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低温、冷冻、干旱和ABA处理对谷物线粒体中脱水样蛋白积累的影响gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

脱氢被称为II组晚期胚胎发生丰富的蛋白质。它们的高亲水性和热稳定性表明它们可以是具有洗涤剂和伴侣样性能的结构稳定剂。它们是核,细胞质和血浆膜的本地化。我们最近发现在一些谷物的线粒体中发现了脱卤素,以应对寒冷。尚不清楚脱氢样蛋白是否在植物线粒体中积聚,以响应于冷应激以外的刺激。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们在冬小麦、黑麦和玉米幼苗的线粒体中发现了五种推测的脱氢酶。其中两种多肽在所有三种物种(63和52 kD)中具有相同的分子质量,并且具有耐热性。干旱、冷冻、低温和外源ABA处理导致黑麦和小麦线粒体中dlp (dehydrin-like protein, dlp) 63kd的积累增加。52kd蛋白由冷适应和ABA诱导产生。这些蛋白在玉米线粒体中有一定的积累,仅在冷暴露后才发现。其他三种蛋白质似乎是热敏的,在所有处理方法中都有轻微的诱导或完全没有诱导。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们发现,不仅寒冷,而且干旱、冷冻和外源ABA处理都会导致植物线粒体中耐高温脱氢酶的积累。大多数耐低温品种(如小麦和黑麦)比低温敏感品种(如玉米)积累更多的热稳定性脱水醇。人们认为它们的功能是稳定细胞膜或基质中的蛋白质。热敏性脱氢酶可能与植物的胁迫反应和适应无关。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物通过生理、形态和代谢过程对逆境条件作出反应。应对许多环境压力的共同因素是细胞脱水。进而诱导脱落酸(ABA)的生物合成。ABA是一种众所周知的胁迫激素,在水分胁迫条件下快速大量积累,参与胁迫信号转导途径[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].脱水和ABA引起溶质浓度(渗透保护剂)的变化,膜流动性和组成的变化,以及一些冷诱导蛋白的诱导,其中许多仍未研究[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

众所周知,在诱导蛋白中,对dehydrins (Group II late embryogenesis abundant (LEA) protein)的研究最为普遍,但对其在细胞中的基本作用知之甚少。它们在包括被子植物、裸子植物、蕨类、苔藓、苔类、藻类和蓝藻在内的光合生物以及一些非光合生物如酵母中进化保守[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].脱水最广泛地研究了干旱和冷应力[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].许多脱氢酶已经在植物中被鉴定为响应外源ABA或不同的胁迫,其中ABA作为调节因子[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].另一方面,某些脱水醇的蛋白质水平仅受低温调节。gydF4y2Ba

特别是对胁迫诱导的五种脱水醇积累的研究gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba其中LTI30和COR47主要是对低温的响应。另外两个蛋白(ERD14和LTI29)的水平被ABA和低温上调,而RAB18只在ABA处理的植物中发现[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].通过干旱、ABA和热胁迫,大麦在冷驯化条件下积累的脱水样蛋白P-80 (80-kD)均未增加P-80水平[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].我们认为,蛋白质在一定胁迫下的积累表明该蛋白的功能专一化,并阐明了其在胁迫反应中的作用。对ABA和某种胁迫(干旱、冰冻、盐等)的反应对了解细胞中脱氢酶的功能具有重要意义。gydF4y2Ba

从一开始,脱醇是亲水的,耐热的,并且有大量的带电氨基酸[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].它们被假设为功能,稳定大规模疏水相互作用,例如膜结构或疏水蛋白的疏水斑块。已经提出了具有大分子极性区域的高度保守的脱氢区域,基本上作为表面活性剂作用,以防止在细胞脱水或低温条件下凝结[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].免疫定位和亚细胞分离结果表明,脱水家族成员存在于细胞核、细胞质和质膜中[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].最近我们发现两种脱氢样蛋白(DLPS)积累在线粒体中gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba(l)(冬小麦),gydF4y2BaSecale cerealegydF4y2Ba(冬季黑麦),并在gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba(玉米)对寒冷的反应[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].我们还证明了两种线粒体dlps的积累与该物种的耐寒性之间的正相关。gydF4y2Ba

