BTH处理后黄瓜系统获得抗性激活基因对应cdna的克隆与表达分析

背景

坏死性植物病原体的感染可导致一系列复杂的造成病原体生长和扩散的限制防御反应的快速和本地化的诱导。随后，针对广谱病原体的增加植物抗性的是全身观察。这种植物的免疫力被称为系统获得性抗性。为了鉴定转导途径的组分，我们克隆并分析了几种mRNA的系统获得性抗性诱导后累积在黄瓜植物的表达模式。

结果

以黄瓜为试材，对已知的诱导系统获得性抗性的化合物进行了试验。其中，BTH(苯并(1,2,3)噻二唑-7-碳硫酸s -甲酯)被证明是非常有效的。采用mRNA RT-PCR差异显示技术，对10 μM BTH处理黄瓜植株24 h后诱导的mRNA序列进行鉴定。对喷施10 μM BTH的黄瓜植株进行cDNA文库筛选，获得相应的全长cDNA。在这些被鉴定的cdna中，有一种推测为ras相关的gtp结合蛋白，推测为beta-1,4-N- 乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶III和推定的致病性相关蛋白。通过BTH或感染植物治疗的植物中的Northern印迹分析了三种相应MRNA的积累时间过程炭疽菌lagenarium．

结论

利用mRNA - RT-PCR差异显示技术，鉴定出3个可能参与黄瓜系统获得性抗性的基因。致病相关蛋白被认为参与了植物对病原体的防御。GTP-binding蛋白质和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III是哺乳动物和植物信号转导通路的组成部分。

坏死病原体侵染植物可诱导一系列复杂的防御反应，从而限制病原体的生长和传播。受感染的叶片产生超敏反应(HR)，即在病原体侵入部位发生快速、局部的细胞死亡[1］．伴随HR的是水杨酸和几种致病相关(PR)蛋白的积累，其中许多表现出抗菌活性[2］．随后，针对广谱病原体的植物防御能力的增强是观察。这种耐药性局部表达以及在远端，未感染的组织中，能持续几周到几个月。它被称为系统获得性抗性（SAR）的[3.］．

水杨酸是合成孔径雷达信号转导中的重要信号。研究表明，在黄瓜SAR发病期间，它会积累[4.),烟草(5.]， 和拟南芥[6.］．外源供应的水杨酸诱导相同组基因和抗病原体的相同频谱，与病原体诱导的SAR [3.］．通过过度表达细菌水杨酸羟化酶基因来阻止水杨酸积累的植物不能产生SAR和/或表现出对病原体感染的敏感性增加[7.那8.］．

分析答:芥突变体揭示了NPR1蛋白(也称为NIM1)是SAR诱导所必需的，并在SAR途径的水杨酸下游起作用。携带该基因突变的植物无法表达几种基因公关基因和显示增强的对感染的易感性[9.那10］．NPR1/NIM1蛋白与TGA/OBF家族的碱性亮氨酸拉链转录因子相互作用。其中一些因子已被证明与水杨酸响应启动子元件结合PR-1基因[11-13］．诱导用TGA因素NPR1的相互作用水杨酸在细胞核中被局部化[14]，而细胞质NPR1看来像是调节水杨酸 - 和茉莉酮酸酯依赖性防御途径之间的串扰[15］．水杨酸信号通路的其他成分已经在拟南芥[16］．它们包括PAD4和EDS3激活EDS4, SID2和EDS5导致水杨酸积累[17］．

除病原体外，外源化学物质也能诱导合成孔径雷达。除水杨酸外，著名的化学诱导剂公关基因包括2,6-二氯异烟酸(INA)、苯并(1,2,3)噻二唑-7-碳硫酸s -甲酯(BTH)和L-α-氨基丁酸(ABA) [18-23］．合成孔径雷达的诱导似乎是由一个复杂的信号转导过程控制的[24它包括一个源自感染或治疗部位的信号，并在整个植物中传播。化学诱导剂为剖析调控防御反应的信号转导通路提供了工具(它们在不同的点进入通路)。另一方面，黄瓜植株为研究诱导抗病提供了一个很好的模型系统[25］．几丁质酶和/或过氧化物酶活性在接种坏死性病原体或SA、INA和BTH治疗反应中已观察到局部和全身升高[26-28］．

