多位点聚腺苷酸和对真空型胁迫的转录响应H.⁺-ATP酶亚基A基因在拟南芥蒂利亚纳

背景

真空型H.⁺-ATP酶发挥在植物细胞中的液泡维持稳态的关键作用。V-ATP酶也参与植物的抗环境应力防御。这项研究调查液泡H型的催化亚基的表达和调控⁺-ATP酶拟南芥蒂利亚纳环境应激对该基因产生的多转录物的影响。

结果

证据表明，真空型H的亚基A⁺-ATPase是由单个基因编码的拟南芥。基因组印迹分析显示没有第二个亚基a基因存在的迹象。通过全RNA印迹分析，鉴定出的单个基因在植物的所有器官中转录。亚基A通过对多个cDNA克隆的3'端测序显示为多位点聚腺苷酸化。四个不同的poly (A) tail attachment sites被揭示。通过实验确定亚基A的转录水平对环境胁迫的响应。设计了一种基于PCR的策略来扩增亚基A基因的四个不同的转录本。

结论

从暴露于冷，盐胁迫和光素的幼苗产生的cDNA的扩增表明，真空型H的亚基A的转录水平⁺-ATP酶拟南芥对压力条件有反应。冷和盐胁迫导致所有4个亚基a转录本都增加了2-4倍。黄化导致转录水平轻微增加。所有四种转录本在压力测试条件下表现相同，没有显著差异调节。

液泡-H型⁺- 蛋白酶是负责膜的激励的酶，并通过建立质子和电化学梯度以ATP为代价的抗扫液中的酸化。真空型H⁺- 植物中的蛋白是一种大的多聚体酶络合物，其功能是通过初级主动传输通过膜穿过膜的质子。真空型ATP酶是F型ATP合成酶的同源物，并且可能将高能磷酸盐键的自由能转换为旋转运动[1-9.］．真空型H.⁺- atp酶对真核细胞内稳态的维持至关重要[10.那11.］．

在植物细胞中的V-ATP酶是负责细胞溶胶的脱酸和次级运输过程的跨液泡膜的通电，以及在胞吞和分泌途径[12.］．此外，真空型ATP酶认为主要负责大型中央液泡的酸化和膨胀[12.-15.］．在植物生长发育过程中，中心液泡的成熟和扩张是一个关键事件。成熟时，液泡内容物可占总细胞体积的80%以上[16.］．主要是装满了水，液泡也为各种溶质实现许多重要代谢功能的资料库。的水和代谢物的流入液泡是依赖于在跨液泡膜的质子动力产生部分。

真空型H.⁺- atp酶是由15种或15种以上不同蛋白质组成的500-750 kDa的大型多聚酶复合物。在结构上可分为整数(V_0.）和外围（v₁)膜业[17.］．外周膜扇区位于膜的细胞质侧，并且由至少五种不同的亚基组成，包括催化亚基，亚基A.V₁外围扇区进一步分为头部组和茎区域。V._0.整体扇形嵌在膜中，由至少4个不同的亚单元组成。

H型液泡的A亚基⁺-ATP酶是催化亚单位。的亚单位A蛋白是大约70kDa的研究中大多数生物体，并且是位于头基在V的在亲水性肽₁外围部分中每全酶三份[18.］．此亚基含有一个核苷酸结合基序和功能结合并水解ATP [19.］．此外，子单元A包含位于所述酶的催化中心中的高度保守的半胱氨酸残基可能参与全酶的调节[20.-23.］．V型ATP酶亚单位A的克隆，测序和特征拟南芥蒂利亚纳此前已报道[24.］．

V-ATP酶的小的多基因家族亚基A已知在开花植物和藻类存在。催化亚基存在为两个不同的基因的高度保守的外显子和内含子在12种植物[边界25.］．在开花植物中Daucus Carota.（胡萝卜）存在用于催化亚基的两个不同同种型的证据，其中一个是调色剂特异性的，而另一个是局部化为Golgi [26.］．此外，从棉花(gossypium hirsutum）[27.］．两个亚基A的mRNA在单细胞藻类表达伞藻属臼[28.那29.］．其它V-ATP酶亚基的同种型也可从植物，包括B亚基已知[27.那30.那32]，proteolipid亚基[33-37]及亚单位D及E [38］．

