花卉欺骗的演变Epipactis veratrifolia(兰科):从间接防御到授粉

背景

据估计，花卉欺骗已经在至少7500种被子植物中进化出来，其中三分之二是兰花。Epipactis veratrifolia(兰科)是蚜虫拟态的一个模式系统，因为食蚜蝇在花上的假巢上产卵。为了了解花骗的进化生态学，我们研究了花骗的授粉生物学大肠veratrifolia横跨喜马拉雅山东部的10个族群我们重建了Epipactis并将先前研究过的物种的已知授粉系统映射到树上。

结果

的一些花序大肠veratrifolia在它们还在花蕾中就被蚜虫肆虐，以至于一些食蚜蝇的幼虫在花蕾开放时发育到三龄。这表明，成年雌性食蚜蝇产卵在一定程度上受到了奖励。虽然花朵不能分泌花蜜，但它们模仿警报信息素和蚜虫的颜色来吸引雌性食蚜蝇作为它们的独家传粉者。系统发育图谱显示，食蚜蝇的传粉可能是该属的一种祖先条件Epipactis．我们认为蚜虫(猎物)、兰花(初级生产者)和食蚜蝇(捕食者)的生物相互作用可能代表了在欺骗授粉进化过程中互惠共生和欺骗之间的中间阶段大肠veratrifolia。

结论

我们的分析表明，这个中间阶段可以作为一个模型系统来解释产卵(雏址)拟态的起源Epipactis．我们提出假设，一些欺骗性授粉系统直接从早期(部分)互惠系统进化而来，即使失去了奖励(花蜜/孵化地点)，也能保持原始传粉者的忠诚。

大多数开花植物主要依靠动物进行有性繁殖，为它们的花粉载体提供可食用或不可食用的奖励[1- - - - - -3.］．然而，有些“骗人的花”却没有回报。4- - - - - -6］．据估计，欺骗性授粉系统至少存在于7500种现存被子植物中，但这些物种中至少有三分之二属于兰科[4- - - - - -7］．

为了理解花欺骗的进化模式和机制，已经提出了几种假说，包括传粉者认知/感觉偏见的感知利用和花的拟态[5，8- - - - - -11］．最近的研究表明，传粉者对某些视觉和嗅觉线索的感知和偏好比目前提供这些线索的一些被子植物谱系要古老得多[10- - - - - -12]，并且在一个部落或属内，授粉系统在花的欺骗和奖励之间发生了无数次的变化[13- - - - - -15］．hobhahn等人[16]甚至表明，从无奖励到花蜜奖励的转变不一定伴随着可见的形态变化，而只是亚细胞的改变Disa．这些观察对我们理解花卉欺骗的进化模式有很大的帮助;然而，很少有人试图建立花卉欺骗的进化过程，关于这些知识仍然很少。17］．

产卵地点拟态依赖于欺骗寻找产卵地点的雌性昆虫。这种传粉系统在天南星科、马兜铃科、天南星科和兰科等几个不相关的被子植物系中独立进化[18］．通常在腐肉、粪便或真菌子实体上产卵的甲虫和苍蝇被骗到植物上产卵[19］．据估计有11属的欺骗性兰花，包括Epipactis而且Paphiopedilum用这种欺骗方式来开花[8，20.］．

最近的研究结果表明Epipactis veratrifolia通过视觉和嗅觉的花香信号愚弄食蚜蝇[21，22］．Ivri & Dafni [21)表明，唇唇低智处的黑色茧状肿胀与蚜虫相似，而蚜虫很少出现在同一物种的营养器官上。Stökl等。[22发现花的大肠veratrifolia还通过产生α-和β-蒎烯模拟蚜虫警报信息素，β-桃生烯和β-phellandrene。

2009年至2010年在喜马拉雅山东部进行的初步野外调查显示大肠veratrifolia萨尔温江沿岸的花蕾和花期都经常被蚜虫寄生。这些蚜虫的形状和颜色与兰花的花药帽相似。我们还观察到食蚜蝇会访问花朵并除去授粉花粉。(参见支持信息，附加文件1:表S1，附加文件2:图S1A和附加文件3.:图:S2)

使用大肠veratrifolia作为模型，本研究尝试i)定义兰花、蚜虫和掠食性食蚜蝇之间的相互作用;Ii)了解花卉欺骗的演变大肠veratrifolia．

传粉昆虫，卵和幼虫

的花大肠veratrifolia主要是三种雌性食蚜蝇科:Eupeodes corollae，Episyrphus baleatus还有一个未知物种。在114个观察小时内，我们记录129次来访Eupeodes corollae(n = 112次)，Episyrphus baleatus(n = 11)和未知物种(n = 6)．花卉参观高峰通常在15:00至17:00之间。大多数食蚜蝇在其胸背部携带花粉。最重要的传粉者似乎是Eupeodes corollae基于它的相对丰度和携带花粉的个体的高比例。