本研究的目的是鉴定和克隆黄瓜植株中SAR诱导后积累的mrna。这些序列可能与导致SAR的信号转导通路中可能涉及的蛋白质或负责抗性状态的蛋白质相对应。在第一组实验中，为了建立一个可重复的黄瓜抗SAR激活系统，对可能的合成孔径雷达诱导化学物质进行了测试。mRNA RT-PCR差异显示法[29]用于识别在SAR诱导过程中被激活的基因。鉴定了几个差异表达的cDNA，并对其中一些进行了克隆和测序。用Northern blotting分析其表达。

黄瓜的化学诱导抗性

SAR诱导不同化学品的活性已经在一种或几种植物物种中进行了记载[18-23］．为了评估它们对黄瓜的活性，用0.5mM水杨酸，50mM L-α-氨基丁酸，0.78mm 2-Thiouracil，1mM硫胺素或20mM bacl，渗透了两周龄植物的子叶。₂．用水渗透控制植物。在一个平行的实验中，用5mm水杨酸，50mM L-α-氨基丁酸，0.78mm 2-Thiouracil，1mM硫胺素，20mM Bacl喷洒四周的黄瓜植物（具有两种真实的叶子）（具有两种真实的叶子）。₂或1mm BTH。对对照植物喷水或不予处理。分别从处理6 h、24 h和48 h的叶片中提取总rna。感应的PR-8基因通过Northern印迹，随后用黄瓜PR-8的cDNA探针杂交检测。PR-8黄瓜基因编码一种酸性几丁质酶，该酶在烟草坏死病毒(TNV)感染或水杨酸诱导后积累，被认为是一种SAR分子标记[30.］．

在渗透实验中(未显示结果)，对照植株显示阳性杂交信号。来检查是否激活PR-8基因可能是在渗透过程中造成的伤害，仅从中脉到子叶外缘进行切口评价。创伤后获得强烈的信号，这可以解释为酸性几丁质酶本身或异构体的诱导。因此，渗透法在黄瓜中应用SAR诱导剂并不是一种合适的方法，因为它可能会引起伤害反应。

喷施时，BTH、L-α-氨基丁酸和2-硫氧嘧啶对PR-8 mRNA的积累有较强的诱导作用，而SA处理诱导水平较低(图2)。1）.硫胺素和BaCl₂诱导略PR-8表达式(结果未显示)。对照植株的RNA未显示杂交信号，表明喷药本身没有诱导作用PR-8表达。BTH，这是水杨酸的类似物，显示出最强的PR-8就职。但用1mM BTH处理的黄瓜植物表现出降低的生长（叶较小面积和更短的节）。如BTH被证明是抗病性的在不同的植物物种[一种非常有效的活化剂20.-23]，我们尝试在低BTH浓度(10 μM、30 μM和100 μM)的黄瓜植株中诱导SAR。PR-8转录本的积累在三种浓度下相当相似(见额外的文件1)，对植物生长无不良影响。

在黄瓜中，SAR已被证明是对由此引起的炭疽病有效炭疽菌lagenarium研究表明，水杨酸处理可以诱导对这种病原体的抗性[31］．为了证实BTH对黄瓜SAR的化学诱导剂作用，在黄瓜第二真叶接种前5天，用10 μM BTH、50 μM BTH水喷施或不处理c . lagenarium．接种两周后，对植株进行皮损扩散评分，即皮损面积大于最初接种面积。如图所示2和表1， BTH治疗可减轻症状。对照叶接种c . lagenarium显示大的扩散病变，因此广泛的真菌生长。以前用BTH处理植物c . lagenarium接种导致病变形成明显减少(图。2）.在未处理植物和水处理植物中，分别有67%和64%的接种点出现播散性病变(见表2)1）.在BTH处理的植物中，只有23% (10 μM BTH)或9% (50 μM BTH)接种部位发生了播散性病变(见表2)1）.

