生物标志物代谢物捕获水稻植株发育过程中代谢物的变异gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

本研究分析了来自水稻分蘖(分枝)发育概况的代谢组学数据，以确定一组生物标志物代谢物，这些代谢物可靠地捕捉了该植物发育事件的代谢物变异，并有可能作为与发育、环境或基因型变化相关的代谢物概况的快速比较筛选基础。代谢和代谢物谱的变化是发育事件的一部分，也是对其的反应。这些变化受发育程序的影响，也受外部因素的影响。然而，需要许多样本来描述发育变异的定量方面。生物标志物代谢物集可以提供综合代谢组学研究和特定代谢物或途径的重点研究的一些优势，从而有利于植物发育变异的定量筛选。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

通过:(1)确定综合代谢组谱的主成分，然后(2)确定代表前三个主成分负载变化的代谢物簇，最后(3)从这些已知的在不同生物体中常见的代谢物簇中选择单个代谢物，得到一组合适的代表植物发育时期的生物标志物代谢物，包括水稻分蘖(分枝)的开始和早期生长。21个生物标志物代谢物的结果是可靠的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001)捕获发育过程中83%的代谢物变异。此外，生物标志物代谢物的一个子集是成功的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05)在正确预测代谢产物的变化响应环境的另一项水稻代谢组学研究中确定。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

确定一组生物标志物代谢物的能力，可靠地捕捉植物发育事件的代谢物变化。生物标志物代谢物普遍存在于不同的生物体中，因此对其定量关系的研究可以提供与植物发育、环境或基因型变化有关的代谢物概况的比较信息。gydF4y2Ba

由基因型和环境引起的作物发育变异强烈影响产量。全球需要提高作物生产效率，因为预计人口增长与区域耕地面积减少同时发生[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．“了解作物对环境的反应将为开发方法提供基本的基础，以实现这些效率的提高”(Hall，[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba])。植物通过化学和物理两种方式与环境相互作用，但我们对植物在发育过程中和发育过程中对环境的化学反应知之甚少。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．这种对发育过程中代谢物模式的广泛变化的缺乏限制了我们操纵植物发育的细胞或分子方面以影响产量或生产可持续性的效率。gydF4y2Ba

植物代谢组学的最新进展，即大规模植物化学分析[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，为鉴别代谢产物模式的广泛变化铺平了道路。代谢组学通常被用来描述由于特定环境或遗传干扰而引起的全面变化[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．气相色谱-质谱(GC-MS)方法目前正在许多代谢组学研究中使用，可以对大量代谢组提供精确和可重现的定量和定性评估[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．GC-MS方法的一个潜在缺点是样品的连续处理。对一些研究来说，分析大量样本所需的时间可能很长。gydF4y2Ba

需要许多样品来描述发育变异的定量方面。在这些情况下，使用样品并行处理来实现高通量分析的方法将补充传统的综合但连续的程序，如GC-MS。并行处理方法的一个潜在缺点在于它们依赖于要测定的代谢物的预先测定，这在观察到的代谢物模式中可能存在偏差。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物的使用在许多生物领域都很常见，包括临床化学。福耶等人[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]最近提出使用某些氨基酸或它们的组合作为植物几种代谢过程或状态的生物标志物代谢物。在临床-化学方法中，代谢物的选择通常基于其诊断价值，而在我们的研究中，我们寻求一种结合诊断方法和综合代谢组学方法的优点的方法。当一组生物标志物捕捉到代谢组的大部分差异时，就接近全面性。通过解释生物标志物之间的相对模式，以及在各种条件下这种模式的转移或扭曲，来接近诊断价值。我们预计，通过数据还原方法构建的生物标志物代谢物集将在很大程度上重叠或捕获通过植物生理学知识开发的生物标志物集。gydF4y2Ba

