研究了一种高效、低维护、同步生长和开花的水培系统拟南芥

背景

拟南芥现在是基因和分子植物研究的模式生物，但生长条件仍然可能损害所开发的实验策略的重要性和可重复性。除了使用植物营养柜，控制植物营养也很关键，可以在水培中实现。这种系统的可用性也将极大地促进有关根系发育的研究。然而，由于其体积小和莲座生长习性，拟南芥很难在标准的水培装置中生长，而且在过去几年描述的系统仍然难以大规模地进行转换。我们的目标是设计和优化一个可升级的设备，可以适应任何实验条件。

结果

设计了一种水培系统拟南芥它由两个单元组成:一个种子架和一个带盖子的1升坦克。原始的含琼脂的种子固定器允许植物从播种到结实期生长，不需要移栽步骤，浪费极小。确定了营养生长的最佳硝态氮供应，并表征了开花对光周期和春化的响应，以表明整个生命周期试验的可行性和重现性。通过分析硝酸还原酶缺乏对发育的影响，说明了该设备是如何克服实验问题的nia1nia2突变体。

结论

本文所述的水培装置可驱动大小均质生长的培养拟南芥植物。它的主要优点是灵活，易于操作，维护快，成本低。它应该适用于许多实验目的。

尽管它在遗传和分子研究方面的优势举世公认，拟南芥仍然难以接受生理分析。它的小尺寸和它的莲座生长习性在某种程度上操纵了植物例体外困难。在具体的实验中，在液体培养基上种植植物将大大促进对矿质营养物质和根系发育的研究。已经设计了几种水培系统拟南芥．在小山et al。［1建立一个系统，该系统的使用仅限于幼苗，其他系统允许完成生命周期[2- - - - - -5］．在大多数情况下，种子播种在浸泡过营养液的岩棉或海绵上(以后称为“种子夹”)。由于洪水泛滥，种子发芽不良，必须大量过量播种。这些种子持有者的另一个缺点是根系部分无法观察或收获。如果水培设备必须连接到空气中以供根部氧化，或者必须消毒以防止藻类污染，那么就会出现更多的技术问题。由于它们的复杂性，这些系统都在较小的规模上使用，而大多数生理分析——或突变筛选——需要大量同步生长的个体。同步性不仅意味着同质生长，还要求控制植物的发育阶段。因此，我们设计了一个大规模的水培系统，可以控制植物向开花的过渡。拟南芥是一种兼性长日(LD-)和春化要求的植物，这意味着“自主”开花可能发生在任何生长条件下，但将被环境依赖的“促进”途径加速[6- - - - - -8］．我们之前已经证明，光周期控制可以被加强到这样的程度拟南芥对单周期诱导治疗有反应[9］．这包括在低光强(LL)下8小时短日照(SDs)下生长春化植株。在土壤上，8周的老植株通过22 h的LD诱导开花，而sd对照植株在播种后3.5个月左右保持营养状态。

本文旨在建立一种简单、廉价、低维护的水培系统拟南芥植物。该方法具有以下几个优点:(1)可以优化和同步植物生长;(ii)可以很容易地监测和控制矿物质营养;(iii)可以不受损害地观察和收获根系;(iv)花的转变可以通过一个或多个诱导周期来诱导。

水培系统的描述

基本实验装置由两个单元组成(图2)。1:(a)种子容器，种子在其上发芽，并在整个培养过程中支持植物生长;(b)种子架在播种后直接安装的液体介质容器。

种子座是装有0.65%琼脂的小塑料圆筒(图。1）.液体介质容器是1升的黑色塑料盒，盖上穿孔的黑色pvc板(图。1 b）.当培养完成后，种子夹的底部浸入营养液中。最初，种子夹被插入容器盖上的孔中，并在底部用一块网片来防止琼脂流出(图。1 c)，本文给出的结果是用该系统得到的。由于这一步是最耗时的，我们最近设计了用模具注射黑色塑料工业生产的一体式种子架(图。1 d）.它们装在一个顶部有领子的圆筒里。圆柱体底部的两个横向延伸部分引导根，部分阻挡种子固定器，从而保留琼脂。