要检查BTH是否能够全身起作用或通过黄瓜植物，四周龄的植物的第三片叶子包裹用塑料薄膜和所述植物喷雾用H运₂O、10 μM BTH、50 μM BTH或不处理。这片叶子被接种了c . lagenarium7天之后。第三片叶上由病原体激发的未处理或H₂O处理黄瓜植株(染病对照)的死亡率分别为86%和83.5%。在BTH处理的植物中，38% (10 μM BTH)或12% (50 μM BTH)接种部位发生播散性病变(见表2)2）.这些结果表明BTH可以激活未处理的叶子中的抗性。

BTH诱导黄瓜植株中基因的差异表达

用10 μM BTH或水喷施。处理24小时后取样，以指出早期诱导的基因表达差异。RT-PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离。仅从BTH处理过的植物或仅从水处理过的植物中显示的RNA条带可能与差异表达的mrna相对应。鉴定出12条差异表达条带3.）.它们的大小在250到450 bp之间。它们与在BTH处理过的植株中表达的基因相对应，而在对照植株中不存在，或者在BTH处理过的植株中比对照植株表达更高(图1)。3.）.这些条带从凝胶中分离，PCR扩增并在pGEM-T载体中克隆。为了确认这些基因的差异表达，我们进行了反向槽杂交:从每个差异显示条带中获得4 ~ 10个克隆的DNA固定在膜上，与BTH或H相应的反转录产物杂交₂O处理植物(图。4.）.12个片段中有6个被确认为差异表达:dd3、dd4、dd5、dd6、dd7和dd11。在BTH和H之间有5个谱带(dd1、dd8、dd9、dd10和dd12)表达均匀₂O处理的植物(差异显示假阳性或被同源基因表达掩盖的信号)。在其余情况下(dd2)，槽位上看不到信号。这种杂交信号的缺乏可能是由于槽杂交程序的敏感性不足。

对dd3、dd4、dd5、dd6、dd7和dd11 cDNA片段进行测序。Blast分析未导致与已知序列的任何同源性的鉴定。这并不奇怪，因为mRNA差异显示生成的片段与3'非翻译区域相对应，同源性很难找到。6个片段中有2个片段属于同一基因(dd5和dd7)。以喷施10 μM BTH的黄瓜植株(处理24 h后取叶片)为材料，构建cDNA文库。图书馆通过五个不同表达片段进行筛选。其中四个探针(分别对应dd3、dd4、dd6和dd11)获得命中。获得dd4、dd6、dd11对应的全长cdna。克隆cDNA与数据库中序列的同源性见表4.．将cDNA DD3匹配到从推定的RAS相关的GTP结合蛋白答:芥．它将被称为CRG(黄瓜ras相关gtp结合蛋白)。cDNA dd4与翻译释放因子2匹配。它被称为CTR(黄瓜翻译释放因子2)。cDNA dd6与假定的β-1,4-相匹配N-Acetylglucosaminyltranferase三世从答:芥．该蛋白被命名为CGT (cucumber acetylglucosaminyltransferase III)答:芥并且，具有略少的同源性，从大麦由真菌感染引起的发病机理相关蛋白〔32］．这将被称为CPR（黄瓜致病相关蛋白）。

PR-8那心肺复苏那中国中铁和资本利得表达分析

研究…的表达PR-8那心肺复苏那中国中铁和CGT用10 μM BTH喷施4周龄植株的2个初叶。在另一批植物中，第一片叶子被接种了c . lagenarium．处理后，在处理后从处理的叶片或上未治疗的叶片中提取总RNA。通过Northern印迹测定PR-8，CPR，CRG和CGT mRNA的累积，然后用相应的cDNA探针杂交（图。5.）.