研究人员共记录了453次食蚜蝇在花间的飞行，包括同一只雌性食蚜蝇多次造访同一花序上的花。超过一半的记录标本Eupeodes corollae携带1-3个传粉昆虫(图1A, B，具体地说，大肠corollae飞向一朵花，盘旋，然后降落在唇瓣的上唇瓣(见附加文件中的上唇瓣)2:图S1B)。我们观察到一些苍蝇在唇瓣低度上的两个透明愈伤组织和黑色愈伤组织上的探测活动(见附加文件中的低度愈伤组织)2:图S1B)。探访行为大肠baleatus是相似的。传粉昆虫向柱头下方的低智体爬行，然后退回，传粉碎片就会转移到接受柱头。退出也会将新鲜的花粉转移到传粉者的背部。

每朵花上食蚜蝇卵的数量在0-13之间。在第一次现场调查(2012年3月7-17日)中，在10个群体中，669个出芽花序中有5个有13个卵(0.74%)。相比之下，在340个开花花序中，有154个(45.3%)总共有314个食蚜蝇卵。在第二次调查(2012年4月11-13日)中，在632个开花花序样本中，有413个(65.3%)发现了食蚜蝇卵，共1190个。三种不同类型的花序的产卵率差异显著(方差分析，F_{2, 1839}= 35.768, p < 0.001;数字2)．开花期3月和4月平均每花序卵数(2.85个/花序)差异不显著(平均2.03个/花序);方差分析,₁₀₄₂= 2.748, p = 0.126)。

我们在所有三个兰花种群中观察到食蚜蝇蛆的三个龄期(图1D、附加文件2:图S1C)，但三龄蛆很少(仅观察到7只)。我们还观察到蛆虫捕食蚜虫(图1D)到三龄时，蛆虫在花序中自由爬行，可能是为了寻找猎物。蛆在三龄后化蛹，但这些蛹掉在地上，我们无法取回它们。

蚜虫的观察

花序，花蕾和花的Epipactis veratrifolia到处都是蚜虫。形态特征和DNA条形码鉴定为Aulacorthum以上。本种在所有10个兰花居群的花序上均有分布．没有翅膀的雌性产下活的幼崽(附加文件)2:图S1C, D)，菌落集中在花蕾和花景上(图S1C, D)1C;额外的文件1:表S2-4)。在开放的花朵上也发现了个别蚜虫(附加文件)2:图S1C和D)，但在植物人状态的植物上没有。

在10个种群中观察到的3种花序的蚜虫侵害频率无显著性差异(方差分析，F_2、22= 0.219, P = 0.805)，其中含花期(10.8%)、3月花期(9.7%)和4月花期(8.9%)。3月开放花与花蕾上蚜虫的发生无显著性差异(F₂₁₂= 0.167, p = 0.683)。与此相反，三种花序的蚜虫数量(F_{2, 18}= 6.058, p = 0.011)。苗期平均蚜虫数为8.85只，3月和4月分别为19.86只和2.24只。

兰花的繁殖系统

袋装对照花不结果。人工授粉的自花和异花坐果率分别为93.2%和100%(表2)1)．2012年开放虫媒花的果座为45.3%±0.232(均数±标准差，741花4709朵)，9个兰花居群间差异显著(F₇₃₃= 5.449, P < 0.001)2)．

花与蚜虫和花蜜的挥发性成分

采用气相色谱-质谱联用技术检测了五种挥发物E。veratrifolia: α-蒎烯(占样品总数的20.76%)、β-蒎烯(10.61%)、柠檬烯(29.86%)、桉油醇(38.75%)和微量的对伞花烯(图3.A).蚜虫表面提取物(答:以上)中含有α-蒎烯(9.23%)、β-蒎烯(25.93%)、对伞花烯(8.9%)、柠檬烯(8.30%)和桉油醇(47.47%)(图3.B)。

在所有的花序样本中都没有发现花蜜，我们也不能用光学显微镜检测到花蜜滴。

生物测定实验和反射率

这种合成气味混合物引发食蝗蝇八次接近萌芽的花序。其中三只苍蝇接触到了芽。相比之下，只有一只苍蝇接近对照花序，并且没有接触(接近，χ²= 9.89, df = 1, P = 0.003)。

