员，通过核糖体-生物发生蛋白相互作用控制种子萌发、生长和生物量积累拟南芥

背景

WD40结构域存在于大量真核蛋白中，作为辅助其他蛋白正常活动的支架分子，参与多细胞过程。它们由44-60个氨基酸残基组成，通常以WD二肽终止。它们作为蛋白质相互作用的位点或多重相互作用的平台，驱动蛋白质复合物的组装或作为其他蛋白质之间短暂相互作用的介质。在拟南芥WD40蛋白超家族成员被认为是植物特异性事件的关键调节剂，在生物学上在发育和应激信号传导中发挥重要作用。

结果

利用反向遗传和蛋白质建模方法，我们对WD40重复蛋白的新成员GIGANTUS1 (GTS1)进行了表征拟南芥并为其在控制植物生长发育中的作用提供证据。GTS1在胚胎发育过程中高表达，负调控植物种子萌发、生物量产量和生长改善。结构建模分析表明，GTS1折叠成一个β-螺旋桨，围绕中心轴有7个伪对称排列的叶片。分子对接分析表明，GTS1通过β-螺旋桨叶片4与两个核糖体蛋白伴侣、核糖体Nop16组分和核糖体生物发生因子L19e物理相互作用，调节细胞生长发育。

结论

这些结果表明，GTS1可能通过调控植物细胞核糖体的结构特征、活性和生物发生，在植物发育过程中发挥作用。我们的研究结果表明，GIGANTUS1可能是一个有希望的目标，以设计具有更高生物量和改善生长发育的转基因植物，用于植物为基础的生物能源生产。

在植物中，生长发育、细胞模式、产量和生物量积累是由几个数量级的功能遗传网络控制的，这将需要各种互补的研究方法来揭示这种功能遗传复杂性的基础。利用反向遗传和计算蛋白质模型的结合，我们发现了一个名为GIGANTUS1 (GTS1)的蛋白质，它是调节植物生长发育的转导蛋白/WD40蛋白超家族的成员。

转导蛋白/WD40重复蛋白是介导多种蛋白质相互作用的蛋白质中的重要特征，包括参与支架和动态多亚基复合物的合作组装和调节的蛋白质[1，2]。这些蛋白的共同和明确的特征是短至40个氨基酸基序，通常以Trp-Asp序列结尾，通常由7-8叶状β螺旋桨折叠组成。然而，已发现多种蛋白质具有4至16个重复单位[3.]。WD40结构域的低序列保守性和功能多样性给其鉴定带来了困难。

重复的WD40结构域在细胞分裂和细胞质分裂、凋亡、光信号和视觉、细胞运动、开花、花发育、分生组织、蛋白质运输、细胞骨架动力学、趋化性、核输出到RNA加工、染色质修饰和转录机制等生物过程中发挥核心作用[qh]4]。它们是蛋白质相互作用的场所，蛋白质的特异性是由重复序列外的序列决定的。它们的功能重要性主要存在于蛋白质表面。它们在细胞网络中充当多种相互作用的平台，用于蛋白质复合物的组装或其他蛋白质之间短暂相互作用的介质[5]。结构研究表明，这种特性源于它们使用多个表面与多种蛋白质、肽或核酸相互作用的能力，其中WD40蛋白最常见的肽相互作用位点位于靠近中央通道的螺旋桨顶部表面[6]。

虽然WD40蛋白也存在于细菌中，例如:高温单孢菌属curvata［7),藻青菌集胞藻属［8]， WD40结构域是真核生物蛋白质组中10个最丰富的结构域类型之一，相互作用组研究表明它们是最混杂的相互作用物之一。尽管几种含有WD40的蛋白在植物特异性发育事件中起着关键的调节作用，但与其他常见结构域(如激酶结构域)相比，WD40结构域的研究较少。到目前为止，还没有对WD40蛋白进行全面的三维结构分析，揭示其相互作用伙伴，突出WD40结构域介导不同生物功能的相关性[9]。此外，与β-螺旋桨家族的其他成员相反，尽管对酶复合物至关重要，但没有WD40蛋白具有催化活性的报道。

为了全面了解GTS1和转导蛋白/WD40蛋白家族的分子和结构调控机制，我们对拟南芥中GIGANTUS1的功能特征进行了全面的表达谱分析、基于突变的表型表征和基于结构的蛋白建模。这是首次发现拟南芥GTS1蛋白的相互作用伙伴。基于蛋白质同源性建模的综合分子和结构分析，以及对接相互作用研究，阐明GTS1蛋白在调节植物生长发育中的功能机制拟南芥都被执行了。我们描述了a的表型特征gts1并评估GTS1- 3d分子结构及其对接特征，揭示GTS1与其他蛋白的调控关系。