来自代谢物簇的代表可能可以捕获代谢组学研究中的大部分代谢物方差，因为在代谢组学研究中通常观察到代谢物之间的多重相关性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．如果可以确定下列代表:(1)这些元素(代谢物)代表了一项研究中可能影响作物生产效率提高的代谢物变异的大部分，(2)这些元素之间相对独立，(3)这些元素在任何典型的植物样品中都是常见的，那么合成的生物标志物代谢物集可用于植物发育时期代谢物模式的比较筛选，植物对特定环境因子的响应，或在特定条件下的基因型，并可提供综合代谢组学技术和诊断生物标志物方法的补充工具。gydF4y2Ba

代谢产物的组成可能会随着发育和环境的变化而不断变化。已知核心初级代谢物可在基因型之间提供良好的代谢物区分[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这是意料之中的，因为它们的数量通常受到许多基因变化的影响，即它们参与高度调控的活动。它们的数量也可能受到影响，部分是由于影响发育的内部规划所触发的发育变化，以及随着生长模式的改变而发生某些代谢转变的需要[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．这些核心初级或中心代谢物中的许多在对环境条件的响应中表现出显著变化[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．中枢代谢变异的知识进一步被认为是代谢工程进展的基础[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，表明人们普遍相信它的变化是一致的和有影响的。由于生物学原因，初级和中心代谢物需要在发育和对环境的响应中发生差异变化，并已在多种生物中被证明是这样的(上面的例子包括高等植物和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba)．此外，对这些代谢物有相当数量的一般知识和化验程序。如果使用以下简单的程序，则认为满足上述三个要求的可能性是好的:1)将发育事件的代谢物的方差划分为独立的成分，2)确保每个主要成分中的变异都得到了表示，然后3)确定满足这些条件的中心(或近中心)代谢物的最小集合。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物组在发育研究中的效用取决于生物标志物提供植物发育某一方面的快照的能力。生物标记物能够忠实地代表在植物内不同位置和不同植物年龄采样的组织之间的变化模式，这提供了一种内部验证。本研究的组织样本之间的关系模式的适当表示是一组相关性，基于代谢物数据，存在于它们之间。因此，生物标志物代谢物集捕获代谢物方差的可靠性，可以基于基于组织之间相关性的、相对于基于利用更全面代谢物数据集的相关性的关系的识别组织之间相同关系模式的能力。gydF4y2Ba

如果能够开发出一套可靠的、经过验证的生物标志物代谢物，那么最终目标是对代谢物模式的比较筛选的输出类型进行演示。gydF4y2Ba

用于开发所提议的生物标志物代谢物集的代谢组学数据集检测了水稻分蘖初期发育期间的代谢物组成(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Bal .)。分蘖是水稻、小麦和许多其他小粒作物的主要产量组成部分，因为每块土地上分蘖的数量强烈影响每块土地上的穗数(穗数)。分蘖发生对基因型和环境影响敏感。影响分蘖萌发的环境因素包括最常见的影响植物发育事件的因素，如辐射量和光谱质量、营养充足性、氧化应激程度和生长抑制剂的存在。我们项目的一个长期目标是了解这些因素如何影响分蘖启动的共性和差异，以便制定方案来最小化它们的影响，增加水稻分蘖的一致性和可操作性，从而提高水稻作物的产量和质量。gydF4y2Ba

首先，对水稻分蘖发育过程中代谢物空间的主要成分进行了解释。这包括对主成分1上代谢物负荷模式的一些检查。接下来，基于排序主成分负荷的代谢产物聚类结果被提供。本节包括生物标志物代谢物的结果选择，以及对它们相对独立性的检查。下一节讨论生物标志物代谢物的生理相关性，重点是它们在前三个主要成分上的负载。在此之后，通过分析生物标记集的可靠性来提供一些内部验证，以表示在组织中观察到的代谢物变化的模式。然后，通过测试单个生物标记物预测其他代谢物浓度变化的能力来提供外部验证。最后，从代谢产物模式的比较筛选的输出类型被证明。gydF4y2Ba

水稻分蘖发育过程中代谢物空间主要成分的解析gydF4y2Ba

通过应用代谢物空间(与植物发育序列空间相反)的主成分分析，水稻分蘖发育研究中的代谢物剖面被重新分配到独立的子集中。在标准化中心代谢物空间中确定了主成分，因此结果是基于对单个代谢物浓度变化的幅度和模式进行的分析(而不是它们的绝对浓度)。前五个主成分解释了83%的总代谢产物方差(前三个主成分解释了62%的总代谢产物方差)，在本研究中进行了评估。gydF4y2Ba