花药帽和蚜虫体的光谱峰值均始于500nm(图4)．

植物传粉系统的系统发育结构和进化Epipactis

系统发育分析的组合，三区域DNA序列产生了一个高度分辨率和良好支持的谱系。属Epipactis为单系，有较强的支持(后验概率(PP) = 1.00，自举(BS) = 100)Cephalanthera作为最直接的外群体。部分Arthrochilium是不是过敏性休克了Epipactis深深地嵌套在其中(图5)．部分Epipactis为单系，支持度强(PP = 1.00, BS = 95)， 13个种与大肠purpurata。Epipactis veratrifolia而且e .黄色的(教派。Arthrochilium)形成了自己的分支作为剩下的18种的姐妹群Epipactis．

根据前人对传粉的研究Epipactis和系统发育关系(图5)，祖先重建表明(雌性和/或雄性)食蚜蝇授粉可能是在Epipactis．蚜虫-食蚜蝇传粉系统目前仅局限于类群。Arthrochilium（大肠veratrifolia而且大肠thunbergii)基于对该属的不完整采样。

虽然传粉系统Epipactis黄颜色未知，它是姊妹种吗大肠veratrifolia并分享相同的花卉展示[23］．科中大部分自花授粉(自交配)的种。Epipactis不包括在分子分析中;然而,教派。Epipactis深植于某个教派。Arthrochilium并在Epipactis．我们没有食蚜蝇授粉的样本，大肠gigantea，然而，它被认为在花的特征是相同的大肠royleana［24］．我们认为这三个因素可能对我们的结果影响不大。

传粉者和兰花之间的生物相互作用

在喜马拉雅东部(EH)，兰花、传粉者和寄生虫之间的生物相互作用被细分为两个不同的生命阶段:萌芽期和开花期。在出芽阶段，大量蚜虫侵染一些花序(图1C、附加文件1:表S2)但芽上很少有食蚜蝇蛆。相比之下，在开花阶段，大部分蚜虫被较早孵化的食蚜蝇蛆吃掉后，花序现在被较晚到达的雌性食蚜蝇产卵的新鲜食蚜蝇卵所覆盖。

尽管东喜马拉雅山脉(EH)远离地中海盆地(MB)，大肠veratrifolia在这两个地区都由食蚜蝇传粉。然而，我们观察到这些群体之间的显著差异，包括花奖励类型、自然坐果、传粉者生物相互作用和花挥发物成分(表2)3.)．具体来说，在MB中，花提供少量的花蜜作为奖励，而在EH中，花提供活的蚜虫作为奖励。我们的结果表明大肠veratrifolia在EH中，只能为授粉者的幼虫提供数量下降的蚜虫，因为这些幼虫大多数是在花朵开放后孵化的。在开花的花序上孵化的幼虫很可能是饿死的，因为初生的蛆爬不了很远就能找到蚜虫。因此，在EH中，兰花与食蚜蝇的相互作用在一定程度上是互惠的。

花的模仿

昆虫根据光谱峰的波长差异来辨别颜色[19，25]，越来越多的研究表明，视觉信号可能主导着传粉者在短距离内对花朵的选择[20.，26，27］．我们的研究结果表明大肠veratrifolia花可能模仿两种常见的蚜虫颜色，绿色和黑色(蚜虫的颜色，见http://www.aphidsonworldsplants.info/)，在整个范围内。例如，在以色列，低智力的花大肠veratrifolia有黑色茧状肿胀，被认为是模仿本地的黑蚜虫[21］．反射率和花药帽去除实验结果表明，绿色花药帽也可能模仿绿色蚜虫，因为花药帽的外观与绿色蚜虫相似答:以上在颜色和形状(图1C, D;数字4)．然而，进一步的研究应该证实这一点。

传粉系统的进化Epipactis

祖先重建表明，食蚜蝇传粉的物种是该地区的基础类群Epipactis,大肠veratrifolia而且e .黄色的姐妹组是剩下的吗Epipactis．这表明，包括活蚜虫、掠食性蛆和有翼食蚜蝇在内的授粉系统可能是祖先的Epipactis(图5B)到目前为止，这是唯一的Epipactis在花蕾和花中向传粉者提供活蚜虫的物种，因为蚜虫在MB中不直接参与三营养生物相互作用(表3.)．基于这些结果，我们认为这种三营养相互作用(传粉者/幼虫捕食者-兰花-蚜虫)可能代表了植物-捕食者互惠共生或间接防御之间的中间阶段(见[28- - - - - -30.)，)和花卉欺骗。