植物材料和GTS1表达谱分析

拟南芥(生态型Col-0)和gts1本研究使用拟南芥生物研究中心(ABRC)的T-DNA SALK_010647基因敲除突变体。将合适的种子播种在Murashige和Skoog (1 × MS)琼脂板或土壤上，在120 ~ 150 μEm的连续光照下生长²年代¹)，温度为24℃。采集不同发育阶段的幼苗样本进行基因表达谱分析。分析…的表达GTS1基因，总RNA用TRIzol试剂(分子研究中心)提取，然后用qScript cDNA Supermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA)进行反转录，如前所述[10]。然后，以cDNA为模板，使用基因特异性引物进行PCR(表2)1)，运行20或25个放大周期(线性放大范围)，除非另有说明[11]。通过增加循环数和分析cDNA片段的数量来确定扩增的线性范围。PCR片段在含有溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶上分离。由ACTIN (AT3G18780)产生的cDNA片段作为内参。T-DNA插入GIGANTUS1基因pcr证实GIGANTUS1基因特异性引物和T-DNA左边界(LB)引物(表2)1）.的表达式GTS1基因gts1通过提取总RNA分析突变背景gts1个纯合子系，如上文所述，逆转录成cDNA [10]，并进一步用于表达式分析。

GTS1数据库检索和系统发育分析

的拟南芥GTS1cDNA序列(AT2G47790)从拟南芥- tair网站上获得，并用于对拟南芥进行核苷酸BLAST (BLASTn)搜索栽培稻(水稻)基因组序列在SALK研究所水稻网站界面。下载并翻译与拟南芥cDNA同源度最高的水稻序列。然后将翻译的水稻序列与拟南芥蛋白序列比对，以验证该基因的鉴定。然后使用水稻cDNA序列对序列进行(BLASTn)搜索玉米MaizeSequence.org网站上的基因组。BLAST对玉米基因组的搜索产生了与查询序列一致的BAC序列列表。在基因组图谱上显示出相似性最高的BAC。下载完整的BAC序列并与栽培稻cDNA序列采用NCBI BLAST (bl2seq)算法。一旦确定了特定基因的同源外显子，外显子的起始和结束位置就会根据典型剪接位点供体/受体序列和一个外显子与下一个外显子的重叠序列进行手动校正。然后将每个假定的玉米cDNA翻译成蛋白质序列。两者GTS1蛋白序列栽培稻和玉米都与拟南芥序列使用EMBOSS全局成对比对算法[12来获得蛋白质之间的相同百分比。下一个BLASTp搜索智人NCBI数据库中的蛋白质组分析采用拟南芥GTS1蛋白序列。从这个搜索Wdr89序列智人被鉴定为最同源的蛋白。使用Wdr89序列检索(BLASTp)鼠形和亩肌肉序列同源染色体。最后，一个ClustalW2对齐[13的GTS1蛋白序列进行比对拟南芥，水稻，和玉米的Wdr89蛋白序列智人鼠形,亩肌肉．

保守的WD40蛋白序列拟南芥使用ScanProsite和Swiss-Prot/颤抖数据库进行鉴定。利用鉴定的WD40序列在NCBI上对植物蛋白质组进行BLASTp搜索。从潜在的含有WD40的蛋白列表中，有几个cDNA序列GTS1类蛋白从烟草benthamiana，烟草，大麻，菜豆，Medicago truncatula，陆地棉，Lycopersicon esculentum，茄属植物chacoense，茄属植物lycopersicum,Physcomitrella金属盘．将收集到的含有cDNA序列的植物WD40与cDNA序列进行组合拟南芥，栽培稻,玉米先前获得的cDNA序列使用RevTrans version 1.4进行比对[14]。使用MrAIC [15- - - - - -20.]模型测试软件确定了构建系统发育关系的最佳AIC模型是具有Gamma的一般过渡率(GTR)。

系统发育树在MrBayes中使用4个马尔可夫链蒙特卡罗运行生成，每个运行3个冷链和1个热链，每100代采样1,000,000代。这种燃烧被确定在每个系统发育的前4000代之内。移除前10000代样本，并从剩余的树中构建50%的共识多数树。然后使用1.6.6版本的TreeView绘制树，并使用Physcomitrella金属盘序列作为外组。

序列交互数据库检索

拟南芥使用转导蛋白/WD40重复蛋白GTS1 (NCBI登录号AEC10888)作为查询，从Uniprot (http://www.uniprot.org)，以及NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库使用BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）.

