一氧化氮，细胞死亡和增加的紫杉醇回收率

通过NASA支持这项研究，旨在评估微匍匐科学的早期机会，以商业化空间，并为国际空间站开发生物技术设施[1]。主要任务是评估紫杉醇（通用名称：紫杉醇）的生产，其中包括用于航天飞机的生物反应器中的细胞悬浮液。出乎意料的是，这项工作导致了在机械和重力地应激植物细胞中的L-精氨酸依赖性一氧化氮（NO）突发的早期证明，无诱导的编程细胞死亡（细胞凋亡）（在[2]），并且描述这些因素如何为提高紫杉醇和紫杉烷从针叶中恢复的模型。

早些时候，当克雷斯 - henselit或尿素循环的中间体（见图1）被送入针叶树，衍生出几种取代的胍基化合物均匀标记^14.c-l-精氨酸，少得多^14.c-l-citrulline [3.那4.]。当时，取代的胍主要被认为是呼吸抑制剂[5.那6.]。如今，它们是植物，动物和人一氧化氮合成酶（NOSS）的天然抑制剂。NOS底物是L-精氨酸和氧气。NOS产品是L-瓜氨酸，没有。

由于硝酸盐和亚硝酸盐还原酶也是已知的，因此我们获得了一个拟南芥硝酸盐还原酶双突变体，目的是在没有硝酸盐，亚硝酸盐和还原剂的情况下发现细胞没有产生否则[7.]。通过这种突变体，我们重申了没有推定的NOS活动。从L-精氨酸的生产不受D-精氨酸阻断，并由NoS抑制剂封闭，N^G- Moronomethyl-L-精氨酸（L-NMMA）确保在没有任何残留的硝酸还原酶活性的情况下生产不产生。依赖于细胞中的NOS依赖性不会被其他胍基化合物抑制，但不是由D-精氨酸抑制。随后，两种植物NOS基因的其他人发现的发现提供了植物基因组代码的证据。在我们的工作中tax细胞悬浮液，取代的胍提供保护免受机械诱导的应激和细胞死亡或细胞凋亡。

紫杉醇是一种有效的抗癌剂，首先是从树皮中孤立的Taxus Brevifolia.[8.]。紫杉醇与微管结合，从而提供一种抗细胞增殖的新机制。它成为历史上畅销的抗癌药物。到2000年，紫杉醇的商业销售额超过15亿美元。紫杉醇和紫杉烷生物合成的新车型出现了[9.]，使得紫杉醇合成可遵循在通过免疫细胞化学亚细胞水平，并且通过激光共聚焦和扫描电子显微镜[10.-13.那20.]。使用没有供体，NoS底物，产品，抑制剂（取代的胍），并且没有陷阱为控制瓜氨酸没有循环提供了新的机会（见图1），细胞凋亡和紫杉醇生产在单位重力，模拟微匍匐和超高的程度。

来自女性树木的单倍体蛋细胞布雷弗里亚被选为实验材料[12.那19.]。容易筛选这些细胞，而不会对二倍体细胞的效应，隐性和认识性相互作用的影响。直接表达致命基因，并通过细胞凋亡制造细胞群遗传上更均匀地除去。二倍体细胞悬浮液也是从T. Cuspidata.[13.[1995年从Zelenka托儿所（Grand Haven Mi）和种子中获得的3岁股票的针头T.Chinensis.。这提供了更好的比较与使用二倍体细胞的所有其他公布的工作。

细胞悬浮液在半固体培养基上以25±2℃保持暗度，在125ml Erlenmeyer烧瓶（60 rpm）中，在螺旋桨上（1 rpm模拟2×10，1 l Nippled烧瓶^-4×g，但随着气态和液体环境的显着混合，具有100mL高宽高的旋转容器（哈夫12.5cm dia。），并在CA.10旋转圆柱培养容器（RCCV 7.5cm。）^-2×g（SyntheCon，Houston TX）。NASA在早期航天飞机实验中使用了HARV和RCCV，并在迷你有效载荷集成中心，设计为飞行中的实验室。

在所有细胞测定中，细胞凋亡细胞在形态学上和TUNEL反应分辨[14.那15.]。自由紫杉醇，紫杉烷类，和浆果赤霉素III在细胞和培养基中，或结合的紫杉醇和紫杉烷类，木聚糖酶活性后释放，用竞争性抑制酶联免疫测定从夏威夷生物技术试剂盒测定。通过激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM 410反相扫描显微镜）检查细胞免疫细胞化学荧光（FITC，CY3）和胶体金，以重申紫杉醇，紫杉烷环（植物III）的亚细胞位置，C-13个侧链的紫杉醇，以及一般的紫杉烷。对于大于10g新鲜生物质的样品，通过HPLC使用真实标准和TaxIL列（Metachem Technologies Inc.）测定这些化合物[12.]。

和T. Cuspidata.rCCV生物反应器中的悬浮液（10^-2×g），在1升下降烧瓶中（24°C的黑暗中3个WKS），自由紫杉醇分别包含42和21％的紫杉烷（1.1和2.4mg紫杉醇/ kg风干生物量）[13.]。将细胞以3和24×g离心，大大增加了紫杉烷含量，但减少了紫杉醇回收率。T. Cuspidata.和布雷弗里亚与机械应力，模拟的微匍匐度和超高的程度类似地响应，通过不产生爆发，细胞凋亡，以及紫杉醇和紫杉烷的过量生产。

布雷弗里亚热杀死的细胞没有产生没有。通常，19％的活细胞（振荡器烧瓶中的单位重力3小时）始终是阳性的，因为用DAF-2DA测定。加入10^-4MM SNP，NO供体，或在150×G以150×g离心3小时后，几乎所有细胞都产生了不。然而，如果加入0.5mM L-NMMA（NOS抑制剂），则仅产生26％的细胞不产生。当添加0.5mm D-NMMA时，加入NOS的非抑制剂，92％的细胞不产生[14.]。