我们的研究结果表明，兰花(Epipactis veratrifolia)和它们在喜马拉雅山东部的食蚜蝇传粉者(食蚜蝇)在一定程度上是互惠的。三营养相互作用(传粉者/幼虫捕食者-兰花-蚜虫)可能是内生的Epipactis可能是植物捕食者互惠共生(或间接防御)和植物欺骗之间的一个中间阶段。我们提出了一个假设，一种完全欺骗性的授粉模式可能直接从互惠或部分互惠的系统进化而来，这种系统即使失去了回报，也保持了原始传粉者的忠诚。

研究物种

Epipactis veratrifolia(syn。大肠consimilis)是一种中等大小的陆生地生兰花，分布广泛，从北非经地中海盆地南部向东至喜马拉雅山脉。它的栖息地多种多样，从潮湿的石灰岩土壤到河岸的洪水地带和海拔200-3000米的地方[23，24，31］．它在三月初到五月初开花。每个花序开1-18朵花(平均±标准差，6.9±3.4,n = 53)．花在几天内沿花葶同时开放两到三朵花。

研究地点

我们使用了10个随机分布的人群大肠veratrifolia位于萨尔温江沿岸的洪水区(附加文件)1:表S1，附加文件2:图S1A和附加文件3.:图S2)。在季风季节(7 - 9月)，所有种群都受到河流溢出的影响。

传粉昆虫、卵和幼虫的观察

2011年4月22日至5月5日，在ST和SL点(20个花茎上137朵花)和2012年3月5日至5月20日，在BD、PLD、SYL、JKD和PH点(50个花茎上452朵花)观察了访花者。观测时间共计114小时。我们记录了每个访客的物种、行为(包括产卵)、它访问每一朵花和花序的时间，以及附着在它身上的传粉昆虫的数量。

2011年4月在SL地点和2012年3月在PH和JKD地点对食蚜蝇的第一阶段和第三阶段的幼虫进行了调查，以确定食蚜蝇幼虫是否能够蜕变成蛹。2012年3月23日至4月8日，随机对100朵花蕾进行标记，每2天记录花蕾和开放花朵上蚜虫的存在/缺失情况．

蚜虫的观察

研究了蚜虫的发生情况，以确定哪些种类的蚜虫侵染兰花，以及它们存在的位置(营养部分或花序)。2012年，我们在所有10个种群中记录了蚜虫和食蚜蝇卵的两次频率(第一次调查在3月7日至17日，第二次调查在4月11日至13日)。每个居群的植物被细分为三组:(1)无花序的植物，(2)有花序的植物，(3)有花序的植物，有一个或多个开放的花。我们调查了10个群体中的所有个体，除非每个群体的群体规模超过100株。在这些较大的群体中，我们为每组随机选择100株植物。当我们在4月份对PH和JKD种群进行采样时，恰逢开花季节结束，大多数花序已经停止开花。

鉴定蚜虫和传粉昆虫

昆虫是从植物的花序中采集的大肠veratrifolia然后用乙醚烟雾保存在罐子里。昆虫形态特征鉴定，细胞色素C氧化酶i DNA条形码鉴定。标本保存于中国科学院动物研究所国家动物博物馆。

花蜜集合

花蜜大肠veratrifolia分别于2011年和2012年在SL人群和JKD人群中进行了检查。在花蕾开放前，用尼龙网袋在每个群体中随机装袋10个花序。打开每个花被后，插入1-5 μl校准的微毛细管(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，按压唇瓣并将其推入花被管，抽出花蜜并记录体积。另外四朵花被移除，在解剖显微镜下检查花蜜液滴的存在(尼康，日本)。

挥发性收集和分析

采用动态顶空吸附法于2011年14时在SL群体中野外采集花挥发物。蚜虫挥发物是从蚜虫的花序上采集的。我们将20只无翅蚜虫(1 - 2毫米长，但代表混合生长的龄期)放入装有1毫升戊烷的干净玻璃小瓶中120秒。使用安捷伦7683系列自动液体采样器，在惠普6890系列GC系统与惠普5973质量选择检测器耦合上分析挥发物[32］．(有关收集和分析的详情，请参阅辅助资料)

生物测定实验

2011年4月在SL群体中进行了花药帽去除实验。在一片土地上，9株植物的40朵花在花蕾开放之前就被袋装了。花被打开后，我们用镊子轻轻地取出每个花药帽。袋子被永久移除，暴露在外面进行自然授粉。在同一时期，作为对照，在同一块土地上的9株植物上观察到另外36朵花。