的表达PR-810 μM BTH喷药和10 μM BTH喷药均能诱导高水平的基因表达c . lagenarium在提交治疗的叶子中感染。在BTH申请后，在72小时后，可以在5小时内检测到PR-8 mRNA，并且在72小时后可以观察到最大的表达。PR-8观察到来自72小时表达接种后c . lagenarium．无显著PR-8基因的积累可以从BTH未处理的叶子被检测喷洒的植物，而在非受感染的叶子PR-8感染72 h后观察表达c . lagenarium;表达水平仍然在2周后仍然增加c . lagenarium接种。

心肺复苏10 μM BTH处理和10 μM BTH处理均能诱导基因表达c . lagenarium接种叶。CPR mRNA在应用BTH后5 h即可检测到，24 h后可检测到最大表达量。心肺复苏感染72 h后观察表达c . lagenarium．没有表情的心肺复苏基因在未处理叶中观察到从BTH喷雾的植物，而CPR的mRNA积累可在未感染的叶子中检测c . lagenarium感染的植物接种后72小时。

CGT基因显示出显着的基础表达水平，因为它可以在对照植物中观察到（图。5.）.然而CGT喷施10 μM BTH (24 h最大)和接种c . lagenarium（在72小时的最大）在提交处理的叶子。系统性感应也可以在未经处理的叶中观察到c . lagenarium接种的植物（如从感染后72小时）。

的表达式级别中国中铁基因太低，使我们能够显示表达的诱导（数据未显示）。

对相同基因在伤后黄瓜植株中的表达进行了分析。从第一片叶子的中脉切到外缘。分别在伤后24和48 h，从切下的叶片或上部叶片中提取总RNA。表达的归纳PR-8和心肺复苏基因仅在伤后24小时在切叶中观察到。在未切下的上部叶中也未观察到表达。的CGT和中国中铁（结果未显示）基因没有诱导伤人。

分析了这些基因在根际细菌诱导的黄瓜植株中表达情况。植物生长在浸透了a恶臭假单胞菌BTP1悬浮液，一种植物促生菌，已知可促进黄瓜诱导系统抗性[33］．总RNA从播种三周后收集子叶提取。PR-8那心肺复苏那CGT和中国中铁在这些条件下没有显示任何诱导表达(结果未显示)。

在这里，我们测试了两种不同的技术和几种化合物诱导SAR黄瓜。的表达PR-8该基因编码一种来自黄瓜的酸性几丁质酶，被用作防御反应激活的指标。这种酸性几丁质酶在烟草坏死病毒感染或水杨酸诱导后的积累与诱导抗性相关[30.］．在测试的不同化合物中，通过喷雾施加的BTH被证明是PR-8 mRNA积累的较强的诱导剂。喷洒在10μm的浓度下的Bth仍然能够诱导PR-8基因的表达。通过攻毒试验证实了BTH对黄瓜的保护作用c . lagenarium．用Bth（10μm或50μm）喷洒黄瓜植物允许有效的本地和全身保护c . lagenarium．BTH最近被诺华公司的科学家鉴定为一种安全、可靠、无植物毒性的植物保护剂。烟草外源施用BTH答:芥，小麦和黄瓜已被证明能激活许多SAR相关基因，从而增强植物对各种病原体的保护[20.-22那28］．

鉴定合成孔径雷达信号诱导基因可为阐明植物防御反应的信号转导途径提供线索。利用RT-PCR差异显示技术对黄瓜进行了SAR相关mrna的检测。我们已经鉴定了4个bth诱导基因:一个可能的ras相关GTP结合蛋白(CRG)，一个可能的翻译释放因子2 (CTR)，一个可能的β-1,4-N- 乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶III（CGT）和推定的致病性相关蛋白（CPR）。的表达PR-8那心肺复苏和CGT基因被证明是由10μMBTH处理以及感应c . lagenarium感染。对BTH的反应(治疗后5 h)比接种病原菌(感染后72 h)更早。然而，这些基因的系统表达仅在c . lagenarium受感染的植物。