这种水培系统是适合的拟南芥成长的习惯，简单、便宜、需要的维护少。与文献中所述的其他装置相比[2，4，5，其具体优点之一是其本质上支持种子萌发和幼苗生长。0.65%的琼脂被用来填充种子持有者，确保发芽的完全成功，从而避免了“预培养”步骤和植物材料的浪费。此外，琼脂是一种软支撑，允许幼苗根快速生长，以及它们的完整和容易收获。不管生长条件如何，苗根通过琼脂生长通常需要7到10天。

我们系统的另一个新奇之处是可移动的种子架，它允许将单株植物从一个容器转移到另一个容器，使系统高度灵活。这些盖子也可以用来交换工厂批次。

由于溶液容器和盖子都是由黑色塑料制成的，因此可以防止藻类生长;溶液保持清澈，不需要消毒。我们还观察到，正如Arteca & Arteca之前报道的那样，营养液在小槽中不需要曝气[5］．

总之，这些技术优势使该系统可升级到任何规模。一个1升的容器可以种植6到15株植物;我们通常每单位使用8株植物(图。2）.植物密度和生长条件显然决定了储罐多久必须再灌一次水。通过ICP-MS测量离子含量，并检查pH和电导率，我们发现溶液在前4-5周内不需要更新(结果没有显示)，之后取决于生长条件。对于每一个实验，更新溶液的时间将在下面指定。

本实验装置是在研究水稻开花时间调节的大背景下建立的拟南芥．同步植物发育以聚焦生理调查的需要意味着对生长条件的严格控制。基质的质量，即矿质营养，是区分开花时间和生长速度的关键因素之一。因此，在设计了设备之后，下一步是确保生长不受水培系统中的营养物质的限制，并分析开花行为。由于其作为矿物元素的主要作用，我们优化了氮的供应。

氮素供应对8-h SDs环境下植物生长的影响

营养液的成分以霍格兰的配方为基础，大量营养素被稀释了4倍[4］．在220 μM ~ 21 mM NO浓度范围内，研究了5周龄植株对氮供应的生长反应_3.^-．无_3.^-: NH₄⁺比例保持在27:1，从生长第三周开始每周更新营养液。

如图所示3和3 b最大叶数和莲座直径在3.5 ~ 7 mM NO时达到最大值_3.^-．这些参数没有受到氮肥供应的强烈影响，因为叶片产量和莲座生长的最小值和最大值的最大差异分别不超过3个叶片和12 mm。然而，莲座或地上部生物量产量对氮供应的变化反应更剧烈(图。3 c）.在120 μmol.m强光下^－２授予了^－1在3.5 mM NO处理下，枝条生物量产量最高(120 mg)_3.^-在最高的氮供应时减半。在50 μmol.m的弱光下^－２授予了^－1其中，7 mM NO处理的生物量最高_3.^-．在该浓度下，5周龄植株的平均茎生物量为20 mg，平均根生物量为3.8 mg。

由于进一步的试验将涉及在低浓度条件下生长数周，所以7 mM NO最适宜_3.^-，相应的营养液将称为“标准”(表1）.在这些条件下，植物是健康的，有深绿色的叶子和白色的根(见图)。2）.

开花的分析

在8-h SDs中分析了HL和LL下非春化植株的自主开花(图。4 b）.在本试验中，5周后更换营养液，同时按每1 L-container选择6株进行种群减薄。

HL下6周后开始花芽过渡，8周后所有植株均形成可见花芽。LL强烈延迟了这一过程，因为花芽在最早的个体中出现大约10周后。春化(2°C, 6周)将花的转变提前了约10天(图2)。4摄氏度）.注意，所有的植物最终都会开花，即使没有经过春化。

预期的是，在16-h LDs中开花速度要比在8-h SDs中快得多(见图)。2): 4周后，所有植株均已形成花芽(图。4)， HL和LL。在HL下分析了整个生命周期:非春化植物在花蕾开始后约一个月(即播种后两个月)开花，平均每株产生473±45 mg种子(2864±555个种子)。总的来说，生成时间约为2.5个月。