行为实验于2013年3月下旬在PLD人群中进行。所有生物测定均在传粉者活动高峰的15:00 - 16:00进行。我们选择了10个缺乏蚜虫的花蕾花序，属于距离开花植物至少2 m的植物。用先前从顶空样品中鉴定的化合物(51 ng μl)合成的混合物处理这些植物的芽⁻¹(±)α-蒎烯43 ng μl⁻¹(±)β-蒎烯(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)[22］．在每个实验中，在每棵含苞植物的根部放置一个4厘米高的棕色瓶子，里面装有2毫升的合成混合物。用装有等体积戊烷的瓶子作为对照。观察传粉昆虫对不同处理的行为反应20 min，行为记录为:(1)近距离接近(徘徊在距离花蕾不到5厘米的地方，但不接触花蕾)或(2)接触花蕾。

花药帽与蚜虫的光谱反射率分析

2013年4月，使用USB2000光谱仪(Ocean Optics)和紫外可见光纤反射探头(PX2)在距离蚜虫或花药帽表面90°和5mm的位置测量了300 - 700nm范围内的光谱反射率(%)。蚜虫从PLD群体的花序中去除，花药帽也从同一群体的花中去除。蚜虫和花药帽分别进行2个重复。

繁殖系统

采用Dafni等人的受控套袋试验对育种系统进行评价。33］．处理包括人工自花和异花授粉，以及不人工授粉的花(对照，自然自花授粉)。每个处理包括在10株植物上开40朵花。用于异花授粉的花粉来自于至少相距10米的斑块植物。2012年在9个种群中记录了自然结果，但由于2012年的道路建设项目，SYL种群在记录结果之前就被摧毁了。

分子系统发育和进化Epipactis授粉系统

属Epipactis辛。(兰科)主要分布于温带欧亚大陆，少数种为热带非洲和北美洲特有[34］．昆虫传粉的描述Epipactis开始于19世纪^th世纪并延续至今[22，35，36］．属由15-65种组成，并细分为两个部分;教派。Arthrochilium和教派。Epipactis［37］．教派。Epipactis由10-60个种组成。Arthrochilium(包括大肠veratrifolia)含有七至八个物种。Epipactis由于将自交配群体和无精子群体划分为类，被认为是分类学问题。Epipactis［38，39］．欧亚大陆共有20种，其中6种来自于科。Arthrochilium14个来自教派。Epipactis(见支持信息，附加文件1:表S5)为样本。三个样本大肠veratrifolia被包括在内。我们对叶绿体进行了测序:，matK和核ITS标记，并用最简约法和贝叶斯推理进行分析。这些物种的授粉系统，基于出版书籍谷歌Scholar和Web of Science上的文献，参考了使用Mesquite v2.74的最大简约方法映射到树上[21，22，36，40- - - - - -46］．详细的分子系统发育和重建Epipactis血统在支持信息中显示。

统计分析

采用SPSS 16.0 for Windows进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)对天然坐果、蚜虫侵染和食蚜蝇产卵进行分析。生物测定实验采用卡方检验。

双相障碍:

Ben-dan人口/网站

BDQ:

Ben-dan-qiao

BS:

引导

嗯:

东喜马拉雅山脉

截拳道:

Jia-ke-ding

m:

地中海盆地

答:

麻吉

PH值:

Pi-he

骑士:

Pu-la-ding

页:

后验概率

SL:

Shuan-la

SP:

Shan-pa

圣:

Song-ta

西尔维:

Shi-yue-liang。

我们感谢教授们。Amots Dafni, Florian Schiestl和Peter Bernhardt对手稿的批评意见;教授。朱朝东和霍克克协助鉴定食蚜蝇和蚜虫;高晨博士在花卉挥发物分析方面的帮助;李胜科先生、赖阳军先生和周海浪先生在外地提供的协助;项晓国博士和金伟涛先生协助进行系统发育分析;以及赵延辉先生和马晓凯先生在光谱反射率方面的协助。基金项目由国家自然科学基金(No. 31107176)、国家重点基础研究计划(No. 31107176)资助。2014CB954100)、中国科学院科研计划项目(no. 2014CB954100); KJZD-EW-L07).

从属关系

1. 中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京100093

   金晓华，徐松志，李正宇

2. 中国科学院昆明植物研究所东亚植物多样性与生物地理重点实验室，云南昆明650201

   任宗鑫，王宏，李德柱

3. 中国科学院大学，北京100039

   Song-Zhi徐

相应的作者

对应到小华金．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

作者的贡献

XHJ, ZXR, HW和DZL构思并设计了实验。XHJ、SZX和ZXR进行实验。XHJ和ZXR对数据进行了分析。XHJ和ZXR撰写了手稿。HW、DZL、ZYL对草案进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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