GTS1蛋白相互作用网络使用STRING v9.0 (http://string-db.org)数据库。STRING结果给出了GTS1蛋白的两个最可能的相互作用蛋白对偶物，即60S核糖体结构蛋白L19e (NCBI加入号AEE75864)和Nop16 (NCBI加入号AAP21378)，这是一种参与60S亚基核糖体生物发生的蛋白。

功能域分析

通过查询不同的结构-功能基序和/或模式数据库，如Pfam v25.0 (http://pfam.sanger.ac.uk)、普罗赛特(http://prosite.expasy.org/scanprosite)、SMART v6.0 (http://smart.embl-heidelberg.de)、保守域数据库(CDD) v3.02、保守域架构检索工具(CDART)和cd搜索工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)、InterPRO v35.0 (http://www.ebi.ac.uk/interpro)， ProDom发布2010.1 (http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php)， CATH v3.4 (http://www.cathdb.info)， Superfamily v1.75 (http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY)， pirsf (http://pir.georgetown.edu)，功能性搜索由PANTHER (http://www.pantherdb.org）.对相互作用的核糖体蛋白Nop16和L19e进行了类似的分析。

二次构造预测

通过蛋白质数据库(PDB)对GTS1蛋白的二级结构元件进行初步评估，确定其亚结构保守基序(http://www.pdb.org)库使用线程算法Segmer [21]。二级结构的这些元素也通过与其他额外的二维结构服务器(SSpro8 (Scratch Protein Predictor)，http://scratch.proteomics.ics.uci.edu)， NetSurfP版本。1.1 (http://www.cbs.dtu.dk)，以及PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)折叠服务器。这些二级结构预测也对相互作用的核糖体蛋白Nop16和L19e进行了预测。

结构模板搜索

在蛋白数据库(Protein Data Bank, PDB)中检索GTS1、Nop16和L19e的蛋白序列进行同源性分析。用BLASTp从BLAST服务器(http://ncbi.nlm.nih.gov）.生物信息库元服务器(http://meta.bioinfo.pl)，该方法采用折叠识别进行同源性搜索，也用于模板的选择。将上述方法得到的结果与Swiss-model server模板识别得到的结果进行比较(http://swissmodel.expasy.org）.

同源性建模

通过I-TASSER服务器进行同源建模[22]。生成初始结构模型，并使用ProSA (http://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)，并使用QMEAN (http://swissmodel.expasy.org/qmean/cgi/index.cgi）.

最终结构的能量最小化是使用在DeepView/Swiss-PDBViewer v3.7 (http://spdbv.vital-it.ch)，以改善范德华接触和纠正模型的立体化学。

使用以下软件对每个结构进行评估:QMEAN用于质量评估，PROCHECK (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK)用于立体校正、ProSA和ANOLEA (http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/anolea)作为蛋白质能量。通过Ramachandran图计算和可视化每个结构的有利区域的蛋白质残基数量。

配体结合域与保守分析

利用Cofactor软件分析三维蛋白质结构中的配体结合位点(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COFACTOR)，以识别功能同源性。基因本体(Gene Ontology)术语(The Gene Ontology project)用于基于3D构建的模型识别功能类似物，表明蛋白质可能参与的功能和生物学途径(http://www.geneontology.org）.

利用ConSurf服务器(http://consurf.tau.ac.il）.查询蛋白的结构功能保守性和关键残基通过ConSeq server (http://conseq.tau.ac.il）.

表面静电势分析

利用PyMol 0.99软件实现的APBS软件获得结构表面氨基酸的静电泊松-玻尔兹曼电位(PB)。http://www.pymol.org)，并使用Python软件包PDB2PQR进行了优化。在310.00 K条件下，采用细网格空间0.35 Å求解顺序聚焦多网格计算中的线性化PB方程。蛋白质的介电常数为2，水的介电常数为80.00。输出网格以标量OpenDX格式处理，使用PyMOL 0.99在表面上渲染等高线和地图。电势值的单位是kT每单位电荷(k玻尔兹曼常数;T温度)。

分子分子对接分析

使用CLUSpro服务器分析GTS1与其每个核糖体对应体(Nop16和L19e)之间的相互作用[23]。在工作流程中，骨干柔韧性分析使用刚体系综对接与多个核磁共振衍生的结构，而ZDOCK选项采样在6度旋转步骤被用来获得诱饵。采用快速傅里叶变换(FFT)相关方法对蛋白-蛋白对接过程中对接构象的能量进行了评估。通过考虑形状互补性、解离性和静电势计算对接分数。最高的对接构象，连同它们的ZDOCK分数，被用作近天然结构的候选物，以及配体与受体在10 Å以内的结合位点的聚类。

聚类后，利用CHARMM对排序后的复合物进行范德华最小化，选择得分最高的蛋白-抑制剂结构作为gts1 -核糖体相互作用蛋白的最拟合模型。

GTS1的分子和结构分析

GTS1基因的表达谱及系统发育分析

拟南芥的GTS1在种子萌发期间高度表达，特别是在胚胎、胚珠和胚乳中积累，(图1A, B)。它在分生组织区域大量表达，表明它在调节细胞分裂中起着至关重要的作用(图2)1A).强组织(脱落区)特异性表达谱GTS1(图1A)表明其在植物生长发育过程中的调控意义(图2)1A、B)。