为了诱导同步开花，在8-h SDs / LL中生长的非春化植株在5、6、7或8周后暴露于一个22-h LD(见材料和方法)。结果发现，单一LD从6周龄开始就能诱导全花(数据未显示)。在两个独立的实验中，我们观察到7周老植株的临界光周期约为12 h，而将光周期延长至16 h实际上足以触发整个群体的开花(图2)。5）.这些结果与我们之前对植物开花同步系统的描述是一致的拟南芥在土壤上[9］．然而,水培系统的一个明显的优势是,植物生长得更快:可以实现同步感应与6 -或七周旧non-vernalized植物,而8周古老植物的成花诱导获得了由单个LD在土壤、种子只有在先前进行春化处理了几个星期。因此，水培不仅可以缩短实验时间，还可以分离“一次性”系统中的光周期和春化促进途径。上述结果表明，我们的水培系统满足了同步植物生长的实验需要(图。3.)和发展(图。4）.为了说明水培的一个更具体的应用——即操纵矿物质营养——我们将在这里总结我们的观察结果拟南芥植物在n同化中受损。

硝酸还原酶缺陷突变体的开花

的nia1nia2双突变体包含两个硝酸还原酶结构基因中的每一个突变(NIA)，其残余活度为0.5% [10］．我们研究这一基因型的兴趣在于分析硝酸盐——在突变体中积累的硝酸盐无法减少——是否对开花时间有任何影响。我们观察到,nia1nia2植物在土壤上生长不良，并且褪绿(图。6)，独立于光周期和光强度(数据未显示)。开花也被延迟，在光周期较短的情况下更甚:nia1nia2在8-h的SDs中植株从不开花，在16-h的SDs中植株比野生型多启动10个叶片，在连续光照下表现与野生型几乎相同(表2)2）.

在土壤上生长的春化植株对单一22 h诱导的开花响应也显著降低:而在8周龄的WT植株上获得了充分诱导，只有10周龄植株的13%nia1nia2工厂对LD的回应(表3.）.虽然我们使用了较老的突变体植物，试图弥补其较慢的生长速度，但与野生型相比，暴露于LD时，它们的尺寸仍然减小，这可能解释了它们较低的敏感性。因此，我们无法回答突变体的开花表型是否与硝酸盐积累或副作用有关的问题。在其他实验中，我们尝试每周用10 mM硫酸铵或10 mM硝酸铵浇灌突变体以恢复正常生长，但没有观察到任何显著改善(数据未显示)。相比之下,nia1nia2在我们的水培系统中，使用“标准”营养液(5周后更换一次)，单个LD可以诱导双突变体开花。植物的生长速度仍然不如WT快(图。6)，但与我们在土壤上的测量值相比，差异减小了:在SDs / LL中使用7周后nia1nia2双突变体莲座直径52±6 mm，叶片21±2片;WT莲座直径77±6 mm，叶片27±2片。当通过诱导比野生型晚的突变体来平衡这一生长速率的差异，即在相似大小(莲座直径约60 mm)而不是相同年龄的突变体植株时，几乎恢复了对单个LD的完全花响应:春化nia1nia2SDs / LL培养8周后，单用22 h LD诱导植株完全生长，而WT培养6周后植株完全生长(表2)3.）.由于生长无法在土壤上弥补，本文的结果表明，我们的水培系统将在这一领域取得重大进展。自nia1nia2植物在硝态氮还原方面受到严重损害，其在水培中的健康生长可能与铵态氮的有效性有关。我们确实观察到，双突变体在无铵溶液中生长，生长速度下降，花青素积累，无法对LD作出反应，而WT植株几乎没有表现出任何影响(图。6）.这些实验使我们得出这样的结论:开花依赖于植物利用可用氮的能力，而硝酸盐本身在这一过程中并不起重要作用，因为植物积累硝酸盐的花几乎和WT一样多。