解释主成分的第一步涉及绘制分数与两个发育变量的关系，即出现后的天数和样本中部的高度gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．如果一个主成分受到发展的强烈影响，那么它的得分将显示出与两个发展变量有关的变化模式。在主成分1、3和5评分的图中观察到这种模式(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．如果一个主成分受到环境的强烈影响，独立于发育，那么得分将显示出一种相对于出现后数天的变化模式，而不是采样时组织切片的高度。可能只对羽化后几天产生影响的环境变化的一个例子是，由于云量的变化，收获当天光合辐射强度的变化。在主成分4的图中观察到这样的模式(如果暂时忽略最基础组织位置的强烈影响，可能也会观察到主成分2)(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．主成分分数变化的主要影响在两个主要影响类别(可能是发展和环境)之间交替出现的趋势并不罕见(另一个例子，见Tarpley等人)。gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]，其中生理和环境影响之间有明显的交替)。gydF4y2Ba

主成分上代谢物负荷的规律gydF4y2Ba

主成分1上代谢物的负荷模式表明，某些代谢物的变化可以通过已知的代谢来解释。例如，爱尔兰[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba讨论了植物中氨基酸合成过程中氮流动的主要途径。一些涉及的氨基酸也是我们研究中主成分1的相对强的-阳性或阴性的贡献(装载者)。大约一半的相对强(标准库中155个代谢物的前8或前9个正或负负荷，删除了一些高度相关的代谢物集合的成员后剩下的)是氨基酸，包括爱尔兰指出的，这表明在植物发育或环境因素中观察到的代谢物模式有时可能与众所周知的代谢有关。在本研究的主成分1中，几个相对强的正向加载物(丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸)在代谢空间中与谷氨酸相当接近，而谷氨酸是一个相对强的负向加载物，因此在我们的代谢产物空间中与它们有些距离。例如，谷氨酸和天冬氨酸是通过一个单一的代谢步骤分离的——谷氨酸:草酰乙酸转氨酶[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这四种代谢产物(丙氨酸、天冬氨酸和甘氨酸/丝氨酸比)与代谢产物空间中主成分1中谷氨酸的负荷相反，被认为是许多C类植物光呼吸相对速率的生物标志物代谢产物gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba基于生理理解的作物种类[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．光呼吸活性通常随叶片发育的进展而增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，并有望在本研究的发展阶段增加。主成分1上光呼吸标记物的高正负荷支持了这一预期，因为主成分1的得分随着发育而增加，因此这些高正负荷物在发育过程中也相对集中增加。这些氨基酸之间的代谢联系，或在代谢产物空间的更多维度捕获它们与其他代谢物行为的生物标志物代谢物集，将对解释水稻分蘖开始和早期发育中的代谢物差异很有兴趣。gydF4y2Ba

基于排序主成分负荷的代谢物聚类gydF4y2Ba

代谢物的选择是通过K-means聚类，基于三个顶部主成分的排名负荷，聚类为27个。在27个组合中发现了20个簇。从17个这些聚类中，选择具有代表性的代谢物，最重要的是根据它们与聚类中心的接近程度，其次是它们作为代谢物的共通性。对于剩下的10个理想组合中的4个，当来自相邻簇的代谢物在前两个主成分上的负载与所寻找的完全相同，且在主成分3上的负载中具有“险些”位置时，它被认为是足够接近的有用的。其余6种组合未发现有代表性的代谢物。在六个未填充组合中，最强大的共同模式是只有一个在主成分1上有很强的负载荷。换句话说，由于主成分1的得分有随发育而增加的趋势(草具有基部分生组织，因此中段高度的增加也是发育的进步)(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，当对该代谢物的要求是其浓度在发育过程中相对于其他代谢物具有较大的特定比例下降时，在本研究中几乎总能找到具有代表性的代谢物。代谢产物的合成集和它们所代表的组合如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．另一个数据文件(参见gydF4y2Ba额外的文件:1gydF4y2Ba)列出主成分分析和后续聚类中使用的代谢物，并且至少已经部分或初步识别。给出了基于前三个主成分加载值的实际排名。gydF4y2Ba