小的gtp结合蛋白形成一个核苷酸三磷酸酶家族，其活性与三磷酸鸟苷的结合、水解和释放有关[34］．MAP激酶级联是大多数细胞中RAS的重要下游效应通路[35]，最近的研究表明，植物在应对病原体的攻击和伤害时，MAP激酶被激活[36那37］．小GTP结合蛋白已经显示参与像细胞分裂，穿过质膜，内吞作用和胞吐外部信号的转导，在植物细胞死亡和建立植物防御反应的[重要的细胞机制34那38-42］．β1,4 -N- 乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶III催化添加N-乙酰氨基葡萄糖转化为β甘露糖苷N-聚糖，从而抑制进一步加工和伸长。在哺乳动物中,N-acetylglucosaminyltransferase III表达与分化，细胞粘附和肿瘤进展有关[43那44］．它最近被示出为具有表皮生长因子信号和H干涉₂O.₂-诱导活化蛋白激酶C [45那46］．N-链接聚糖在植物中广泛分布，并在细胞表面高表达，这可能表明在细胞/细胞通讯中具有推定的功能[47］．据我们所知β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶从来没有在植物-病原体相互作用的背景下被描述。参与复合物生物合成的几种cdna或基因编码酶N- 连接聚糖都已从植物中克隆的。它们包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I cdna答:芥、马铃薯及烟草[48]，N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II cDNA答:芥[49]和番茄防御相关糖基转移酶基因[50］．GTP-binding蛋白质和N-乙酰氨基葡萄糖转移酶参与了重要的机制，特别是信号通路，因此似乎非常有趣。推测的PR蛋白，在真菌感染后首次在大麦中发现[32]还没有已知功能。

仅有的PR-8和心肺复苏基因是由伤害而非系统诱导的。PR-8和心肺复苏基因没有诱导P. Pivida.BTP1治疗，这触发器诱导黄瓜系统抗性（ISR）。ISR是表型相似于SAR但被示出该电阻的机理是不同的：虽然这不是用测试P. Pivida.BTP1，在ISR被证明是依赖于NPR / NIM1的功能，但不涉及水杨酸等实验系统中，也没有PR蛋白的积累[51］．我们的试验结果与那些Pieterse等人。谁发现，引起全身性的答:芥是独立的公关基因表达(51］．同样，ISR似乎也是独立的CGT和中国中铁表达，因为这些基因不是由P. Pivida.BTP1。

在黄瓜上试验的不同SAR诱导剂中，BTH是非常有效的。BTH可以诱导PR-8 mRNA的积累，并对其进行有效的局部和系统保护c . lagenarium．使用RT-PCR差异显示，我们确定了四个BTH诱导型基因，包括推定的RAS-GTP相关结合蛋白（CRG），翻译释放因子2（CTR），推定的β-1,4-N- 乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶III（CGT）和推定的致病性相关蛋白（CPR）。基因表达研究证实了局部诱导CGT和心肺复苏经过BTH治疗或c . lagenarium感染和全身诱导反应c . lagenarium感染。此外心肺复苏是由局部创伤引起的。表达的显著水平CGT和心肺复苏在防御反应的基因提出了基因产品在SAR途径或在黄瓜性状态的潜在作用。

生物和生长条件

黄瓜植物(Cucumis sativus简历。市场营销人员)在22°C、16 h光周期的堆肥中生长。

的文化炭疽菌lagenarium在25°C麦芽琼脂上保存。在培养皿中培养4 ~ 6周，在添加0.01%吐温80的水中制备孢子悬浮液。用粗棉布过滤悬浮液，用血球计测定孢子浓度。

化学治疗

除BTH(诺华提供)外，所有化学品均来自Sigma。化学物质溶解在水中，除硫胺、BaCl外，用NaOH调整pH至6.6₂和蓝芽。渗透实验:将两周植株的子叶通过叶脉渗透，直到整个叶片浸透该溶液。喷施试验:在4周龄黄瓜植株的2片真叶上喷施+/- 3ml溶液/株。当进行系统阻力测试时，上面的叶子用塑料片保护起来。

ISR诱导

在播种前，消毒后的黄瓜种子在a中浸泡10分钟恶臭假单胞菌BTP1悬挂(4.10^8.CFU / ml，在0.85％NaCl）中。对照种子在0.85％NaCl中浸泡。黄瓜种子在含有无菌盆栽土10厘米-盆中预先用混合P. Pivida.BTP1接种至终浓度为3.10^7.CFU / g或具有相同体积的对照植物的无菌水。黄瓜在25℃下萌发，具有16小时光光周周期。播种后六和12天，10毫升细菌悬浮液10^8.CFU/ml作为淋湿剂加到根上。用20 ml 0.85%的NaCl浇灌对照植株。

c . lagenarium感染

植物在感染试验前48小时被置于潮湿的室内。第一个真叶接种10滴(10 μl)的分生孢子悬浮液c . lagenarium（10.^6.孢子/ ml）。在挑战实验中，在第二叶或第三叶的化学处理后进行接种5（或7天）。

植物RNA提取与分析

采用苯酚/SDS法从黄瓜叶片(每个处理5株)中提取总RNA [52］．琼脂糖-甲醛凝胶电泳分离RNA的Northern杂交[52]用α-³²P PR-8，CPR，CGT或CRG cDNA探针（随机灌注DNA标记试剂盒，Roche）。

信使rna微分显示

使用Eurogentec(比利时)的差异显示试剂盒并按照供应商的说明进行mRNA差异显示。PCR产物用α-标记³⁵小号的dATP，分离通过电泳在变性6％聚丙烯酰胺凝胶并可视化通过放射自显影。表示差异显示条带PCR反应，以减少假阳性的数量在两个不同的RNA样品重复两次。

克隆和测序

在30分钟内用100 μl H洗脱差异条带₂o在10分钟内沸腾，然后沉淀并悬浮在10μlH₂O.对4 μl的DNA进行第二次PCR扩增，与差异显示本身的方法相同。产物在pGEM-T载体(Promega)中克隆，采用双脱氧测序方法进行人工测序。使用GCG软件包(Blastall, Fasta)搜索可用的公共数据库(即EMBL)与我们的序列的同源性。

狭线印迹杂交

按照供应商(Hoefer)的说明，使用过滤歧管将PCR扩增的DNA从每个差异显示条带的4到10个克隆上印迹在带正电的尼龙膜上。印迹与³²32 P标记的，RT-PCR对应从任一BTH或H产品₂O治疗植物。

cDNA文库构建和筛选

用来自Promega的PolyatractmRNA分离系统III纯化来自10μmbth（24小时的叶片的黄瓜植物MRNA。通过底漆延伸，使用来自CLONTECH的CLONTECH的智能CDNA文库建筑套件进行CDNA文库。图书馆被筛选³²P标记的cDNA探针。cDNA测序在法国Genome Express进行。使用GCG软件包(Blastall, Fasta)搜索可用的公共数据库(即EMBL)与我们的序列的同源性。

国家科学研究基金(FNRS, Belgium)项目(Program FRFC n°2.4.570.00)资助。

从属关系

1. Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Biotechnologie Végétales, Département des Sciences de la Vie, B22, Université de Liège, B-4000, Liège/萨特蒂尔曼，比利时

   凯瑟琳·博维和雅克·多姆斯

2. 农业科学大学，B-5030，比利时，Gembloux

   马克Ongena与菲利普Thonart

相应的作者

对应于雅克Dommes．

作者的贡献

开展了植物处理、分子生物学研究和数据库研究并起草了手稿。MO提供病原菌，参与挑战和ISR诱导实验。JD和PT参与了研究的设计和协调。所有作者阅读并批准了手稿。

再版和权限