我们证实了这点GTS1转录本在几个主要器官中积累，包括发育中的花、发芽的种子、莲座幼叶(图2)1B).不同发育阶段的芯片数据分析也揭示了细胞分裂/生长诱导基因的重叠表达模式GTS1(附加文件1:表中高亮显示的图S1)2［24]。这些基因参与转录和转录后过程，以及各种生化途径(表1)2）.基于拟南芥GTS1与其他已被充分表征的WD40蛋白同源物之间的高度氨基酸一致性(附加文件)2:图S2)，系统发育分析表明拟南芥GTS1与水稻和玉米GTS1聚类(图S2)1C)，这表明它们之间的相似性比它们与其他GTS1-WD40重复序列的相似性更大(图2)1C)。这个集群属于优势支系的一个亚支系(图2)1C，灰色分支)含有大部分植物GTS1蛋白同源物。

GTS1调控种子萌发和植物生长发育

为了研究GTS1在植物生长发育中的作用，我们采用了一种反向遗传方法，使用了SALK_TDNA敲除插入(Salk_010647)GTS1基因(图2A)研究GTS1功能缺失对gts1突变体。【翻译】gts1的第一个外显子中有一个T-DNA插入GTS1基因(图2A)，利用t - dna特异性寡核苷酸引物LB1和GTS1-特异性引物(表1）.接下来我们检查并确认了淘汰赛GTS1mRNA转录水平gts1与使用RT-PCR的WT相比(图2)2B).与野生型相比，纯合子gts1突变体(n = 16)的发芽率更快(图2)2C-F)，比野生型生长速度更快，生物量积累量更高(n = 16)(图2)2G, H)，表明GTS1负调控分生组织区域的细胞分裂、生长和总生物量积累。此外,gts1突变体(n = 22)比WT (n = 16)早开花(早5天)(图2)3.A)，与野生型(15±0.5,n = 20)相比，抽苔时的莲座叶数减少了(9±0.6,n = 15)(图2)3.B)突变体(gts1)在萌发后同一天的生长高度明显高于WT(图2)3.一个)。

为了证实GTS1确实是导致这些表型的原因，我们用RT-PCR扩增了1095 bp的基因片段GTS1-编码序列来自WT cDNA(表1)，将其克隆到SmaI pROK2矢量的位置[25] CaMV 35S启动子驱动的过表达[26并稳定地转化gts1花浸法突变体背景分析[27]。不出所料，过度表达GTS1在gts1突变背景足以消除上述描述gts1表型。互补系显示wt样表型，表明该GTS1确实负责表型表征gts1突变体。与其他共表达基因模式不同(表1)2)，有趣的是，我们发现了一种强大的基因到基因的功能关系GTS1(AT2G47790)和核糖体蛋白L19e(At3g16780)(图4）.这一数据显示了两个基因间共表达稳定性的细节。该共表达得到了许多因素的支持，无论考虑何种生长参数/因素，PCA相关性都保持不变。两个轴都是相对于每个基因平均表达水平的以2为基数的对数的相对基因表达值(图2)4）.这些数据证明了一个强大的基因到基因的功能基因表达，表明这两个基因/蛋白质可能在物理上相互作用，以调节/控制植物的生物过程。

搜索结构模板

由于我们证实GTS1调控植物种子萌发和生长发育(生物量产量和开花时间)(图2)2和3.)，我们接下来研究了GTS1的蛋白质结构支架和相互作用伙伴在实现其功能中的作用。为了研究GTS1与其他蛋白在植物生长发育中的物理相互作用，我们在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中寻找已知三级结构的GTS1蛋白。通过搜索得到的晶体结构/PDB登录号为2h91、3iz6、3ow8、2gnq和1tbg，显示出最高的序列一致性(分别为22,17,16,24和15%)。采用BioInfoBank Metaserver对所选模型进行适用性检查，得到GTS1的3D Jury评分(J-score)分别为208.4 (2h91)、2000.2 (3iz6)、198.5 (3ow8)、205.7 (2gnq)和201.9 (1tbg)。为了确定构建GTS1结构可能使用的最佳模板，使用了Swiss-Model server，发现模板2h91、(3iz6)、3ow8、2gnq和1tbg的e值分别为高分(64、61、63、60和69)和非常低的e值(1.5E-37、2.1E-30、4.9E-29、2E-10和1.8E-43)。

遵循相同的工作流程，获得GTS1核糖体相互作用伙伴的有序3d结构蛋白模型的最佳晶体模板。在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中搜索蛋白质L19e和Nop16，得到L19e的晶体结构为3iz5、3jyw和3u5e, Nop16的晶体结构为2aje、1w0t、2juh、2ckx和2roh，通过BioInforMank Metaserver和瑞士模型服务器分析显示，在识别性和适用性方面具有可比性。