确定所选生物标志物代谢物两两比较的Pearson相关值的分布。用于选择生物标志物代谢物的系统方法有望产生一个皮尔逊值范围。例如，从一组对主成分1、2和3(即海藻糖)具有强烈负负荷的代谢物中挑选出的代谢物，预计与柠檬酸盐具有相当正相关性(对主成分1和2负负荷，对3负负荷)，与半乳糖不太相关(对主成分1和2负负荷，对3负负荷)，与尿嘧啶具有很强的负相关性(对所有三个主成分都有正向负荷)。Pearson均值为0.06±0.06(95%置信区间)，离散度为0.41±0.04(95%置信区间)(为了进行比较，正态分布的均值为0，离散度为1，但请记住，相关值的非病态分布的离散度不可能接近1，因为相关值总是在-1和1之间)。根据它们的相关性，表明生物标志物代谢物具有令人满意的相对独立的分布。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物与其主成分负荷的生理相关性的解释gydF4y2Ba

这里展示的生物标志物代谢物的选择部分基于它们在前三个主成分上的负载范围，任何对它们生理相关性的解释都始于对它们的生理相关组的检查，这些组共同贡献于一个特定的主成分。gydF4y2Ba

主成分1的得分随着发展有增加的趋势。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，因此在主成分1负负荷较强的生物标记物中，氨基酸的比例较高(gydF4y2BaγgydF4y2Ba-氨基丁酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸)与其他观察到的叶片在发育过程中氨基酸含量下降的结果一致[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

三羧酸循环中的生物标志物(苹果酸、琥珀酸和柠檬酸)都是主成分2的强负载量。这一成分往往在羽化后的几天内变化更大，而不是与更严格的发育变量的组织取样的高度。这些结果表明，三羧酸循环受影响主成分2值的环境因子/s的粗略控制。gydF4y2Ba

相对于代谢物的氮含量，主成分3上的阳性和阴性负载的生物标志物之间存在着强烈的对立。几乎所有的阳性生物标志物代谢物都是含氮的——谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、焦谷氨酸、胸腺嘧啶、尿嘧啶和缬氨酸;唯一的例外是gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-aconitate。gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba-aconititate是aconitate的稳定形式，能够从gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-aconitate [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．几乎所有负负载的生物标志物代谢物都是糖或有机酸、非氮化合物——半乳糖、甘露糖、海藻糖、碳酸盐、苹果酸、草酸和石草酸;唯一的例外是gydF4y2BaγgydF4y2Ba氨基丁酸(GABA)在高等植物中，氨基丁酸是氨基基团不在α位的氨基酸中分布最广的一种。gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

生物标志物组代表组织间观察到的代谢物变化模式的可靠性gydF4y2Ba

如果合成的生物标志物代谢物集捕获了通过代谢组学分析获得的发育过程中的大部分代谢物差异，那么我们应该能够“翻转”分析，并基于它们的生物标志物代谢物浓度检测与发育相关的组织关系的自然模式，可能还有环境。gydF4y2Ba

为了评估生物标志物代谢物集在发育过程中始终检测组织间代谢物分布模式的能力，我们将基于21种生物标志物代谢物的标准化和集中浓度的样本组织间所有相关性集与基于解释原始代谢组学数据集中最多(83%)方差的五个主成分值的所有相关性集进行了比较。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba是这两个数据集的值对的散点图。这些代谢物浓度是标准化的，并在图中居中，因为我们的研究主要关注的是代谢物在发育过程中变化的幅度和模式。图中绘制的相关值也被转换为agydF4y2BaZgydF4y2Ba-刻度，以得出生物标志物代谢物组模拟组织间模式能力的准确性(拟合线的斜率接近1，截距接近0)，并具有合理的精确度(r = 0.82)。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物组被确定为可靠的(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001)，以捕捉在水稻分蘖出现的这一特别研究中出现的组织之间基于代谢物的关系。我们选择不去解释原始数据集的任何变化，因为我们的目标是开发一种生物标志物代谢产物集，以检测发育过程中组织之间的模式，但我们不能使用生物学推理，解释主成分5之后的任何主成分在发育过程中组织之间的模式。因此，只使用前五个主成分作为滤除噪声的方法[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]的综合数据集。这有助于避免数据过拟合[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