什么是缺乏在我们的空泡型ATP酶的知识是什么样的目的，这些多基因家族蛋白可能在细胞环境服务意识，以及他们如何参与生长，发育，和高等植物的代谢。它已经提出了多基因家族可能会被编码的V-ATP酶亚基功能不同的亚型。这些同种型可能需要的改变微隔间内提供独特的功能或监管限制需要V-ATP酶[26.那27.那34那39那43］．此外，不同同种型可负责用于靶向改变亚细胞区室[10.那26.那28.那36那41那44那47］．此外，基因家族成员可能在环境压力方面可以以差分方式[36］．

三种酶主要负责维持在植物中的调色剂上的质子通量，真空H⁺-ATP酶的H⁺抽运焦磷酸酶(48]和na⁺/H⁺antiporter [49那50］．所有三种酶都涉及允许植物应对环境压力条件。

一些研究试图评估液泡型atp酶在植物应对环境胁迫中的作用。这些努力主要集中在盐和冷压力上。寒冷宽容甘蓝型油菜，近亲拟南芥,响应于2°C的冷却，证明了亚基A mRNA和蛋白质的增加[50］．这种激冷也导致细胞液渗透压和内源ABA的积累随之增加。这些研究人员表示，拟南芥也就是，其显示了相对于V-ATP酶类似的反应冷耐受性植物亚基的mRNA表达，但它们未提供数据。在大米（栽培稻在10°C的低温下，植物的空泡型atp酶活性增加了两倍。51］．这项研究没有分析在分离的膜蛋白水平的变化响应寒心。冷敏感的绿豆苗（豇豆属辐射动物）经受在4℃下冷却48小时，与此相反在显示液泡型ATP酶活性的分离的膜没有增加[52］．此外，这些研究人员发现，v - atp酶蛋白水平在应对低温时没有变化。

兼性CAM植物Mesembryanthemum crystallinum表现出不同器官水平对盐胁迫的反应，但仍参与C_3.光合作用 [53］．在400 mM NaCl处理下，植物根系中A、B亚基和蛋白脂的转录水平增加了约两倍，然后转入景天蓝酸代谢。完全展开的叶子只表现出蛋白脂mRNA的增加，大约是无盐胁迫植物的三倍[54］．细胞悬浮培养在盐胁迫下表现出p型和v型atp酶活性的增加，但蛋白质水平没有随之增加[55］．在V-ATP酶亚基电子商务转录水平Mesembryanthemum crystallinum最近的研究表明，在盐胁迫下的植物中，随着叶片中蛋白质水平的增加，叶中蛋白质含量增加，而根中蛋白质含量没有增加[56］．另一方面，亚基E在大麦芽对盐胁迫的反应显示没有对mRNA水平的影响[57］．上V-ATP酶盐胁迫的影响也被研究了烟草（尼科尼亚塔哈瓦姆）悬浮细胞。经受氯化钠适应的细胞对盐胁迫导致两个质子传输和ATP水解上分离的膜大约增加四倍相比未适应的细胞[58］．值得注意的是，总体v - atp酶活性的增加与液泡膜上酶的数量的明显减少相一致。这一明显矛盾的发现可能是酶本身物理变化或脂质环境变化的结果[58］．特别是混杂的是发现mRNA水平亚基A增加两到四个折响应于盐胁迫的烟草悬浮细胞相同的水平[59］．番茄的实验（Lycopersicon esculentum[相对于亚基a的mRNA诱导相似的结果表明了相对于盐胁迫（盐胁迫）的大约两到四倍的增加[60］．最近在复活植物的工作Tortula Ruralis.表明，蛋白皮（亚基C）的转录物水平响应于盐胁迫而增加，但蛋白质水平没有相应的增加[61］．

在评估V-ATPases在干旱胁迫中的作用方面所做的有限工作提供了相互矛盾的结果。冬季干旱胁迫芸苔栗鸟导致了与冷应激非常相似的反应，即亚基a mRNA的急剧增加[50］．但是，干旱压力Lycopersicon esculentum导致mRNA水平没有明显增加对于亚基A [60］．