本研究的目的是确定dlps是否在植物线粒体中积累,除了冷处理(小麦和黑麦为4°C;ABA是否参与了它们的积累过程。在本研究中,干旱、冷冻、外源ABA处理和低温处理均导致植物线粒体中耐高温dlps含量的增加。最耐低温的小麦和黑麦比玉米积累了更多的热稳定性脱水醇。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

在之前的一项研究中,我们发现在低温处理下,植物线粒体中有两种脱氢酶样蛋白的积累[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].现在,由于凝胶密度降低和增加的蛋白质荷载,即使在控制温度下也发现了五个DLPS(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).我们还重新计算了DLP的相对分子量。如果我们使用由脱氢肽肽阻断的抗体(数据未显示),则对应于所有这些蛋白质的条带非常弱或绝对不存在。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

玉米、小麦和黑麦线粒体冷适应后的脱氢酶样蛋白。对对照(1,3,5)和冷处理(2,4,6)幼苗的线粒体进行超声干扰。玉米(1,2)、黑麦(3,4)和冬小麦(5,6)线粒体蛋白经10% SDS-PAGE(每道25 μg)分离,电印迹于硝化纤维素膜上,用抗脱氢酶抗体检测。在右侧显示了所有物种共有的dlps的分子质量,在左侧对应的带给出了物种特有的dlps的分子质量。gydF4y2Ba

其中两种多肽在所有物种中具有相同的分子质量(63和52 kD)。对耐热组分的分析表明,这些dlps与之前报道的大多数dlps一样[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba[是热稳定的性质(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).同时,其他三个蛋白质似乎并未耐热性的:一个热敏感蛋白质分子质量28 kD注册在所有三个物种和其他两个有类似的,但是稍微不同的群众- 59和58 kD, 57和54 kD, 58和56 kD玉米、黑麦、小麦、分别(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba).发现与脱水相关的免疫蛋白是结构性的和热敏的,这是不寻常的。在现有的文献中,我们只发现了一个相关的参考文献:Li和同事们描述了在岩藻中与脱水相关的蛋白质是结构性的和热敏的[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].有趣的是,来自玉米、小麦和黑麦的三种热敏线粒体dlps也是构成性的。这些蛋白质并不是由所有处理所诱导的(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).基于这一观察,我们得出结论,这些蛋白质不参与胁迫反应和适应。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
figure2gydF4y2Ba

玉米、小麦和黑麦冷适应后的耐热线粒体脱醇样蛋白。蛋白分离和Western blotting与图相同。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.显示dlps的分子质量。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

来自对照(1)、冷冻(2)和干旱(3)胁迫和ABA处理(4)玉米幼苗的线粒体脱氢酶样蛋白。蛋白分离和Western blotting与图相同。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.显示dlps的分子质量。gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
装具gydF4y2Ba

来自对照(1)、冷冻(2)和干旱(3)胁迫和ABA处理(4)冬季黑麦幼苗的线粒体脱氢酶样蛋白。蛋白分离和Western blotting与图相同。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.显示dlps的分子质量。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
figure5gydF4y2Ba

来自对照(1),冷冻(2)和干旱(3)的线粒体脱氢蛋白,胁迫和ABA处理(4)冬小麦幼苗。蛋白分离和Western blotting与图相同。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba.显示dlps的分子质量。gydF4y2Ba

如我们先前所述[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba正如我们在现在的作品中所展示的(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)表明,在冷处理过程中积累了耐高温的DLPS。早些时候,我们使用了基于超声线粒体样本的数据[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].目前,我们不仅研究超声(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),但也有非超声的(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),这使得所有线粒体脱氢酶得以分解,而不仅仅是主要与大片段线粒体或膜弱结合。gydF4y2Ba