生物标志物代谢物组的外部验证gydF4y2Ba

建议的生物标志物代谢物集如果用于比较筛选会获得价值，但在比较情况下使用需要对其可转移到不同情况有一定的信心。部分置信度由上节描述的内部验证提供，这表明集合结构良好，也由与检测到的主成分相关的代谢物的一些自然分组提供。然而，要完全相信，需要证明该集合是可转移的。通过重新分析Sato等人(2004)的数据，进行了外部验证[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，这是一种毛细管电泳(CE) -质谱仪:水稻叶片的CE二极管阵列检测器代谢组学研究，重点是昼夜转换(他们的表2)。对代谢物进行了鉴定，其中一对中的一个成员是他们在研究中测定的生物标志物代谢物，而一对中的另一个成员是Sato等人测定的代谢物，其中代谢物与生物标志物代谢物有明确的配对。比较能够构建的每对成员的代谢物浓度昼夜比的变化。在可用于验证的6对样品中，4对预测了较高的昼夜比，每对样品都观察到较高的昼夜比，1对预测了较低的昼夜比，观察到较低的昼夜比，1对预测了无变化的昼夜比，观察到较高的昼夜比。结果表明，生物标志物代谢物组可能(gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.05)在其他一些情况下也很有用，这些初级和中心代谢物可能会以高度调节的方式发生变化，因为所测试的生物标记物在叶片昼夜转换的不同环境情况下可以很好地作为预测因子。gydF4y2Ba

生物标记物代谢物模式的比较筛选示例输出gydF4y2Ba

图中提供了一种表示生物标志物代谢物研究结果的可能方法gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba其中，分蘖研究中代表发育范围的四个组织切片与生物标志物代谢物变异相关。显然，这些代谢物的生物标志物在分蘖研究中以可确定的方式发生变化。有些(如几种有机酸)在发育过程中浓度会增加，其他的(亮氨酸、苯丙氨酸、海藻糖、谷氨酸)则会减少，还有一些则表现出更复杂的模式。这些模式的组合可靠地反映了综合代谢组学概况的变化，并提供了这一发育事件的生物学新观点。基于生物标志物变化的代谢物变化的表示可以在一个单一的图表中查看，而原始332个代谢物的变化(实际上是去掉高度相关的代谢物集合的一些成员后剩下的那些代谢物)不能轻易地在一个单一的图表中捕获。相比之下，仅在一种或少数代谢物中呈现的变化无法捕捉生物标志物代谢物变化提供的更广泛的成分变化模式。生物标志物代谢物空间中形状的扭曲(生物标志物代谢物之间基于其变化模式的相互关系)可以用图形和/或数学方法捕捉到，并作为代谢物综合集合中变化的近似值进行评估。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物集用于比较筛选的适用性gydF4y2Ba

分蘖是谷物作物和许多其他草类的一个重要的、调控良好的发育过程。利用一小组常见的代谢物作为生物标志物来捕获这种发育概况的代谢物变化的能力表明，在其他植物发育事件中使用同一组生物标志物代谢物来捕获其大部分的能力。这些代谢物通常参与高度调节的代谢活动，因此它们在植物发育中作为生物标志物是很有用的，这并不奇怪。在不同的发育或生长反应事件中，不同的代谢途径的使用需要发生差异，但这些是程度上的差异。其中一些差异可以帮助调节不同的发育或生长反应事件[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．生物标志物代谢物之间的相互关系将以一致的方式变化，以响应发育、基因型和环境的变化。比较不同条件下生物标记间相互关系的变化(生物标记空间中的拉伸和折叠-扭曲)，将提供关于植物发育和对环境响应的生理反应的新信息。生物标志物代谢物集不可能在任何条件下都是最优的，但在捕获它们之间的生理真实差异方面可能相当稳健，同时对最终的代谢解释有响应。gydF4y2Ba