前面提到的评估液泡型atp酶在环境胁迫适应中的作用的努力都没有考虑到这样一个事实，即亚基A、B和蛋白脂在所研究的植物中肯定是作为小基因家族存在的。此外，这些基因家族成员可能对压力表现出不同的行为方式。之前发表的关于V-ATPase亚基亚型和应激的唯一工作与蛋白脂基因家族有关拟南芥。我们评估了三个蛋白脂基因对盐胁迫和黄化的反应[36］．所有三种基因响应于盐胁迫（50mm）表现出mRNA水平大约两倍。然而，相对于黄光酸化，两种同种型没有响应，而第三次表现出mRNA水平的增加。

许多在植物基因已经发现含有多个聚（A）附着位点从单个基因产生不同转录物。几个例子近来已经在那里聚腺苷酸化差异的基因有基于糖传感站转录调控成绩单。在大米（栽培稻），从α淀粉酶基因产生的两种转录物，基于蔗糖可用性表现出差异稳定性[65］．细胞壁转化酶基因(INCW-1）在玉米中（Zea Mays.)表达为两个3'端不同的转录本。这两种转录本在对糖的反应中表达不同[66］．在这项研究中，我们探索了V-ATP酶A亚基基因编码的差异聚腺苷酸化转录显示相对于黄化，盐或低温胁迫不同的响应的可能性。

真空型H⁺-ATPase亚基A cDNA已被鉴定并测序(GenBank登录号U65638) [24.］．cDNA经鉴定为H型液泡的A亚基⁺-ATPase通过与来自其它生物体的其它先前测序亚基A基因的身份。主核苷酸和氨基酸序列答:芥亚基A cDNA显示与亚基的高度同一性，该亚单位是从其他生物中测序的cDNA。该cDNA编码具有与其他亚基A基因一致的推定的开放阅读框架，并且被证明具有亚基A共同的所有基序[67］．这种高度的保护在动物、植物、真菌和原生动物等多种类群中都很明显[68］．

基因组印迹分析用于确定基因的数量答:芥与液泡型atp酶A亚基相对应的基因组。基因组DNA被分离出来，经过酶切，固定在带正电的尼龙膜上。进行10次单酶切。用300碱基对进行适度严格的杂交答:芥与液泡型atp酶A亚基对应的cDNA探针。结果表明，10种酶中的9种只能杂交到一个单一的条带(图。1）.这有III digest显示了与第二条带的微弱杂交，后来证实是a有（结果未显示）III位点位于探针的区域。

迄今为止所获得的所有证据未能指示第二V-ATP酶A亚基基因的存在拟南芥。全基因组印迹分析中检测到的单个基因答:芥基因组。源自所有器官的cDNA文库的广泛筛选和植物的多个发育阶段仅显示单个亚基a cDNA。基于聚合酶链反应的屏幕未能检测在其他植物中发现存在的两个亚基之间的内含子长度多态性（结果未显示）[25.］．最后，对GenBank进行了大量的数据库检索拟南芥EST数据库，以及拟南芥基因组计划（TAIR，http://www.arabidopsis.org)只报道了一个单一的亚基a基因在当前版本拟南芥基因组(染色体1 BAC F9K20)。

一个亚基基因的这种情况似乎是不寻常的植物。诚然植物只有一小部分进行了详细的检查。的检查，以日期三个物种仅具有单个亚基的基因检测中，藻类Coleochaete scutata,甜菜 （βvulgarise[63那64]， 和答:芥[25.］．示出为具有至少两个亚单位A基因开花植物包括燕麦（燕麦）， 萝卜 （Daucus Carota.），烟草（尼科尼亚塔哈瓦姆）， 番茄 （Lycopersicon esculentum）， 棉 （gossypium hirsutum),木兰(玉兰virginana），Hydradisis canadensis，藜豆腐，和铁线莲(Clematis LiguisticFolio.）.此外，单细胞藻类伞藻属臼有两个v - atp酶A亚基基因。