螺纹模型的质量

评价蛋白质模型的质量-TASSER和Procheck分析被执行。我的-TASSER分析给出了GTS1的c -得分为-0.9,1848诱饵的tm -得分为0.60±0.14，聚类密度为0.1467rocheck分析结果表明，GTS1蛋白模型的主链构象位于Ramachandran图的可接受区域。77.6%的残基位于最有利区域，14.5%的残基位于允许区域，6.5%的残基位于慷慨允许区域。在不允许的区域分别只有1.4%的残留物存在。各残基的×1与×2扭转角图表明，GTS1模型中大部分转子都定位在低能区。3)ProSa分析GTS1的z -分数为-5.71。模板2h91、3iz6、3ow8、2gnq和1tbg晶体结构的得分分别为-7.31、-4.02、-6.63、-7.93和-7.33，在相似大小的天然蛋白中得分均在正常范围内。(四)QMEAN分析GTS1模型的q值为0.67。模板2h91、3iz6、3ow8、2gnq和1tbg的晶体结构质量因子分别为0.793、0.315、0.71、0.786和0.849，表明GTS1模型在模板晶体结构精度范围内。v)均方根偏差封闭模板的Cα骨架与GTS1模型的RMSD分别为2gnq的2.408 Å和2h91的3.192 Å。

L19e和Nop16蛋白模型也确定了上述所有参数，因此我们的模型L19e和Nop16蛋白的结构质量值相当。

拟南芥GTS1的三维结构

基于同源性建模，我们获得了新描述的拟南芥WD40重复蛋白GTS1的最佳结构模型(图1)5）.拟南芥GTS1的三维结构属于转导蛋白/WD40重复蛋白家族，因为它具有WD40蛋白的所有结构特征(图2)5A)，这与2h9l或2gnq模板的一般晶体结构一致。一般来说，结构可以被想象成一个短的，开放的圆柱体，其中链形成壁。至少需要四次重复才能形成β-螺旋桨。在我们的例子中，GTS1包含7个WDs，其中最后一个和最后一个(即N端和c端)WDs参与同一个β-螺旋桨(图2)5A，潜在地加强了结构。尽管该蛋白的氨基酸序列在不同物种间的一致性较低，但在植物物种和真核生物中，该蛋白的整体折叠(Cα碳链)具有相对较好的保守性[4，28]。

表面静电电位分析(图5B)显示了几个突出的带正电残基(蓝色区域)，主要在圆柱体(隧道)和c端臂的壁上。这种蛋白质的环境基本上是带负电荷的(红色区域)5B)，正如泊松-玻尔兹曼静电势所强调的那样。通过将碱性残基(R, K)赋值为+1，酸性残基(D, E)赋值为-1，计算出GTS1蛋白的净电荷为-22。GTS1结构的中心隧道在俯视图上呈现出以正电荷为主的特征。GTS1与其他WD40重复蛋白，如模板2gnq和2h9l，在一般拓扑结构上没有太大的差异，RMSD值分别为2.408 Å和3.192 Å进一步证实了这一点，而在蛋白质的特定区域，如n端和c端区域，发现了显著差异。

保守和功能/配体结合位点分析

分析了GTS1的保守性和配体结合或功能特征(图2)6）.拟南芥GTS1(旋转180°)表面显示残基守恒指数如图所示6A. Consurf保守分析表明，GTS1柱状β-螺旋桨结构具有相当好的保守性，尤其是位于结构核心的残基(图2)6A).蛋白质的N端和c端是蛋白质的另一个最保守的区域，除了在维持蛋白质结构中起主要作用的核心区[9，29]。核心保守区和表面可变残基的这种分布有助于维持WD40重复蛋白之间相似的总体折叠，但也产生了沿着WD40重复蛋白的多种蛋白质相互作用方面观察到的差异，其中在GTS1结构中，两种核糖体蛋白的红色线表示(图1)6一个)。

数字2B显示了通道状结构中氨基酸的一般视图，这些结构支撑着相互作用的肽。GTS1显示位于结构中心的推定活性位点(最具代表性的配体结合)(图2)6B，俯视图)，它通常是另一种相互作用的多肽，包含几个保守但也很少可变的氨基酸。详细的视图，显示负责配体结合区域周围配体构象的残基的空间分布，并直接涉及这种相互作用Y43，V44，F45， 61, 87，来说，F134，V194S267,R329，肽链底物与隧道状结构结合(图2)6B，右侧详图)。对其他物种中与拟南芥GTS1具有高度同源性的WD40重复蛋白进行保守分析，得到大量高度可变的(粗体)和少量保守的(斜体)残差，如上所述。构象预测表明，肽(配体)被投射到并部分位于GTS1的隧道状结构内。

核糖体L19e和Nop16蛋白的保守性和功能分析如图所示7．图中波浪守恒分析6A表明，Nop16蛋白具有很好的保守性，特别是在相互作用的表面区域(红色箭头，图2)7B)和核酸(蓝色箭头)。蛋白质表面只有少量浅蓝色和深蓝色的残基。该蛋白的配体结合分析见图7B突出显示Nop16蛋白与核酸发生相互作用的区域。该区域位于由n端α-螺旋整合的裂缝中。与蛋白质和核酸相互作用有关的残基有L40，M41，T142,R146产生了四种不太保守的氨基酸(斜体）.