由于基因型和环境导致的作物发育变异对产量有很大影响，但人们对植物发育的定量生化变异了解很少。gydF4y2Ba

这篇论文提出了一种开发生物标志物代谢物集的方法，它可以捕获水稻植物发育事件分蘖的综合代谢组学集中的大部分代谢物变异。由此产生的生物标志物集旨在提供代谢组学方法和使用一个或几个诊断代谢物的一些优势。gydF4y2Ba

该方法使用简单和常用的多元统计，即主成分分析和K-means聚类，以辅助生物标志物代谢物的选择。在综合代谢组学研究中，21个生物标记物的结果集被证明在捕获代谢物方差方面是可靠的，并且在预测另一项代谢组学研究中观察到的代谢物变化方面是有效的，同时捕获有合理潜力与众所周知的代谢相关的变化。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物的选择进一步局限于初级代谢物、中心代谢物或普通代谢物。因为所选代谢物在不同的生物体中是常见的，并且通常已经开发了特定的分析方法(例如Bergmeyer [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba， Passoneau和Lowry [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba， Gibon等人。[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， Kiianitsa等人。[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba])，该生物标志物集可通过未来的高通量技术进行检测，并可应用于多种情况。生物标志物代谢物组可作为植物发育时期代谢物模式、植物对特定环境因子的反应或特定条件下基因型的比较筛选的基础。gydF4y2Ba

植物的培养和组织样本的初步保存gydF4y2Ba

水稻幼苗。IR-36在位于美国德克萨斯州博蒙特的德州农工大学农业研究和推广中心的温室中，在典型的温度和补充照明条件下，在典型的黑色粘土土壤(该地区典型的稻田)中生长。2 ~ 3叶期施氮肥为尿素。在羽化一周后开始采样，每隔2 - 4天进行5次，为期10天。在每个取样日期使用单独的幼苗组，从而避免对现有植物的伤害。在此期间，幼苗发育到约3叶至5叶期。所有样品在CDT 1000 - 1400小时(接近太阳正午)之间收集、处理和储存。在5分钟内将土壤从幼苗上洗掉，然后将幼苗与根系一起放入自来水中，直到解剖。这是在取样过程中短期保持水稻植株完整性的既定程序。gydF4y2Ba

从植株基部开始，沿着生长的茎秆以2毫米的间隔将幼苗切成10段。在这一发育阶段，2毫米的切片厚度足以确保大多数细胞不因新型乙醇清洁刀片的切片作用而中断。这使受伤反应最小化。每个重复包含平均50个幼苗的组织，即50个幼苗的同一秆位置的2毫米切片。避免种植生长缓慢的幼苗。将获得的切片在几秒钟内放入液氮中，直到所有切片被收集。然后将切片保存在-80°C的氮气净化小瓶中，直到冻干用于代谢组学程序。试验共设3个重复，每个重复50株幼苗。gydF4y2Ba

只从植物基部的1、3、5、7和9位置的部分用于代谢组学。切片是沿着两个梯度收集的:沿着茎和在发育过程中。gydF4y2Ba

在冻干后(Labconco Freezone 6, Kansas City, Missouri, USA)，样品被盖在氮气下的琥珀玻璃小瓶中，然后用聚乙烯均聚膜(parfilm M;Pechiney塑料包装，Neenah, Wisconsin, USA)，以便在运送到Noble基金会实验室进行代谢组学分析之前进一步减少气体渗透。gydF4y2Ba