通过RNA印迹分析确定A亚基基因在器官水平的表达模式。液泡型atp酶是维持体内平衡的关键的管家酶。因此，预计所有活的植物细胞都需要V-ATPase功能。自答:芥似乎只有一个V-ATPase亚基a的基因，预计该基因应该在所有被检测的器官中表达。全RNA从叶片、螺栓、角果、花、无轴生长的幼苗和无轴生长的根中获得。RNA用乙二醛变性，琼脂糖凝胶电泳分离，并固定在带正电的尼龙膜上。用1700碱基对的地高辛标记的同源cDNA探针进行高强度杂交。与我们的预期一致，结果表明在所有被检测的器官中都有高水平的表达(图。2）在幼苗中存在略高的亚基水平A mRNA。这很可能是因为幼苗是植物测试的最迅速增长和良好的阶段。幼苗正在进行戏剧性和快速的液泡生物发生，以便在这种发育阶段进行快速生长，因此预期将需要比其他更终端分化的器官更高水平的亚基A表达。根，叶子，螺栓和鲜花显示出大约等同的信号量，在一个单独的单位水平稍低。

大多数真核mRNA的特征在于存在聚（a）尾，一系列腺嘌呤残基在与3'未翻译区域上的腺嘌呤残基。聚（a）尾部的主要功能被认为是由一系列聚（a）结合蛋白辅助的消息稳定性[69］．此外，可能需要与5'帽结合的聚（a）尾部来有效地翻译植物mRNA [70］．

液泡H型的亚基A⁺-ATP酶答:芥显示出多位点聚腺苷酸化。对从PRL-2 cDNA文库中分离到的7个独立克隆的3'端进行测序拟南芥EST数据库，可以看到从基于不同的聚（A）尾的附着位点（图1中的单亚基A基因产生的四个不同长度的转录物。3.）.多聚腺苷酸化位是植物的mRNA相当普遍，但这种现象在动物基因罕见[71那72］．自答:芥V-ATPase亚基基因产生了至少4个不同的成绩单(二者都产生相同的蛋白质)和两种开花植物观察到目前为止没有为这个亚基基因家族,实验是为了确定muiti网站聚腺苷酸化可能是一个在植物基因调控机制。

显示V-ATPASE蛋白脂素同种型，表现出响应于环境应力的差异转录物表达水平[36］．这一事实意味着使植物应对压力，这些亚型可能发挥的作用。设计实验，以确定是否在拟南芥，差异上的多腺苷酸化转录物可以响应应力调节。

首先，确认亚基A转录水平在所有环境胁迫条件下都是响应的至关重要。选择3种环境胁迫:100mm NaCl、黄化4天、6℃低温4天。在所有三种无菌情况下，在琼脂上生长7天的幼苗被评估。选择7天龄的幼苗，因为它们生长时间短，空间要求有限，易于培养。此外，它们生长和代谢迅速，能产生大量的A亚基转录本，并拥有包括根、下胚轴和子叶在内的几个器官，这使它们成为分析的一个有吸引力的选择。

使用全RNA印迹分析第一评估子单元A至胁迫条件的总响应。RNA从应力处理的秧苗和未处理的对照植物萃取。如先前所述进行杂交。结果表明一个亚单位A转录响应于压力。在经受盐和冷胁迫苗中检测到转录物水平的近似2-4倍的增加与对照植物相比（图4.）.与对照组相比，光学幼苗显示出基本上等同的亚基亚单位。由于精化导致幼苗的快速伸长，因此预期亚基A信使RNA的伴随增加了蛋白质亚单位mRNA答:芥[36]并且亚单位在快速扩张的棉花中进行消息水平（gossypium hirsutum)纤维73］．用珀金-埃尔默λ -3分光光度计在260 nm处测定吸收，并使用非变性溴化乙酯染色琼脂糖凝胶电泳进行目测(结果未显示)，以评估全RNA的等效负载。

在确定了亚基A转录本的总体水平对环境胁迫条件是有响应的之后，设计了一种试验来检查四个单独的加长转录本对相同胁迫条件的响应。研究的目的是确定这四种人对压力的反应是否存在差异。采用基于PCR的方法来评估四种不同亚基A mrna的转录水平。设计引物对(表1只会放大四份转录本中的一份。这是通过锚定下游引物在poly (A)尾部完成的。上游引物位于A亚基cDNA的编码区。将下游引物锚定在poly (A)尾部，可以防止寡核苷酸在任何其他位置引发，因为18个核苷酸中有10个是5'末端的T'。引物对的设计使4个扩增产物的大小相差约100个碱基对，便于在琼脂糖凝胶和印迹上显示(图)。5.和无花果。6.）.引物对T-11和T-12与转录-1对应，产生579个碱基对的扩增产物。引物对T-21和T-22对应转录-2，扩增455个碱基对的条带。引物T-31和T-32对应于转录-3，扩增362碱基对产物。最后，引物对T-41和T-42与转录-4对应，产生238碱基对扩增产物。转录-4扩增产物是最小的，嵌套在其他三个中，作为探针检测所有四个转录本。这种嵌套是为了避免基于不同探针长度和标记效率的杂交过程中信号的差异。

在进行实际应力分析之前进行了对照实验，以确保引物对只扩增正确的转录本，并且转录-4探针能检测到所有四种扩增产物。从幼苗中提取全RNA，用oligo dT生成cDNA，如材料和方法所述。亚基A转录本从生成的cDNA与适当的引物对扩增并转移到固体载体。以转录-4扩增产物为探针进行高强度杂交。本实验结果表明，所有四对引物只扩增出了一个合适且预期大小的单一条带，并且转录-4探针与所有四种扩增产物充分杂交(图4)。5.）.

亚基的差异表达转录物响应于盐，冷应激和金黄酸层评价。互补的DNA是由七天龄幼苗产生的个体胁迫条件产生。通过使用转录物特异性引物通过RT-PCR评估转录物1-4。将扩增产物固定在固体载体上并与转录物-4扩增产物杂交。该实验的结果表明，所有四个转录物相对于个体应激条件表现相同（图。7.）.与未处理的对照相比，所有四个转录物响应于100mM氯化钠应激而言，大约2-4倍。类似地，在六度下治疗植物4天导致所有四个转录物的信号相似增加。与对照相比，黄光酸盐导致转录物-1，-2和-3的消息水平略高。转录-3的较小程度-3可能是由于信号的近饱和度。后者可能是由于转录物的丰富度较高，或者由于更有效地扩增转录物-3引物组。转录-4似乎表现出比对照植物略低的信号，但自动带显影有些开发。这些结果与整个RNA应激印迹分析一致。表观在转录物中所示的上调性的表观定量差异（图。7.)可能是由于四种不同引物的扩增效率不同，并不一定代表四种转录本的真正差异上调。数据只能在用相同引物进行扩增的样品之间进行定量评估。总之，在三种胁迫条件下，幼苗中未检测到四种亚基A转录本的显著差异调控。

收集到迄今为止的证据表明存在编码真空型H的亚基A的单个基因⁺-ATP酶拟南芥。通过全基因组印迹分析，筛选λ PRL-2 cDNA文库，内含子长度多态性分析，以及广泛的计算机搜索进行额外的A亚基基因的搜索拟南芥表达序列标签数据库，基因库和拟南芥基因组计划。评估迄今为止最开花植物有空泡H型的小的多基因家族编码亚基A⁺腺苷三磷酸酶。小尺寸的答:芥基因组可能表明该植物DNA的流线型化趋势，这可能在进化过程中消除了一个冗余的a亚基基因。亚基A基因和随后的蛋白质高度保守。因此，亚基a基因不太可能因为核苷酸识别度低而逃过筛选。

液泡型三磷酸腺苷酶是所有活的植物细胞可能都需要的管家酶。单一答:芥亚基A基因通过全RNA印迹分析显示在被测植物的所有器官中转录。分析的器官包括根、叶、栓、角果和花。此外，在整个幼苗中发现了较高水平的转录。这些结果支持了一个单一亚基a基因的概念答:芥它被转录到植物的所有细胞中。

文献中存在许多实例[见[14.]和其中的参考文献]在转录物，蛋白或活性空泡H型的水平的变化的⁺- 响应环境压力的情况。这些结果表明了真空型H的潜在作用⁺-ATPase在环境压力期间维持稳态。对暴露于环境压力条件的幼苗进行的整个RNA印迹分析表明亚基A的转录水平响应于盐和冷应激处理。显示转录物水平在用冷和盐胁迫处理的幼苗中增加约2-4倍。黄光酸化物质不会产生显着的转录水平变化作为盐和冷应激。