细胞的不产生和释放的越多，细胞变得较为凋亡。添加SNP（10^-6到10.^-2mm）增加了18至75％的细胞凋亡。150克离心产生35％的细胞凋亡。通过添加NoS抑制剂L-NMMA，这降至小于10％。用D-NMMA取代L-NMMA导致细胞凋亡（32％的细胞），但与暴露于150g的细胞没有显着差异[14.]。对氧气连接的NOS要求没有产生的基础诱导和损坏的自由基增加，v。，反应性氧物种和反应性氮气物质[2]。课程学习提供了胍基化合物，因为对无介导的应激和细胞凋亡的对策。

在单位重力和10天后，暴露于SNP的蛋细胞（10^-4mm）产生18毫克紫杉醇/千克鲜重。这种紫杉醇产量现在比没有SNP的控制更高64％。没有SNP的细胞数量比没有SNP的对照量高86.7％。相比之下，添加L-NMMA（0.5mm）的添加降低87.3％。紫杉醇产率降低了75％（4.1mg / kg鲜重）（未发表的结果）。

在单位重力的单独研究中，滤纸上支持的电池，SNP的效果（10^-4MM），钨酸钠（硝酸还原酶抑制剂为1mm），使用L-NMMA（0.5mm）来评估5天后的紫杉醇产率。仅SNP单独添加，或用SNP钨酸盐一起产生紫杉醇，分别在8.0和8.1mg / kg的鲜重，即，差异没有显着差异。这重申硝酸盐还原酶活性不是不依赖于依赖性紫杉醇生产的贡献者。单独的L-NMMA，或加入钨酸盐，将紫杉醇恢复降低至2.1和2.0mg / kg的鲜重量。在这里，NOS负责NO，增加紫杉醇生产而没有硝酸盐还原酶的显着贡献。去除和饥饿控制蛋细胞仅略微增加紫杉醇恢复。

通过环化天竺葵二磷酸的环化来合成紫罗兰二磷酸的四环二萜类环，得到蛋解脂肪酸-4（5），11（12 (-二烯）在塑性体中和光线和黑暗中的[9.那11.]。这种基本环形结构产生超过300种不同的紫杉烷。其中一个读物酶III可以为紫杉醇的生物合成提供环形结​​构。虽然机制尚不清楚，但紫杉醇形成还需要添加源自苯丙氨酸的C-13侧链。紫杉醇的另外和整理结构变化涉及内质网和高尔基堆中的反应。

使用特异性抗体，通过激光共焦和扫描电子显微镜可视化含有特异性紫杉醇环的生物合成，以及结合的紫杉醇和相关紫杉烷的细胞质组装。金标签特别有用，可用于识别运输囊泡，离子术，细胞壁和培养基中的紫杉醇和紫杉烷。用7至21nm敏感性，具有7至21nm的紫杉烷，紫杉醇和博读III的胶体40nm-gold-golicologeled抗体，具有7至21nm的敏感性，具有和无金反向散射（激光共焦和扫描电子显微镜）。

在蛋细胞中，在引力胶质淀粉膜和与塑性膜相关的囊泡中检测到粘藻素III（紫杉烷环）。通过这些囊泡通过细胞质通过细胞质来运输塞拉丁III，紫杉醇和其他紫杉烷，然后将它们的内容物释放到质膜中。移动和停靠在血浆膜上的体积，也将结合的紫杉醇和紫杉烷释放到质膜中。细胞表面的结合的紫杉醇和紫杉烷沉积在新形成的细胞壁中或释放到培养基中。用抗体标记的顺磁珠收集含有结合的紫杉醇，植物素III和紫杉烷的培养基中的药物 - 生产细胞和材料[16.]。在运输囊泡，血浆膜片段和从培养基中回收的材料中检测到免疫偶极标记的紫杉醇，紫杉烷和脱粘蛋白III。

从培养基中的细胞生物量的木聚糖酶（商业和纯化）水解产物，培养基中的碎片，以及树木的木质酶，以及树木的木质酶。使用真实标准，通过HPLC表征和鉴定出紫杉醇和其他紫杉烷。结果表明回收的紫杉醇与木瓜少糖结合。用抗体对木糖葡聚糖的抗体的细胞探针暗示，“触摸”基因通常在机械力下表达[18.]，本可以为紫杉醇和其他紫杉烷提供额外的网站。

在疏水性PVDF（聚偏二氟乙烯）过滤器上回收从细胞中释放的紫杉醇和紫杉烷。环糊精添加到培养基中增强生物质产量，并改变了紫杉烷的溶解度，提高了紫杉醇和紫杉烷的复苏。向培养基中加入环糊精改善细胞生物质和紫杉醇回收[17.]。美国专利中提供了进一步的详细信息[16.-18.那20.]。

如果没有NASA的微普申请No.9-825的支持，这项工作是不可能的。特别感谢Frank Ventimiglia先生在细胞悬浮液中确定和定位紫杉醇。Cristina Pedroso和HelenaGarcōs博士进行了NO，Tunel和Nos相关的研究。博士。H-C Dong和C. Pedroso促成了使用F.Ventimiglia的协议的紫杉醇测定。从中国博士的博士后奖学金助攻与诺和紫杉醇的研究有助于。Dorward博士在国立健康研究院，岩石山实验室准备了扫描电子显微照片。

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1. 加利福尼亚大学植物科学系，一位盾牌Ave，戴维斯，加州，95616，美国

   Don J Durzan.

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