使用RAPD测定法检测UV-B和γ射线诱导植物DNA的突变变化

RAPD（随机扩增的多晶型DNA）分析广泛用于许多生物的遗传映射，分类和系统发育研究。它还可以应用于许多遗传毒剂的影响后检测DNA改变[1]。紫外线辐射可以产生若干主要类型的DNA病变，例如环丁烷型哌啶二聚体和6-4个光调节[2]。通过UV照射还可以诱导蛋白质交联，DNA链，缺失或插入诸如蛋白质交联，DNA链断裂，缺失或插入的另一种重要类型的DNA损伤。虽然，γ射线照射导致DNA断裂形成水平的增加。必须通过RAPD型材的变化来检测这些不同类型的DNA损坏。目前研究的目的是在使用RAPD方法对UV-B和γ射线的影响后探讨植物DNA的可能性突变变化。使用具有单核苷酸取代的10-MEL引物以估计在遗传毒剂治疗后DNA中的这些结构改变。

由苜蓿幼苗约0.20克植物组织，由高剂量的UV-B和γ - 射线照射（LD₅₀)在液氮中冷冻，研杵磨碎，在1.5 ml提取缓冲液(100 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 50 mM EDTA pH 8, 2% SDS, 0.1 mg/ml蛋白酶K)中37℃孵育1.5 h。用氯仿异戊醇(24:1)混合物提取DNA两次。用2体积的冷异丙醇在-20℃下从水相中沉淀DNA 48 h。DNA颗粒通过离心收集，在70°乙醇中洗涤数次，风干后溶解在去离子水中。根据[3.]。使用琼脂糖凝胶电泳分析DNA。

RAPD扩增涉及在94℃下的DNA模板（20ng /25μl反应混合物20ng）的初始变性3分钟，然后在94℃下在94℃下为33个循环，在36℃下，在72℃下2分钟。在Thermocycler“Tertsik”（俄罗斯）。在72℃温育7分钟后完成扩增。表格中给出了具有单碱基取代的10-MEL引物（MedbiosService）的序列1。

在0.5％（w / v）琼脂糖凝胶中分析PCR扩增产物在0.5％（w / v）缓冲液中。将PCR产物（每个样品为25μL）与3-5μL凝胶加载染料溶液（Fermentas，Lithvuania）混合并加载到含溴化乙锭（0.5mKg / ml）上的琼脂糖凝胶上。基因尺寸100bp DNA梯用于每种琼脂糖凝胶。电泳在80V下进行3.5小时，然后在UV光下可视化结果，并使用佳能数码相机记录。

结果表明，10-mer引物的单核苷酸替换确实可以反映在扩增子的谱图上。在RAPD概要中观察到的主要变化在外观上(见图)1)或不同波段的消失(见图)2）它们的强度变化也是如此。这些效果可能与由不同类型的DNA损伤引起的DNA中的结构重排连接。

10-mer引物(OPB 8-1, OPB 8-2)单核苷酸替换对RAPD谱的影响(m-基因标尺100 bp DNA阶梯)1,4——unirradiated控制;2、5- γ-辐照;3,6- uv-b

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10-mer引物(OPB 8-1, OPB 8-3)单核苷酸替换对RAPD谱的影响(m-基因标尺100 bp DNA阶梯)1,4——unirradiated控制;2、5- γ-辐照;3,6- uv-b

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因此，RFLP方法适用于检测不同基因毒性处理后DNA结构的变化。基因毒性处理后，DNA模板中光化学产物的含量与光化学带强度的变化和部分光化学带的消失可能有一定的关系，从而减少了DNA模板的结合位点Taq.聚合酶。由于不同的DNA结构变化（断裂，转置，缺失等）的结果，可以解释新频段的外观。我们可以估计在用掺物血液组中RAPD之后获得的DNA模式的基础后植物DNA的突变和结构改变的存在。显然，RAPD测定的敏感性取决于突变水平，需要进一步调查。

从属关系

1. 乌克兰Zabolotnogo科学院细胞生物学与基因工程研究所植物生物物理与放射学系，基辅148,03143，乌克兰

   Oksana Danylchenko＆Boris Sorochinsky

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对应到无人看管Danylchenko。

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