Consurf守恒分析如图所示7C突出显示沿L19e蛋白表面均匀分布的保守和可变残基。与GTS1相互作用的区域似乎不像其对应的Nop16那么保守。很少的可变残基(蓝色)位于与GTS1 n端尾部相互作用的区域(图中红色箭头)7此外，在与核糖核酸直接相互作用的表面中(图中蓝色箭头)。7C, d)， s3, k5，16，R9机型， L10, N36似乎保守性很好，因为只有一个残基I6被发现是可变的(斜体)，其余的表现出平均守恒指数或像R9一样高度保守(粗体)。

GTS1相互作用机制:与核糖体对应物的分子对接分析

为了深入了解GTS1与其他蛋白的调控/多重相互作用模式，我们分析了GTS1与两个参与拟南芥核糖体结构和生物发生的相互作用伙伴之间的构象相互作用。这一分析是通过分子对接进行的，使用了两种核糖体蛋白的新模型结构。

数字8显示了拟南芥GTS1与参与60S核糖体亚基生物发生的核核蛋白16 (Nop16)的相互作用模式。结合机制是通过在两种蛋白质之间形成1:1的化学计量复合物而发生的。图中显示的放大视图描述了这种交互的详细视图8A，其中GTS1的c端臂位于Nop16的n端α-螺旋及其邻近螺旋形成的空腔内，并且该N-t α-螺旋与GTS1的β-螺旋桨4结构直接相互作用。GTS1的N-t α-螺旋完全被Nop16裂缝覆盖，因此阻止了其他相互作用的伙伴进入该区域。另一方面，它也通过体视障碍部分地阻碍了核酸与Nop16结合所必需的相互作用。相互作用是非共价的，因此可以通过增加盐浓度和/或pH到碱性条件来可逆。数字8B在垂直(90º)视图中显示了GTS1中Nop16分子覆盖的大面积相互作用。

在能量方面，两种结构接触面的静电势分析显示出高度兼容的相反电荷指纹分布，即正电荷(在Nop16蛋白的接触区域)和负电荷(主要针对GTS1)(图1)8C).两种蛋白质之间的接触面没有大面积的亲水性，复合物的形成可能是由大量的直接氢键和水介导的氢键介导的。

数字9显示了拟南芥GTS1与60S核糖体蛋白L19e的相互作用模式。结合机制也通过在两种蛋白质之间形成1:1的化学计量复合物而发生。这种交互的详细视图在放大的视图中描述(图1)9A)，其中GTS1的n端区域紧抱L19e的薄结构，相邻的α-螺旋与GTS1的β-螺旋桨4接触。此外，L19e蛋白的n端区域直接与GTS1隧道中央底部的残基相互作用，使隧道中央顶部自由，如图所示8B. L19e蛋白的同一区域也参与了与核糖核酸的相互作用(图2)7D)。两种结构的接触面静电电位分析显示出高度兼容的相反电荷指纹图谱(L19e蛋白接触区域为正电荷，GTS1接触面为负电荷)(图1)9C)。

GIGANTUS1在调节植物生长发育(种子发芽、更快生长、开花时间和生物量积累)方面非常重要(图2)1，2和3.）.这是第一次基因突变GTS1是否与早期发芽、生长发育有关拟南芥．GIGANTUS1调控植物生长发育的分子机制尚不清楚。作为WD40蛋白家族的成员，GTS1在细胞分裂和细胞质分裂、开花、花发育、细胞骨架动力学、核输出到RNA加工、转录机制和蛋白-蛋白相互作用等不同的生物学过程中发挥核心作用[j]。4]。我们推测，GIGANTUS1可能主要作为蛋白质相互作用的位点或其他蛋白质之间短暂相互作用的中介，以调节植物中不同的生物过程。蛋白质复合物的发育涉及主要由支架蛋白控制的调节相互作用，如WD40重复基序。这些基序是多种蛋白质-蛋白质相互作用的重要特征[4]，为蛋白质与其他细胞成分的相互作用提供了一个不弯曲的平台，从而控制了细胞的一些重要功能，如信号级联，细胞运输和凋亡[29- - - - - -31]。

GTS1蛋白的WD40结构域包含7个或7个重复序列的倍数，形成高度稳定的β-螺旋桨结构(图1)5A). 7倍β-螺旋桨是表征已分解WD40结构的最稳定的β-片几何结构，也用于鉴定WD40蛋白[32]。然而，该蛋白家族的成员也被发现含有多达16个重复序列[33]。重复次数少于7次的蛋白质形成不完整的β-螺旋桨结构，需要从邻近蛋白那里获得额外的wd -重复序列来稳定自身，形成二聚体[34]。每个重复序列没有明显的折叠顺序，重复序列的折叠顺序在不同的WD40蛋白中可能不同，甚至在同一蛋白内也可能不同[35]。已知这些蛋白参与光信号/光形态发生和开花[36]，生长素反应和细胞分裂[37]，分生组织维持[38]，花的发育[39]、种子发育及开花[40]，基于染色质的基因沉默和器官发生[39]、蛋白质翻转、微管动力学、磷脂结合和囊泡包覆[4]。这证明了对植物物种间WD40蛋白超家族的大量研究兴趣。我们的数据(数字)2和3.)提示GTS1属于调节生长素反应和细胞分裂的WD40蛋白亚家族[37]，分生组织维持[38]，花的发育[39]、种子发育及开花[40]。本研究中拟南芥GTS1配体结合域(主要功能域)主要位于顶表面残基上，整合了部分β-螺旋桨结构域(图2)6然而，我们的数据显示，GTS1 WD40螺旋桨有三个不同的表面可用于相互作用:螺旋桨的顶部区域，底部区域(图2)9)和周长[4，5)(图8和9)，提示GTS1蛋白通过蛋白间相互作用具有多种功能。事实上，蛋白质-蛋白质和蛋白质-肽的相互作用涉及到β-螺旋桨中央通道的进入位点(图2)6B)，其中大多数相互作用伙伴(包括小分子)结合[5]。GTS1的N端或c端扩展与隧道状结构平行，形成完整的7个WD40重复结构域，使其可以与其他伙伴相互作用(图1)8和9）.因此，WD40结构域可以作为多种蛋白质相互作用的大相互作用平台。与其他结构域相比，含有WD40基序的蛋白质是几个相互作用对的组成部分[41，42]，并充当大型复杂组件的支架。这项工作是首次研究植物中GTS1蛋白的3d结构和分子特征。

为了更好地了解GTS1的哪个区域在植物物种功能保护的复杂形成中起重要作用，我们确定了两个基本的保护区域;第一个位于上缘，由组成叶片4 ~ 7的残基组成，包括N端臂和c端臂;第二大保守面位于螺旋桨底部，主要由叶片1、2、3组成(图2)6A).这些区域代表潜在的蛋白质-蛋白质相互作用位点[43]。

一般来说，植物，特别是拟南芥- wd重复蛋白是高度保守的。这些蛋白质中的大多数是调节植物特异性过程的基本细胞机制的组成部分。一个有趣的问题出现了，这些蛋白质是如何进化成它们特定的细胞角色的。WD蛋白的关键功能过程之一是真核核糖体的生物发生，这是一个高度调控的动态过程，始于核核，rRNA前体(pre-rRNA)转录，并迅速包装成含有核糖体蛋白、非核糖体蛋白和含有snorna的核糖核蛋白颗粒(snoRNPs)的90S核糖核蛋白颗粒。90S前rnps转化为43S和66S核糖体组装中间体，最终产生成熟的40S和60S核糖体亚基[44]。众所周知，核糖体的生物发生是由大量的核糖体前因子驱动的，这些因子在成熟途径中与核糖体前颗粒相关或分离。尽管在鉴定核糖体组装中间体及其蛋白质和RNA成分方面取得了很大进展[45]，关于这些pre- rrnp架构的信息很少。目前尚不清楚哪些蛋白质是组装核糖体中最近的邻居，以及邻近分子在多大程度上一起起作用。

WD40蛋白-蛋白相互作用基序由于其蛋白-蛋白多相互作用的通用性，是介导核糖体组装过程中包含邻域的多蛋白亚复合物相互作用的极好候选基序。已经确定了核糖体组装所需的70多种交易因子[46]，以及存在于核糖体前的80个额外的组装因子[47]。因此，这些含有wd40的蛋白可以通过与其他组装因子或核糖体蛋白顺序或同时相互作用，使前核糖体组装成核。在这些组装因子中，有17个蛋白含有WD40基序[48]。许多被注释的核糖体生物发生- wd40重复蛋白被证明直接与其他蛋白相互作用，或调节其他蛋白的水平[49或成为多蛋白亚复合物的组成部分。酵母WD40蛋白Ytm1是66S pre-rRNPs的一个组成部分，其缺失导致60S核糖体亚基的缺失[50]。它的同系物，哺乳动物WDR12在60S核糖体亚基的成熟中起作用。WDR12与核核蛋白Pes1和Bop1形成稳定的复合物(Pe- BoW复合物)，这对32S前体核糖体RNA (rRNA)的加工和细胞增殖至关重要[36]。有趣的是，酵母中Pes1-Bop1-WDR12的潜在同源复合体(Nop7p-Erb1p-Ytm1p)参与了核糖体生物发生和S期进入的控制[51]。