萃取、衍生化和仪器分析gydF4y2Ba

将总共6.02 mg(±0.02 mg)的冻干组织粉末称量到3.7 ml (1 dram)的含特氟龙镶嵌的小瓶中。代谢物提取:加入1.5 mL含5 mg/L菲内标的氯仿和1.5 mL含25 mg/L利比醇内标的瓶装水，旋动1 min。样品在50°C下摇匀1 h， -20°C放置过夜。样品再次在50°C振荡培养4 h。超声30 s后，在旋斗转子中以2900 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba从极性层和亲脂层均取1.2 mL等分，并转移到2.0 mL自动采样小瓶(Agilent, Palo Alto, California, USA)，有特氟龙/硅隔。极性层在快速真空干燥(Savant, Albertville, Minnesota, USA)中干燥4小时，亲脂层在压缩氮气流中干燥2小时。提取液在-20°C保存，直到可以进行分析。对极性和亲脂性提取物进行了分析。gydF4y2Ba

用120 μl 15 g/L盐酸甲氧基胺在吡啶中甲氧基化制备极性干提取物，在50℃下处理4 h，然后进行短时间超声(<30 s)去除颗粒。样品加入120 μl n -甲基- n -(三甲基硅基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷，50℃孵育1 h衍生。gydF4y2Ba

通过脂肪酸和脂类的甲基化反应制备了干燥的亲脂性提取物。干燥的提取物溶于100 μl氯仿和300 μl甲醇(含1.25 M HCl)， 50℃孵育24 h，然后在氮气流下干燥2 h。干燥的转甲基化样品在70 μl吡啶中重悬，在30 μl n -甲基- n -(三甲基硅基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷中衍生，在50℃下衍生1 h。gydF4y2Ba

衍生代谢物混合物用惠普6890气相色谱仪、5973质选择性检测器和6890系列注射器进行分析。综合系统在HP Chemstation(安捷伦)下运行。极性样品按5∶1的注入比注入1 μl;1 μl的亲脂性样品按1:1注射比进行分析。所有样品注射一式两份。使用60米DB-5MS毛细管分离柱(J&W Scientific, Palo Alto, California, USA)进行分析。注射温度为280℃，界面温度为280℃。分离使用以下温度程序:在80°C等温加热3分钟，然后5°CgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}烤箱斜坡至315°C，最后等温加热在315°C，极性14分钟，亲脂性12分钟。质谱记录在2.48 sgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}具有50 ~ 650 m/z的质量扫描范围。每次运行大约需要70分钟，包括机器平衡时间。gydF4y2Ba

代谢物鉴定使用GC-MS光谱数据库与当前国家标准与技术研究所图书馆(NIST02)和诺贝尔基金会内部定制的专注于植物代谢物的数据库进行匹配。采用上述的甲氧基化和衍生化方法制定了内部文库的建设标准。利用自动质谱反褶积和识别软件(AMDIS)(美国国家标准与技术研究所(NIST)， Gaithersburg, MD)进行文库构建和代谢产物原始图谱的代谢产物识别。gydF4y2Ba

根据Duran等人进行GC-MS色谱数据比对。[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．使用自定义Perl脚本从原始代谢组数据文件中提取并对齐选定的离子。这为数据提供了更全面的查询，并能够基于潜在的大量数据来解析协同洗脱色谱峰。gydF4y2Ba

代谢物之间的相关性gydF4y2Ba

代谢物对之间的相关性用Pearson相关系数来评价[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．必要时从数据集中删除一个或多个高度相关的代谢物集，以确保后续计算不涉及奇异矩阵[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．奇异矩阵不能提供多元统计方法的唯一解。gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

测定标准化中心代谢物空间的主成分。该分析包括未与标准库匹配的代谢物，但不包括为避免奇异矩阵而遗漏的代谢物。在MathCad 2001 (MathSoft, Inc.， Cambridge, Massachusetts, USA)中使用Pielou描述的矩阵操作[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．尽管现有的方法可以帮助确定保留哪些主成分(例如，碎石分析)，但根据观察得出的结论，其他主成分既不能解释太多的差异，也不能显示出代谢产物负荷的任何模式，而这些模式可以很容易地与已知的代谢相关，或作为对发育或环境变量的响应[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