单液泡H型⁺- atp酶亚基A基因答:芥可以通过使用不同聚腺苷酸化位产生至少四个不同长度的转录物。这些转录物仅在其3' 非翻译区域不同，并且产生相同的蛋白质。在亚基A基因的3'端的调控元件的存在可能是由该蛋白质后转录调控的潜在机制。

然而，聚集在这项工作中的证据表明，落单亚基的基因所产生的四个不同的转录物是不响应于盐，低温，或黄化中无菌生长的幼苗显著差异调节。多聚腺苷酸化位点没有出现是用于液泡H型的亚基A基因表达的转录后控制的机制⁺-ATP酶答:芥对于所测试的应力条件和发育阶段。

植物材料

拟南芥蒂利亚纳从中获得生态型哥伦比亚种子拟南芥生物资源中心，俄亥俄州立大学，俄亥俄州哥伦布市。根据标准方法在4英寸盆中的种子发芽。无菌幼苗，和土壤中生长的植株在23℃下维持在一个生长室中16小时光周期下，直到适当的器官成熟。通过将表面灭菌的种子在含有1％琼脂和4.4克90毫米发芽板制备无菌幼苗培养物/ L MS盐以最小的有机物（Sigma化学公司圣路易斯，MO），pH为6.0。幼苗收获时，7天前。无菌根由Nunc公司方生物测定菜电镀表面灭菌的种子（飞世尔科技，匹兹堡，PA）获得。板被允许在层流罩下干燥，用paraflim密封并如上述垂直孵育。根收获7-14天以后。

通过在含有各种浓度的氯化钠的琼脂上发芽表面灭菌的种子来评价盐胁迫的生长效应。选择评价盐胁迫对V-ATP酶亚单位的影响的最佳浓度为1毫米。较高浓度导致未发生发芽或增长极差。在100毫米盐大多数盐萌发，但需要更多的时间来进行控制。Plantlets的生长但比未治疗的对照（结果未显示）较低。七天生长后收获幼苗。

在黄化胁迫下，表面灭菌的种子在上述光照和温度条件下在琼脂上萌发3天。三天后，在相同的温度条件下，这些板被放置在一个轻密封的盒子里。四天后收割幼苗。植株表现出典型的黄化特征，与光生长对照相比，下胚轴延长，子叶减少。

通过在正常光和温度下制定三天的表面灭菌的种子来评估冷应激。然后将含有幼苗的琼脂平板在6℃下转移到冷室中。在收获之前，在该温度下保持幼苗四天。

核酸的分离

使用MiniPREP协议从成熟叶中提取基因组DNA [74]通过加入CTAB萃取物而修改的[75］．答:芥收获叶子，用手洗涤然后研磨成液氮中的细粉。将研磨材料立即用于DNA提取或储存在-80℃。将后萃取样品在37℃下用RNaseA处理15分钟以除去污染的RNA。

器官特异性全RNA提取按所述进行[75］．特定的器官被采集，并立即在液氮中研磨成细粉。对于角果和花，我们采取了特别的措施，将这些器官直接收获到液氮中，以防止RNA的降解。采取了标准预防措施以消除溶液和玻璃器皿中的核糖核酸污染，包括在200°C下烘烤所有玻璃器皿6小时，用0.1%二乙基焦碳酸酯处理所有溶液(不包括含Tris的溶液)12小时，然后进行高压灭菌。

核酸用分光光度法和通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的检查定量。

基因组印迹分析

基因组DNA (5-10 μg)按生产厂家推荐的酶切方法进行酶切。用含有0.8%琼脂糖的12 cm凝胶电泳对消化DNA进行大小分馏，在IX TAE或TBE中25伏特下运行12小时。根据标准协议对凝胶中分离的DNA进行去嘌呤、变性和中和[76］．DNA转移到带正电的尼龙膜(Hybond N⁺）（Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ）通过使用20x SSC过夜使用20x SSC。将膜在80℃下烘烤1.5小时。