酵母WD40重复蛋白Mak11调节p21激活的蛋白激酶功能，是60S核糖体亚基核成熟的重要因素，其缺失导致G1期细胞周期延迟，表明Mak11在核糖体组装中的早期核核作用。另一种亚复合物与晚期细胞核前60s前体短暂相关，由四种蛋白质组成，并含有Ipi3作为WD40重复成员[52]。

在这项研究中，一个新的相互作用的对偶物，拟南芥Nop16蛋白被确定为植物中潜在的核糖体生物发生因子，可能与60S核糖体前体的形成有关。这个过程可以通过与GTS1的相互作用来调节(图1)8）.对接分析表明，GTS1与Nop16之间存在稳定的相互作用，涉及n端尾部和4^th第二核糖体因子的n端α-螺旋与邻近的次级元件形成了一个间隙。另一种核糖体蛋白(L19e蛋白)被发现与GTS1相互作用。L19e蛋白与核糖体的结构稳定性有关。GTS1与L19e的相互作用区域与Nop16与GTS1的相互作用区域非常接近(图1)8）.这提示调控生物发生核仁因子Nop16和结构核糖体因子L19e的相互作用机制可能是竞争性的。因此60S核糖体亚基形成、结构成熟和稳定的两个步骤可能在时间和/或不同的细胞室中分开。

支持我们数据的还有另外两个WD40重复核糖体生物发生因子，Rrb1和Sqt1，它们直接与核糖体蛋白相互作用，用于60S核糖体亚基组装。Rrb1与细胞核中的核糖体蛋白Rpl3相互作用并调节其水平[53]，而Sqt1与细胞质中的Rpl10相互作用[54]。这两种蛋白都参与了相应的核糖体蛋白与新生60S核糖体亚基的结合，并可能调节相应的核糖体蛋白水平。其他WD40重复蛋白与小核糖体亚基40S的形成和稳定有关。酵母RACK1通过将PKC招募到核糖体来调节翻译起始[55，56]。4个RACK1同源物在拟南芥可能有类似的活动[57]。这些相互作用可能提供了一种机制来调节由特定mrna编程的核糖体群体的翻译活性[58]。

本研究为GIGANTUS1在控制植物种子萌发、加速生长和生物量积累方面的作用提供了大量证据。该基因主要在分生组织区域表达，因此在细胞分裂中起重要作用。据推测，它通过多种蛋白质相互作用来调节生长发育，包括那些参与脚手架和动态多亚基复合物的蛋白质，如核糖体蛋白的生物发生、稳定性和活性。鉴于其丰富的相互作用表面，GTS1可能在非常多样化的细胞过程中作为许多不同蛋白质复合物或蛋白质- dna复合物的接头起作用，这需要进一步的研究。我们的建模数据表明，GTS1主要通过较小的结构域顶表面介导分子识别事件，该结构域由三个残基组成，与其他肽形成瞬时复合物。进一步研究GIGANTUS1敲除基因在农学上的重要作物中的作用，以提高作物产量和生物量积累，从而实现可持续的植物生物燃料生产，这将是一个有趣的研究方向。

这项工作得到了NSF-REU DBI # 1263163拨款(PI, Benedetto Piccoli)和罗格斯大学对SOK的启动资金的支持。

作者指出

从属关系

1. 罗格斯大学生物系，315 Penn St.， Camden, NJ, 08102, USA

   Emma W Gachomo, Lyla Jno Baptiste和Simeon O Kotchoni

2. 罗格斯大学计算与整合生物学研究中心，美国新泽西州卡姆登佩恩街315号，08102

   Emma W Gachomo和Simeon O Kotchoni

3. 西澳大学农业研究所，西澳大学，斯特林公路35号，克劳利，珀斯，西澳，6009，澳大利亚

   何塞·C·希门尼斯-洛佩兹

4. 植物生物化学，细胞和分子生物学，Estación实验del Zaidín，科学研究高级委员会(CSIC)，教授Albareda 1，格拉纳达，E-18008，西班牙

   何塞·C·希门尼斯-洛佩兹

相应的作者

对应到Simeon O Kotchoni．

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

SOK构思了这项研究。SOK, jj - l, EWG撰写了这篇论文。SOK, JCJL, EWG, LJ进行了研究。SOK jj - l, EWG，对数据进行分析、讨论和评估。jjj - l, EWG, SOK提供试剂/材料/分析工具。所有的作者都认可了定稿。

Emma W Gachomo和Jose C Jimenez-Lopez对这项工作也做出了同样的贡献。

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