总之，本文描述了一种原始的生长装置拟南芥水产。除了这种培养系统的一般优势，如控制矿质营养和接近根系，我们特别注意技术参数，以确保植物材料的同质性，即成功发芽，同步生长和发育。容器和种子架的设计也灵活，易于设置和低维护的培养，因此，该设备将适用于许多实验目的。

建立文化

将0.5 ml微滤管(VWR International, Overijse, Belgium)的盖子和锥形端剪掉，制备种子固定器。将熔化的0.65%琼脂倒入倒放在纸带上的圆筒中。一旦冷却，种子架可以用塑料包裹，并在4°C保存，直到使用。容器为黑色偏光杯盒(18 × 13 × 6.5 cm，长×宽×高;VariaPack, Leuven, Belgium)覆盖着黑色PVC板穿孔的9毫米直径的孔。播种前，在每个容器中放置1 L营养液，并架起种子座。为防止琼脂在营养液中浸出，将种子夹底部用一块(15 × 40 mm)灰色网片(1 mm)包裹(图1)。1 c)，当两部分一起插入容器盖的孔时，就会粘在上面。播种时，种子悬浮在0.2%的琼脂中，用移液管将种子单独滴在充满琼脂的种子架上。

植物材料和生长条件

种子在湿滤纸和黑暗条件下，2℃分层5天或2℃春化6周后，植株拟南芥(Columbia)在8-h SDs或16-h LDs中生长。光子通量密度为120 (HL)或50 μmol.m^－２授予了^－1极高输出荧光管;温度为20°C。相对湿度是发芽和育苗成功的关键，最理想的湿度设置为70%。

开花反应

在解剖显微镜下定期观察，在8-h SDs和16-h LDs中记录开花时间。当至少有一个花蕾在顶端可见时，一个植物被记录为“花的”，并计算每批检查的开花植物的“%”。

为了分析单周期处理对开花的响应，在暴露于单一22 h LD前，在LL下8-h SDs中培养植株5、6、7或8周[9］．以7周龄植株为研究对象，对不同光照时间下的花响应进行了深入研究。这允许建立“感应曲线”，从而确定感应LD或“临界光周期”的最小持续时间[11］．在同步诱导开花的实验中，在光周期处理18天后，通过在解剖显微镜下解剖植物，评估开花植物的“%”来评价花的反应。

霍奇金淋巴瘤:

高亮度

摘要:

电感耦合等离子体质谱法

LD:

漫长的一天

噢,

低光

SD:

短暂的一天

WT:

野生型

L.C.感谢F.N.R.S.和P.T.向F.R.I.A.颁发研究奖学金。这项研究得到了欧洲共同体合同BI04 CT97-2231的资助;大学间吸引极点方案(比利时国家首相办公室-联邦科学、技术和文化事务办公室;P4/15);the Action de Recherches Concertées' 98/03-219和University of Liège (Fonds Spéciaux)。我们感谢S. Melzer博士对手稿的批判性阅读。我们要感谢A. Schmitz和D. Libion对这些植物的照顾。

作者指出

从属关系

1. Liège大学生命科学系植物生理学实验室，Sart Tilman B22, Liège, B4000

   Pierre Tocquin, Laurent Corbesier, Andrée Havelange, Alexandra Pieltain, Emile Kurtem, Georges Bernier和Claire Périlleux

相应的作者

对应到皮埃尔Tocquin．

作者的贡献

PT设计了种子架，参与了系统的搭建，并进行了生长分析。LC参与了体系的建立，并进行了硝酸还原酶突变体和开花时间的实验。AH参与植物培养监测。AP参与了系统的建立，并参与了EK对生长设备的维护。英国政府是资助这项工作的研究项目的发起人。CP是欧盟委员会和Liège大学资助的项目的共同发起人，监督了这项研究并起草了手稿。

所有作者阅读并批准了最终的手稿。

皮埃尔·托克昆，洛朗·柯贝西耶对这部作品贡献同样大。

再版和权限