根据来自[的程序进行杂交77]以下修改进行说明。膜首先洗涤，在室温下，在5X SSC 5分钟后1小时/ 65℃下，在1X SSC 0.1％SDS。然后将膜预湿用于在洗涤缓冲液（20mM的Na10分钟₂HPO._4.pH-7.2,1mM EDTA，1％SDS）。在67℃下在67℃下进行预杂交，在密封袋（Dazey Corporation，工业机场，KS）中进行2小时（0.25米₂HPO._4.pH-7.2, 1 mM EDTA, 20% SDS, 0.5%阻断试剂-勃林格曼海姆，生化产品，印第安纳波利斯IN)，体积为125 μl/sq。厘米。最终浓度为25%，15 μg/ml的水煮鲑鱼精子DNA。杂交在67℃密封袋中过夜，加入125 μl/平方厘米新鲜杂交液，其中含有甲酰胺和如上所述的鲑鱼精子DNA，并加入40 ng/ml地高辛标记探针，煮沸5分钟。探针为300碱基对地高辛标记的PCR产物。

在65℃下杂交后洗涤膜30分钟，每次在洗涤缓冲液中剧烈搅拌。然后在室温下在马来酸盐缓冲液（0.1M马来酸，3M NaCl，0.3％Tween 20，pH 8）中浸泡10分钟，然后在室温下在Malate缓冲液中封闭2小时，其中封闭试剂（Boehringer曼海姆，生物化学产品，印第安纳波利斯）。将封端的膜密封在具有125μl/ sq的袋中。厘米。含有0.5％阻断试剂的马来酸盐缓冲液中加入抗石榴素Fab片段抗体（稀释20,000：1）与碱性磷酸酶（Boehringer Mannheim，生物化学产品，印第安纳州）缀合。在室温下在室温下在室温下孵育30分钟后，在室温下在马来酸盐缓冲液中洗涤15分钟。接下来，在底物缓冲液中浸泡膜10分钟（100mM Tris，100mM NaCl，50mM MgCl₂在室温下pH9.5）。然后在室温下在室温下进行孵育10分钟，用CDP-星化学发光的基材（Boehringer Mannheim，生物化学产品，Indianapolis）在底物缓冲液中稀释1：100。然后将膜暴露于X射线膜。

整个RNA印迹分析

RNA经由根据乙二醛使用标准方案[变性琼脂糖凝胶电泳分离76］．之前使用乙二醛通过涡旋在混合床树脂珠（Sigma化学公司圣路易斯，MO），直到pH值大于5。pH值的测定制成使用氢离子pH敏感纸存在（去离子Fisher Scientific公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州）。

在10mM磷酸钠缓冲液中施用的琼脂糖凝胶（0.8％，12cm）在100伏特的用蠕动泵再循环的缓冲液中运行2小时。使用与DNA凝胶相同的程序涂涂rna凝胶，省略了覆盖的去熔，变性和中和步骤。此外，除了以下之外，还使用相同的基因组印迹分析进行杂交和化学发光免疫检出。就在预制在洗涤缓冲液中，预杂交RNA膜在20mM Tris pH8中给予两次甲氧化氨氧化洗涤，每次在65℃下进行20分钟。用于全RNA印迹分析的探针是1700个碱基对PCR产物。

互补DNA的产生

利用MMLV逆转录酶(Gibco BRL Life Technologies, Bethesda, MA)和oligo dT根据厂家说明书完成cDNA的合成。将全RNA稀释至0.67 μg/μl，总体积10-15 μl。样品在90°C下加热5分钟，冰镇。反转录反应混合物包括以下成分，总体积为20 μl。将核苷酸(dNTP’s) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)添加到最终浓度为0.5 mM。加入40单位的核糖核酸酶抑制剂(RNAsin) (Promega, Madison, WI)。加入变性的全RNA (2 μg)，体积为3 μl。Oligo dT引物(1.1 μl)加至1.5 μM。二硫苏糖醇加入至终浓度为10 mM。稀释缓冲液(制造商提供的5X浓度)加入至终浓度为1X。组装完毕后，加入200单位的MMLV逆转录酶(Gibco BRL Life Technologies, Bethesda, MA)。样品在42°C孵育1小时，酶在95°C热变性10分钟。 Samples were stored at -20°C.