对总蛋白(热敏性和热稳定性)的线粒体非超声片段的分析表明,冻干胁迫、ABA处理以及寒冷导致了小麦中dlp63的强烈积累(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和黑麦(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)线粒体,对玉米线粒体无影响(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba).dlp52仅在黑麦和小麦线粒体中通过外源ABA和冷处理诱导产生,在黑麦线粒体中也通过干旱诱导产生。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).同时在热稳定部分中(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba玉米线粒体中这些蛋白的含量也有一定的增加,尽管比黑麦和小麦线粒体的增加程度要小。显然,热稳定蛋白在相同摩尔重量的总蛋白质组分中所占的份额很小。这使得总馏分中热稳定多肽的可视化变得困难。gydF4y2Ba

因此,冷处理和ABA处理均导致黑麦和小麦线粒体中热稳定性dlps的显著积累。dlp63 kD在所有处理中均有积累,而52kd只在冷处理和ABA处理中积累,在干旱处理中也有积累。这表明,与dlp63相比,dlp52在冻干条件下不积累或含量过低,无法探测到某些变化。在任何情况下,这两种热稳定蛋白,特别是dlp63,可能与保护线粒体免受干燥或其他由冷冻引起的压力有关。gydF4y2Ba

如前所述,耐冻品种(黑麦或冬小麦)中耐高温dlps的相对丰度高于玉米[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].同时,基于免疫化学数据进行物种间脱水醇含量的比较应谨慎,因为我们没有估计每个物种的抗体结合亲和力。gydF4y2Ba

外源性ABA的处理提供了ABA参与热稳定DLPS 63和52 KD的一些确认。它再次证实了ABA在植物反应对与脱水相关的胁迫的重要作用,不仅在全植物水平,而且在亚细胞水平。gydF4y2Ba

在研究的所有物种中,冷诱导的耐热线粒体dlps的积累(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)与植物耐低温性的提高相伴而生。这一增长先前已被证实[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].驯化7天后,在-8℃下24 h的成活率从0上升到61%。也有一些论文描述黑麦在2到5的低正温度下的冷驯化[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba].虽然玉米不是耐冻品种,但玉米幼苗可以适应接近生长下限的温度[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].线粒体DLP的积累与植物冷冻机的增加之间的连接表明DLP在高温冷冻剂谷物的耐受状态下的发展中的重要作用。gydF4y2Ba

我们使用的冷冻疗法可能会导致细胞受损甚至因严重脱水而死亡。最近的研究表明,即使是非常敏感的物种,如大豆、烟草、番茄和黄瓜,在冷冻后,冰是细胞外的。只有玉米有胞外和胞内双重损伤[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].在冷冻处理下,黑麦和小麦线粒体中dlp63的增加可能是由于该蛋白在细胞脱水过程中与细胞器快速结合的结果。这表明在冷冻前细胞质中存在这种蛋白。dlp63在玉米线粒体中缺乏积累可能是由于该蛋白在玉米细胞的细胞质中含量低。因此,冬小麦和黑麦等抗冻培养物的线粒体具有与玉米等抗冻敏感物种不同的抗冻机制。gydF4y2Ba

已对不同植物种类在不同处理过程中脱水素的积累进行了研究[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba].与抗冻性相关的脱水醇(WCS120)的积累也在谷类植物上得到证实[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].在小麦和其他谷物中gydF4y2Bawcs120gydF4y2Ba基因家族受低温的协调调控,产生的蛋白质在耐冻成员中大量积累gydF4y2BaPoaceae.gydF4y2Ba.免疫金标记表明WCS120蛋白家族同时定位于冷适应组织的细胞核和细胞质中[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].这些蛋白在细胞核中大量存在表明,它们可能保护或稳定转录机制,使其免于失活[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