通过K-means聚类选择代谢物gydF4y2Ba

选择单个代谢物，以提供前三个主要成分负载的变异分布，同时可能容易检测。代谢物选择涉及对三个顶部主成分上的排序负荷进行k -均值聚类，然后从聚类中单独选择有前途的代谢物。k均值聚类使用Cleaver(表达分类，数组版本1.0)软件进行，该软件可通过斯坦福医学院Helix生物信息学小组维护的微阵列分析网站获得[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．该分析使用欧几里得距离度量法寻找了27个簇。这种设置最大化了获得代表三个主成分的强正加载、弱加载和强负加载元素的所有可能组合的簇的潜力。换句话说，3个负荷强度× 3个主成分，一次取3个= 27个需要代表性代谢物的组合。有代表性的代谢物的选择首先是基于它们与簇中心的接近程度，然后是它们作为代谢物的感知共性。对于其余的聚类，当来自相邻聚类的代谢物在前两个主成分上的负载与所寻找的完全相同，且在主成分3上的负载中具有“险些”位置时，该代谢物被认为是足够接近的有用的。如果用这种方法没有找到足够有代表性的代谢物，那么就没有进一步的努力，这样的簇仍然没有代表性。gydF4y2Ba

生物标志物组代表组织间观察到的代谢物变化模式的可靠性gydF4y2Ba

为了评估生物标志物代谢物集在发育过程中始终检测组织中代谢物分布模式的能力，所有成对皮尔逊相关的集合[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，根据生物标志物代谢物的标准化浓度和中心浓度得到样本组织。基于原始代谢组学数据集中解释最多(83%)方差的五个主成分的未排序值，获得了所有成对相关性的等价集。利用Fisher[的方法，通过比较两组相关值，获得了生物标志物代谢物组捕获发育中组织中代谢物变化的可靠性。gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．有435对值可供比较，但这些都不是真正的独立变量，因此可靠性分析采用28个自由度(30个组织样本减去2个自由度)，以解释相关值对之间缺乏独立性。gydF4y2Ba

生物标志物代谢物组的外部验证gydF4y2Ba

通过重新分析Sato等人(2004)的数据，开发了外部验证分析[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]，这是一种毛细管电泳(CE)-质谱仪:水稻叶片的CE二极管阵列检测器代谢组学研究，重点是昼夜转换(他们的表2)。对代谢物进行了鉴定，其中一对中的一个成员是他们在研究中也测量到的生物标志物代谢物，一对中的另一个成员是Sato等人测量到的代谢物，其中代谢物与生物标志物代谢物有明确的配对。比较可以构建的每对成员的代谢物浓度昼夜比的变化，并用生物标志物代谢物的变化方向预测其他代谢物的变化。在这个验证测试中使用的代谢物浓度的平均变化百分比被认为是相当小的，仅为夜间值的51%，因此证明了使用生物标记物的能力来表示在昼夜转换中各自预测代谢物的浓度变化方向的能力，作为生物标记物标记其他代谢物广泛变化的能力的一个相当强大的验证测试。gydF4y2Ba

我们感谢德州水稻研究基金会为LT提供资金支持，包括对THK的支持。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 德克萨斯州农工大学农业研究和推广中心，1509 Aggie博士，博蒙特，77713，美国德克萨斯州gydF4y2Ba

   李担任gydF4y2Ba

2. 美国德州农工大学土壤与作物科学系gydF4y2Ba

   Lee Tarpley & Tesfamichael H KebromgydF4y2Ba

3. 分析研究实验室，俄克拉荷马市，俄克拉荷马州，美国gydF4y2Ba

   安东尼·L杜兰gydF4y2Ba

4. 塞缪尔罗伯茨诺贝尔基金会，阿德莫尔，俄克拉荷马州，美国gydF4y2Ba

   安东尼·L·杜兰和劳埃德·W·萨姆纳gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba李担任gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

植物的培养，组织的取样和组织样品的初步保存(THK, LT);通过质谱解释和代谢物鉴定(ALD;镜);生物标志物代谢物组开发相关数据分析;策划并撰写稿件(LT)。所有作者阅读并批准了最终稿件。gydF4y2Ba

Anthony L Duran, Tesfamichael H Kebrom对这项工作也有同样的贡献。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba