香兰酰基焦磷酸合酶的分子克隆与功能表达锦紫苏forskohliiBriq

Surang Engprasert¹那
鸟Taura¹那
Makoto Kawamukai.²＆
Yukihiro Shoyama¹

BMC植物生物学体积4.文章编号:18.（2004）引用这篇文章

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指标细节

摘要

背景

异戊烯基二磷酸（IPP），常见的生物合成前体对哈达丹磷酸乳蛋白的乳蛋白，通过非甲戊二醇盐途径生物合成。天竺葵二磷酸二磷酸（GGPP）合成酶是Terpenoid生物合成中的重要分支点酶。因此，GGPP合酶被认为是Forskolin生物合成中的关键酶。在此，我们报告了第一次确认GGPP合成酶基因锦紫苏forskohliiBriq。

结果

开放式阅读框架为全长GGPP合成酶编码359个氨基酸的蛋白质，其中1,077个核苷酸长，计算分子量为39.3kDa。对齐C. forskohlii GGPP合酶氨基酸序列显示出与其他植物的高同源性GGPP合成酶．鉴定了几个高度保守的地区，包括两个富含天冬氨酸的基序。n末端区域的瞬态表达C. forskohlii.烟草细胞中GGPP合酶- gfp融合蛋白在叶绿体中表现出亚细胞定位。观察到类胡萝卜素产生大肠杆菌徘徊Paccar25Δ.crtE从欧文氏菌uredovora和质粒C. forskohlii GGPP合酶．这些结果表明cDNA编码功能性GGPP合酶。此外，C. forskohlii GGPP合酶表达在叶中强烈，茎中的茎减少，在根中观察到的表达很少。

结论

本研究提出forskolin是通过非甲戊酸途径合成的。GGPP合成酶被认为参与forskolin的生物合成，forskolin主要在叶中合成，随后在茎和根中积累。

背景

Forskolin，Labdane二萜是从肿块根中分离的主要活性化合物锦紫苏forskohliiBriq。(唇形科)1］．C. forskohlii.已被用作印度的重要民间医学。Futher，已发现Forskolin是腺苷酸环酶的有效活化剂[2，导致c-AMP水平升高，从而影响心脏活动、血压和眼压。最近，福斯柯林已在日本作为一种治疗心脏病的药物上市。由于Forskolin结构复杂，不能通过化学合成。然而，有两组报道了forskolin完全合成的成功[3.那4.］．

类异戊二烯是所有生物正常生长和发育过程所必需的。Isopentenyl二磷酸(IPP;C_5.)是所有类异戊二烯的共同代谢前体。最近，一些研究小组证实了植物中IPP的合成有两种不同的途径。甲戊酸(MVA)途径发生在细胞质中，另一种不依赖甲戊酸的途径(2c -甲基- d -赤藓糖醇4-磷酸;MEP)途径发生于质体[5.-7.］．

天竺葵二磷酸二磷酸（GGPP）合成酶催化烯丙基二磷酸的连续缩合用三个分子的IPP，以产生GGPP，是二萜的生物合成的基本线性前体，类胡萝卜素，类视黄糖和叶绿素的侧链[8.］．GGPP合成酶是萜类生物合成中重要的支点戊基转移酶。

GGPP合成酶基因已在许多生物体中克隆，包括;拟南芥[9.那10.]，水松黄花[11.]，向日葵[12.]，Scoparia dulcis和巴豆sublyratus[13.]，硫化叶菌acidocaldarius[14.]，粗糙脉孢菌[15.]，老鼠和人[16.］．氨基酸序列比较显示，GGPP合酶包含多个保守氨基酸残基域，包括第一个富天冬氨酸基序(FARM)和第二个富天冬氨酸基序(SARM) [17.］．此外，最近的研究表明，序列中FARM前4位和5位的两个氨基酸，以及植物GGPP合酶FARM中插入的一个氨基酸，在产品长度的确定中起重要作用[13.那18.］．

类胡萝卜素产生于GGPP的两个分子的偶联。类胡萝卜素生物合成基因簇(CRT.的基因)欧文氏菌uredovora被阐明了[19.，目前被用于研究类胡萝卜素相关基因在异种系统中的功能。这CRT.基因簇由6个基因组成;crtB（植物合酶），crtE(GGPP合成酶)crtI（植物去饱和酶），crtX(玉米黄质β葡糖苷酶),crtY(番茄红素环化酶)和crtZ（β-胡萝卜素羟化酶）。因此，使用类胡萝卜素使用大肠杆菌隐匿的CRT.基因簇可用于GGPP合酶活性的测定。

GGPP合成酶被认为是forskolin生物合成的关键酶。在此，我们报道了cDNA编码C. forskohlii.GGPP合成酶及其异源表达大肠杆菌．

结果与讨论

cDNA的克隆和测序C. forskohlii GGPP合酶基因

全长的开放阅读框架（ORF）GGPP合成酶基因编码蛋白质359个氨基酸，1077个核苷酸长，计算分子量为39.3 kDa。氨基酸序列c . forkohliiGGPP合酶在整个编码区均表现出高度同源性Catharanthus Roseus.（75％），拟南芥(73%),Sinapis阿尔巴(72%),巴豆sublyratus（69％），Scoparia dulcis(67%)和、(64%)(图。1）.然而，与原核GGPP合成酶的氨基酸序列的比较显示出低的同源水平（30-53％）。高度保守的残留物被指定为Domains I-VII。鉴定了两个保守的天冬氨酸富含族的图案，DDXX（x）d。农场和SARM已被证明在底物结合和催化中是重要的[20.-22.］．

的推定定位信号的瞬态表达式C. forskohlii.烟草细胞中的GGPP合酶

植物GGPP合酶序列比对显示，其n端同源性较低。我们有理由假设这些GGPP合酶在其n端有定位信号，将其定位到特定的亚细胞区室。的n端区域C. forskohlii.通过ChloroP 1.1 Prediction Server预测GGPP合酶在叶绿体中定位。在努力确定本地化C. forskohlii.GGPP合酶，该序列编码的80个氨基酸序列在n端C. forskohlii.将GGPP合酶融合到GFP报告基因的N-末端，并转化为2烟细胞。推定定位信号的模式C. forskohlii.GGPP合酶与阳性叶绿体靶向信号[35SΩ-pt-sGFP(S65T)]相同(图。2）.的n端区域C. forskohlii.GGPP合酶含有叶绿体定位信号。最近，植物GGPP合酶已被确定易位到质体、线粒体和细胞质中[9.那23.］．

异源表达及活性C. forskohlii.GGPP合成酶

为了表达C. forskohlii GGPP合酶，构建并克隆到质粒pBluescript II KS中^-．GGPP合酶与lacZ的计算分子量为41.6 kDa，在大肠杆菌IPTG诱导后携带PGGPPS（图。3.）.

通过与泌尿病生成的遗传互补研究表达的GGPP合酶的功能活性CRT.基因簇。类胡萝卜素是在大肠杆菌窝藏一CRT.群集基因来自大肠uredovora．替换A.CRT.具有相同活性的未知基因的基因，可用于确定该基因的功能[15.］．在此,C. forskohlii GGPP合酶基因克隆到pBluescript II KS中^-矢量（PGGPPS）以生产alacZ融合蛋白。pGGPPS随后被转化为大肠杆菌DH10B携带质粒PACCAR25ΔcrtE在这一crtE编码GGPP合成酶的基因被删除。在转化体中观察到类胡萝卜素呈黄色，表明pGGPPS携带了取代黄酮功能的基因crtE基因(图。4.）.比较了转化子的类胡萝卜素产量大肠杆菌携带转化质粒pACCAR25ΔcrtE和pBAA编码小鼠GGPP合成酶(阳性对照)[16.]，携带转化质粒pACCAR25ΔcrtE和一个pBluescript II KS^-(pBS)载体(阴性对照)。这一结果表明，cDNA的编码区C. forskohlii GGPP合酶编码有功能的GGPP合酶。

的表达GGPP合成酶器官基因C. forskohlii.

的表达GGPP合成酶RT-PCR法在不同器官中检测C. forskohlii.．分析了八十个月植物的根，茎和叶子中提取的总RNA。这C. forskohlii GGPP合酶基因在叶片中强烈表达，而表达在茎中降低并在根中几乎表达（图。5.）.因此，叶被认为是forskolin合成的主要位置。我们以前报道过在无性繁殖的植物器官中forskolin的浓度C. forskohlii.[24.］．茎根和茎碱被测定含有比器官更高浓度的斯科啉。此外，分别分别分析茎底，表皮和皮质，血管束和髓质的部分。在血管束组织中鉴定出最高浓度的孢子蛋白。从这些数据中，我们提出了参与雌激素的生物合成的GGPP合酶主要在叶片中合成，随后分布于茎，最终累积在茎碱基和根中。

通过非甲戊酸途径产生Forskolin

努力通过非甲戊酰型途径研究FORSKOLIN生物合成途径，将各种浓度的FOSMIDOMCIN，非甲醛途径中的1-脱氧-D-木糖-5-磷酸盐还原酶（DXR）酶的特异性抑制剂进行施用这C. forskohlii.测定根的forskolin含量(图。6.）.治疗导致了苏克林的减少，而10μmFosmidomcin对Forskolin生产没有影响。在较高浓度下，观察到剂量依赖性抑制效果。在1000μmfosmidomycin，与无抑制剂治疗的对照组织相比，克洛林含量高达50％。因此，认为被认为是通过非甲戊二醇酯途径合成的。

最近^13.c -葡萄糖饲养实验使用^13.C-NMR分析方法提示forskolin的生物合成途径为非甲戊酸途径[25.］．另外，从非甲戊酸途径第一步特异性酶中克隆到DXR基因C. forskohlii.[26.］．

结论

C. forskohlii.克隆了GGPP合成酶并确定了其亚细胞定位。n端含有一个定位于叶绿体的信号。通过与胡萝卜素基因的遗传互补研究GGPP合酶的功能表达CRT.基因簇。类胡萝卜素是在crtE基因被替换为C. forskohlii.GGPP合成酶。GGPP合成酶被认为参与forskolin的生物合成，forskolin最初在叶片中合成，随后分布到茎中，最终在茎基部和根中积累。

方法

植物材料和试剂

C. forskohlii.植株在无激素MS (Murashige和Skoog)培养基中培养，25°C, 16小时光照周期。光照强度为3000勒克斯，相对湿度为60%。采用茎尖培养法繁殖的茎条(长10 mm)在蛭石中依次培养。BY-2烟草单细胞悬浮液[27.在补充有0.2 mg L的液体改性LS（Leinsmaier和Skoog）培养基中培养^－12,4-d(2,4-二氯音氧乙酸)在25°C的黑暗条件下在轨道培养箱中。限制性内切酶、连接酶、pcr -聚合酶购自日本东京Takara Shuzo株式会社和日本东京Toyobo株式会社。Fosmidomycin (FR-3154)购自美国俄勒冈州Molecular Probes公司。化学试剂购自Sigma化学公司(圣路易斯，美国)和Nacalai Tesque公司(东京，日本)

菌株和质粒

大肠杆菌TOP10F”和大肠杆菌DH10B携带质粒PACCAR25ΔcrtE被用于本次调查中。利用pUC119载体进行cDNA克隆和测序。pBluescript II KS^-矢量被用作GGPP合成酶表达质粒。35SΩ-sGFP(S65T)质粒作为绿色荧光蛋白(GFP)报告质粒。pBI121植物病媒和农杆菌肿瘤术LBA4404用于将GFP和GFP融合基因转化为植物细胞。

cDNA的克隆和测序C. forskohlii GGPP合酶基因

总RNA从根中提取C. forskohlii.用酸胍-苯酚-氯仿萃取法培养[28.］．以oligo-dT适配引物、M-MLV逆转录酶和总RNA为模板，合成单链cDNA。简并引物基于之前克隆的植物GGPP合酶基因高度保守的氨基酸序列设计[13.］．用Taq DNA聚合酶和简并引物A、B、C、D套式PCR扩增出470 bp的cDNA片段(见表)1）.使用基因特异性引物I和J的CDNA末端（RACE）快速扩增CDNA的3'结束，并通过嵌套的PCR获得522bp产物。对于5'族，通过末端脱氧核苷酸转移酶在其5'末端在其5'端中聚酰基化。用特定引物G和H和H和FA和F进行第一和第二PCR，得到285bp产物。通过嵌套的PCR使用特定引物K，L，M和N扩增1,077bp的整个编码区域，由5'和3'赛产品设计。

表1 cDNA克隆引物GGPP合成酶．

全尺寸表

所有扩增的cDNA片段经PCR引物纯化后，在引物引入的位点用限制性内切酶酶切，克隆到载体pUC119中。转换后大肠杆菌TOP10F'，使用BIGDYE终结器周期测序试剂盒使用型号310遗传分析仪（PE生物系统）测序疏松插入物的克隆。

将从核苷酸序列推导的氨基酸序列与使用FASTA程序的基因组网www服务器中的序列数据库进行比较。使用基因组群集服务器中的Clustalw多序列对准进行多种氨基酸序列对准。

的推定定位信号的构造和表示C. forskohlii.GGPP合成酶

n端240 bp片段C. forskohlii GGPP合酶引物P和Q进行PCR扩增，PCR产物经酶切克隆到萨尔我- - - - - -以区域35SΩ-sGFP(S65T)质粒的I位点。35SΩ-pt-sGFP(S65T)为叶绿体靶向阳性对照[29.那30.］．GFP，GGPP合成酶- gfp融合和pt-GFP融合，CaMV35SΩ启动子和NOS3终止子[35SΩ-sGFP (S65T)， 35SΩ-GGPP合成酶-sGFP (S65T)和35SΩ-pt-sGFP (S65T)分别亚克隆到后III-EcoR我的PBI121向量网站然后转换为农LBA4404。将转化体在28℃下在含有25μg/ ml卡那霉素和25μg/ ml利福平的利福平的YEB液体培养基中培养两天。将转化体洗涤两次并重新悬浮在YEB培养基中。农杆菌属转化株(10^8.将细胞）施加至四毫升五天含量的止常悬浮培养培养物。将培养物在28℃下在暗条件下孵育两天。使用尼康Eclipse TE2000-U模型通过荧光显微镜分析GFP和GFP融合蛋白。在400倍放大率下观察细胞。

质粒的构建C. forskohlii.GGPP合成酶表达

的cDNA的编码区C. forskohlii GGPP合酶通过PCR使用特异性引物M和O扩增PCR。消化了PCR产物;纯化并克隆到Kpn一世-Sal.我网站的pBluescript II KS^-矢量，即pggpps。将该质粒转化为大肠杆菌XL1-Blue MRF'为过表达。转化菌在含有50 μg/ml氨苄青霉素和25 μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养。用1 mM异丙基-1-硫代-β- d -半乳糖(IPTG)诱导培养，37℃培养6小时。收集细胞，用50 mM Tris-HCl pH 8.0离心洗涤。将颗粒重新悬浮，加入溶菌酶，孵育30分钟。然后将混合物以一分钟为间隔超声4次，每次15秒。在10000 × g离心10分钟后得到可溶部分。进行SDS-PAGE以检测蛋白[31.］．

遗传互补表达

的pACCAR25ΔcrtE质粒包含基因簇crtB那crtI那crtX那crtY和crtZ编码类胡萝卜素生物合成酶，除crtE(编码GGPP合成酶)。质粒pBAA含有小鼠GGPP合成酶（阳性对照质粒）和大肠杆菌DH10B携带质粒PACCAR25ΔcrtE由日本Shimane大学M. Kawamukai博士提供[16.］．pBluescript II KS^-载体pBS作为阴性对照。pGGPPS、pBAA和pBS转化为大肠杆菌DH10B携带质粒PACCAR25ΔcrtE．将转化子均置于含有50 μg/ml氨苄青霉素和25 μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上，在25℃下孵育2 ~ 3天。

反向transcriptase-PCR (rt - pcr)

一个八个月的孩子C. forskohlii.分十二部分进行分析;叶(L1-L4)，茎(S1-S5)和根(R1-R3)。数量是根据器官的成熟程度而定的。从植株各部位提取总RNA。以1微克总RNA为模板，合成第一链cDNA(采用SuperScript first - strand synthesis System for RT-PCR, Invitrogen)。利用引物M、O、cDNA第一链和kod -聚合酶进行扩增C. forskohlii GGPP合酶在变性条件下，98°C, 15秒;退火，60°C, 2秒，拉伸，74°C, 5秒。作为内对照的18S rRNA片段，在相同条件下用引物R和S进行扩增C. forskohlii GGPP合酶放大。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

forskolin生产分析

C. forskohlii.用不同浓度的fosmidomycin处理植株，然后用HPLC法研究forskolin的含量，如前所述[26.］．通过与202nm紫外吸收法检测的Forskolin标准品(Sigma)的保留时间进行比较，检测Forskolin。

缩写

CRT.：: 雌激素基因
农场:: 第一个aspartate-rich主题
绿色荧光蛋白:: 绿色荧光蛋白
GGPP:: geranylgeranyl二磷酸
议员:: 2 c-methyl-d-erythritol 4-phosphate
MVA:: 甲羟戊酸
指控:: 富有的富含富含股票的主题

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