另一种lt反应性脱氢酶被识别为WCOR410 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].由于其酸性以及在冷调节脱氢酶WCS120中缺乏富含甘氨酸的重复[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba, WCOR410被认为属于D-11蛋白家族的另一种亚型,即所谓的酸性脱氢酶[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].WCOR 410蛋白家族优先与敏感血管过渡区细胞的质膜相关,在该区域,冷冻诱导脱水可能更为严重。作者(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]提出,这种脱氢酶可能在防止在脱水条件下发生的质膜失稳方面发挥作用。这些结果至少部分地证实了作者先前的假设,即脱水亚型可以在不同的区隔中完成它们的功能[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

我们关于谷物线粒体的脱水的存在和积累的数据,我们的思想也证实了这一假设。线粒体膜对于伴随着冻结温度的伴随细胞进入细胞间隙的水非常可渗透,其随着冷冻温度降低和干旱胁迫增加。脱水可能导致线粒体的损​​伤。显然细胞中存在一些耐受机制,免受脱水对这些细胞器的损伤作用。我们关于冷处理,干旱和冷冻应力下线粒体中热稳定脱氢蛋白的积累的结果假设线粒体DLP应参与冷冻和脱水耐受机制。首先,如前所述,揭示的热稳定脱氢有K区段。已经提出形成具有脂质关联性质的两亲性α-螺旋[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].可能的是,脱氢K段(以及包含该位点的dlps)的作用是与部分变性的线粒体蛋白或膜的疏水相互作用,从而稳定它们。其次,dlps的亲水性非常适合在脱水过程中通过极性相互作用取代水和稳定线粒体膜。gydF4y2Ba

冬小麦和黑麦线粒体中dlps的高积累可能反映了线粒体、细胞和整个植株在脱水和冷冻条件下的稳定性。线粒体dlps作用的靶点尚不清楚。这些蛋白在细胞器中的精确定位及其作用靶点的发现将为了解线粒体dlps的功能提供更多的信息。有关dlp在线粒体中的定位的进一步实验正在进行中。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们发现,不仅寒冷,而且干旱,冷冻和外源ABA处理也会导致植物线粒体中热稳定dlps的积累。耐受性最强的冬小麦和黑麦比玉米积累了更多的热稳定性脱水醇。线粒体中发现的dlps可能具有防止细胞膜不稳定和/或稳定细胞膜或细胞器基质中的蛋白质的功能。外源ABA处理导致黑麦耐高温dlps积累量高,小麦积累量少,玉米无影响。ABA似乎参与了耐低温作物线粒体dlps的诱导。热敏性假定的脱水可能不参与应激反应和适应。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

2日龄黄化苗gydF4y2Ba小麦gydF4y2Ba(冬小麦)和gydF4y2BaSecale cerealegydF4y2Ba(L.)(冬季黑麦)在23°C下生长gydF4y2Ba玉米gydF4y2Ba(L.)(玉米)在27°C下生长。未受胁迫的植物在生长条件下再维持一天。将2日龄小麦和黑麦在4°C的温度下,玉米在10°C的温度下进行冷驯化7天。玉米适应温度的选择是根据14℃驯化后冷敏感玉米品种耐冷性提高的数据,因为该温度接近生长下限[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].由于我们使用的是耐寒玉米品种,幼苗在14°C(数据未显示)下生长得相当快,与对照4天生幼苗不同,所以我们使用10°C进行驯化。驯化7 d后,玉米幼苗无明显坏死或其他损伤。驯化幼苗的长度相当于在27°C下生长4天的幼苗。gydF4y2Ba

在-10°C冷冻15-20分钟,直到三天幼苗表面开始冰结晶。这种严格的治疗使我们能够证明低温/脱水胁迫下dlps与线粒体的关联是如何迅速发生的。在生长条件下,将2日龄幼苗移栽在干滤纸上1天作为干旱胁迫模型。在控制温度下,用含0.1%吐温-20 (Sigma)的1 mM(混合异构体)ABA (Sigma)溶液喷洒2天幼苗,进行ABA处理。这种相当高的ABA浓度已被早期作为耐寒和冷驯化基因的有效诱导剂应用[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].aba处理的幼苗在处理后第二天采收。对照苗和处理苗在相似的生长阶段进行比较。gydF4y2Ba