聚合酶链反应扩增

一般来说,进行PCR反应体积的50μl 50皮摩尔的底漆,核苷酸的(Amersham淀粉微球的生物技术公司,皮斯卡塔韦,NJ)的最终浓度0.5毫米,1μl模板,1 x PCR缓冲(10 x PCR缓冲包含700毫米三pH值8.8,MgCl 20毫米₂， 1% Triton X-100和0.1% Tween 20)和Taq聚合酶(Perkin-Elmer Inc.， Wellesley MA)按制造商建议稀释。除Taq聚合酶外，其余反应组分组装，95℃加热5分钟。加入聚合酶，PCR在94℃循环1分钟，55℃循环1分钟，72℃循环1.5分钟，循环30次，72℃循环10分钟。

所有用于非放射性检测的地高辛标记探针均使用聚合酶链反应生成。探针使用10X PCR标记混合(勃林格曼海姆，生化产品，印第安纳波利斯IN)，浓度为1X，取代正常的dNTP混合。每种反应均加1 μl模板剂。通过扩增表达序列标签(EST G)上的条带创建模板_5.BG.ydF4y2Ba_3.T._7.)拟南芥表达序列标签数据库[78]，在低熔点琼脂糖凝胶上分离产物，并切除带。再被切除，稀释的带重新扩增以确保PCR的保真度。成功重新扩增后，使用模板进行探针产生。

300碱基对对应于779-1078的核苷酸残基的cDNA探针答:芥液泡H型⁺-ATPase A亚基基因由引物SM-2和SM-3产生(表1)1）.该探针用于全基因组印迹分析。利用引物VA-1和VA-9生成了约1700个碱基对的cDNA探针，对应于A亚基274-1981核苷酸残基。该探针用于多器官RNA印迹分析和应激反应。在这两种情况下，模板都是在EST G中生成的_5.BG.ydF4y2Ba_3.T._7.．两个探针的循环参数与上述那些相同。

加入1 μl (10 mg/ml)或1/50 tRNA沉淀^th糖原的体积（在无菌蒸馏水中10mg / ml）到PCR反应，然后是1/10^th4 M无菌氯化锂体积。加入3体积冰冷无水乙醇，-80℃沉淀30min。DNA在4℃离心15分钟成球。用冰冷70%乙醇洗涤微丸，风干15分钟，在50 μl TE缓冲液/ 0.1% SDS中重悬。探针通过1/10的分馏进行定量^th0.8％琼脂糖凝胶中的体积与已知量相比后III消化的λDNA。探针储存在-20℃直至使用。

四种不同的亚基A转录物使用RT-PCR扩增。引物对设计为具有一个上游编码区的引物，并在转录物的聚（A）尾锚定一条引物。在这四种情况中的模板为1微升苗的cDNA。扩增反应混合物如所描述的，用PCR缓冲液修饰以包含仅1mM氯化镁组装。转录物1使用引物T-11和T-12（表放大1）.采用引物T-21和T-22扩增转录本2。利用引物T-31和T-32对转录本3进行扩增。引物T-41和T-42对转录本4进行扩增。PCR在94℃、退火温度和72℃下分别进行30个循环，分别为1分钟、1分钟和1分钟。扩增转录本1和2的引物在35℃退火，扩增转录本3和4的引物在40℃退火。30次循环后，在72°C下完成底漆延伸10分钟。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上进行分离。

以转录本4扩增产物为模板生成地高辛标记探针，用于a亚基转录本应激反应实验。转录本4扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化，作为探针生成模板。利用转录本4循环参数和引物T-41和T-42生成地高辛标记探针。

本研究使用的所有PCR引物的DNA序列见表1．由转录本特异性引物产生的PCR扩增产物示意图如图所示。6.．

H⁺-ATPase-proton泵送腺苷三磷酸酶：

v - atpase -空泡型质子泵浦腺苷三磷酸酶，est -表达序列标签，pcr -聚合酶链反应，rt - pcr -逆转录酶-聚合酶链反应。

作者希望感谢Shenell Antrobus和Alex Delcampo的优秀技术援助。通过NSF Grant BSR 9020868和康涅狄格大学研究基金会支持这项研究。

隶属关系

1. 美国康涅狄格州哈特福德大学生物学系

   苏格兰人M Magnotta

2. 康涅狄格大学分子与细胞生物学系，美国康涅狄格州斯托尔斯

   约翰·彼得Gogarten

通讯作者

对应到苏格兰人M Magnotta．

重印和权限