从幼苗中分离出粗线粒体的方法见[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba然后重悬在含有20 mM MOPS-KOH (pH 7.4)、300 mM蔗糖的缓冲液中。进一步的纯化是在间断的Percoll梯度上进行的,由18%、23%、40% Percoll添加300 mM蔗糖和10 mM MOPS-KOH (pH 7.4) [gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].在Percoll梯度上分层的样品在22,000离心gydF4y2BaggydF4y2BangydF4y2Ba处理45 min后,23/ 40% Percoll层界面处收集纯线粒体。用10 mM MOPS-KOH (pH 7.4)和300 mM蔗糖的洗涤液稀释线粒体,24000离心,从Percoll中纯化线粒体gydF4y2BaggydF4y2BangydF4y2Ba10分钟。线粒体颗粒重悬于洗涤液中,24000离心gydF4y2BaggydF4y2BangydF4y2Ba用细胞色素c氧化酶活性(EC 1.9.3.1)测定线粒体纯度和完整性[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

线粒体在含有1 mM苯甲基磺酰氟的100 mM Tris-HCl (pH 7.6)中超声三次,每次1分钟,以完全破坏。17000时离心沉淀未破坏的线粒体gydF4y2BaggydF4y2BangydF4y2Ba5分钟后丢弃。将上清液分为两部分:(1)部分1煮沸20分钟,分离耐热蛋白;(2)组分2立即进行蛋白质沉淀。从组分1和2中提取的蛋白质用10%三氯乙酸沉淀,用冷丙酮洗涤,并溶解在样品上样缓冲液中进行SDS-PAGE。gydF4y2Ba

或者,将纯化的线粒体溶解在样品加载缓冲液中,用于SDS-PAGE并煮沸3分钟。通过以17,000离心沉淀不溶残留物gydF4y2BaggydF4y2BangydF4y2Ba5分钟后丢弃。gydF4y2Ba

根据ESEN测定样品的蛋白质浓度[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].gydF4y2Ba

根据制造商的说明,使用小型protean PAGE细胞(Bio-Rad)对蛋白进行SDS-PAGE检测。Western blotting和免疫检测是由Timmons和Dunbar描述的[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].蛋白在Towbin缓冲液中从sds -凝胶转移到硝化纤维素膜。在含有脱脂奶粉(5% w/v)和0.1% Tween-20 (Sigma)的Tris-buffer盐水中阻断印迹。然后用抗脱水抗体(1:10 00稀释)孵育印迹(由T. J. Close博士提供)。一抗采用结合碱性磷酸酶(Sigma)和硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐的二抗检测。gydF4y2Ba

所有实验都被复制三到四次。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

dlp:gydF4y2Ba

脱氢样蛋白gydF4y2Ba

李:gydF4y2Ba

胚胎晚期丰富gydF4y2Ba

SDS-PAGE:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。gydF4y2Ba

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确认gydF4y2Ba

该研究由俄罗斯基础研究基础资助(项目02-04-48599和02-04-48728)。我们真诚地感谢T. T. J.博士。接近他已经用脱氢丁抗体和脱氢特异性肽提供了我们。gydF4y2Ba

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博洛夫斯基,g.b.,斯图普尼科娃,静脉注射,安提皮纳,人工智能gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba低温、冷冻、干旱和ABA处理对谷物线粒体中脱水样蛋白积累的影响。gydF4y2BaBMC植物杂志gydF4y2Ba2,gydF4y2Ba5(2002)。https://doi.org/10.1186/1471-2229-2-5gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

  • 冬小麦gydF4y2Ba
  • 低温驯化gydF4y2Ba
  • 耐寒性gydF4y2Ba
  • 胚胎晚期丰富gydF4y2Ba
  • 胚胎发生晚期丰富的蛋白质gydF4y2Ba