通过修饰CO触发的光合信号对基因表达的调控₂可用性

背景

为了协调代谢物通量和能量可用性，植物通过相互作用的信号通路调节代谢和基因表达以适应环境变化。

结果

比较拟南芥野生型植株与突变体的反应adg1，pgr1而且vtc1修改原产地证书后₂分别分析了胁迫响应核编码基因和编码光系统I和II反应中心蛋白的psaA和psbA转录丰度与细胞能量状态、光合电子传递、抗坏血酸和谷胱甘肽的氧化还原状态和浓度以及同化力的关系。Bap1、Stp1、psaA和psaB的转录本丰度与7个代谢参数相耦合。特别是对于psaA和psaB，复合物分析表明，假设的依赖于pq的氧化还原控制服从于与3-PGA和DHAP的相对可用性相关的信号，这些信号定义了同化力。对于sAPx和Csd2的转录本，观察到与计算的NADPH的氧化还原状态高度相关pgr1这表明在野生型植物中，依赖于类囊体酸化的信号覆盖了主要的氧化还原信号。2CPA与抗坏血酸氧化还原状态的相关性最强，其转录本丰度调控对抗坏血酸含量几乎不敏感，这表明氧化还原调控的主导地位高于代谢物感知。

结论

在突变体中，信号通路部分解耦，表明光反应中心表达的代谢控制优于感知pq池的氧化还原状态。细胞氧化还原平衡和能量特征之间的平衡调节着sAPx和Csd2转录本丰度，而2CPA的表达主要受氧化还原控制。

光合作用为植物细胞提供同化物，还原能量和ATP。为了协调它们的供应和需求，植物对环境变化的反应时间尺度从毫秒到天不等。除了酶活性的生化调控外，基因表达的控制对于代谢能力的长期调节也是必不可少的。然而，光合电子传递链和叶绿体代谢已经进化为由核和质体编码的蛋白质组成的拼凑物，并依赖于区室之间基因表达的协调。近年来，生理和突变方法研究了代谢物信号的调节功能[1]，能量状况[2]和叶绿体氧化还原信号[3.］．例如，碳水化合物诱导淀粉生物合成相关基因的表达，抑制淀粉降解和碳同化相关基因的表达[4］．与此同时，在质体中，光反应中心的核心亚基和RuBisCO的大亚基的表达被转录的共同调节或上位性抑制。光合产物在生物化学上进一步抑制卡尔文循环[5]并减少NADPH和ATP的消耗，从而导致NAD(P)-系统的还原状态增加和腺苷酸的磷酸化状态升高[6，7］．缺少NADP⁺作为电子受体和通过减少光磷酸化生成高反式类囊体ΔpH减少了系统间电子传递的载体，如质体醌池(PQ)，并刺激ROS的形成[8- - - - - -10］．PQH₂和ROS是控制细胞核和质体基因表达的氧化还原信号[11，12］．NADP下降的组合⁺再生和高类囊体酸化促进紫黄素循环，从而支持植物激素脱落酸的生物合成[13]如果抗坏血酸可用性受限[14］．

植物信号网络在光合产物、氧化还原和能量信号的强烈干扰下进化。因此,在wt区分特定的信号通常是困难的。在此，对于分化，基因表达调控进行了分析wt，在类囊体酸化突变体pgr1［15]，在淀粉-生物合成突变体中adg1［16以及缺乏抗坏血酸的突变体vtc1［17]，以回应条例₂可用性。

pgr1细胞色素b的Rieske亚基突变₆f复合体(PetC;［15])，作为一种质体氢醌-质体青苷还原酶参与光系统II和I之间的电子和质子转移过程。由于Rieske蛋白的pK或氧化还原电位的变化，即使在强光下，突变体的类囊体腔酸化也被限制在pH值6 [18］．因此，突变体改变了ADP的光合磷酸化能力[19]和PsbS质子化[20.]，并可能仅限于紫黄素的去环氧化[21]和循环电子传递[22］．在pgr1，高光强使PQ池的电子压力增加，并释放cytb下游的电子压力₆f复杂。Pgr1由于其在膜给能和光合电子传递方面的局限性，在本次通讯中被选用。

adg1携带adp -葡萄糖焦磷酸化酶的小亚基突变[16］．选择它是因为它改变了碳水化合物代谢。相比之下pgr1,在adg1光合电子传递仅受到碳水化合物诱导的反馈抑制的间接影响[23］．

第三个被选中的突变体，vtc1， gdp -甘露糖焦磷酸化酶发生点突变[17]，在低分子量抗氧化剂抗坏血酸的生物合成中催化前体形成。vtc1本分析包括研究抗坏血酸可用性和抗坏血酸相关氧化还原过程对核和质体基因表达的重要性。

拟南芥wt并在限制CO、环境CO和饱和CO条件下对突变体进行了比较₂浓度。原产地证书以下₂作为补偿点，RuBisCO优先催化核酮糖-1,5-二磷酸的氧化并激活光呼吸，从而触发对ATP的额外需求。每个反应周期，在光呼吸条件下，与同化条件相比，叶绿体NADPH消耗较低。此外，在很低的CO₂浓度、碳水化合物池的消耗可能抑制光呼吸并限制光保护。同时，由于高过氧化物酶体H, ROS负荷增加₂O₂生产和叶绿体超氧化物生成。在环境条件下，30 - 40%的碳通量转向光呼吸CO₂释放，同时饱和CO₂抑制光呼吸，ATP和NADPH的需求接近3:2的比例。同时，细胞的通电和还原状态降低[24］．

这项工作的假设是，与已定义的突变体和改变CO的结合₂光合作用调节的可用性允许解决如何选择的核和可塑性基因的问题拟南芥反应氧化还原，代谢产物和能量信号。

这项工作旨在区分参与基因表达控制的信号。为此目的拟南芥wt和叶绿体淀粉生物合成缺陷的突变体(adg1；［16])，类囊体酸化(pgr1；［15])和主要低分子抗氧化剂抗坏血酸的生物合成(vtc1；［17])，比较其代谢产物模式、光合性能和转录量调控的关系。在环境条件下生长，CO₂有效性在6小时内下降到低于CO的水平₂或升高到RuBisCO饱和，以建立高、低受体可用性和伴随高、低还原压力的光合作用对比条件。

能源状况

在wt在熏蒸6 h期间，无论处理方式如何，ADP含量增加1.5-2倍1)．与此同时，ATP仅在0 ppm CO时积累₂，但在350ppm和2000ppm CO时减少₂．在0 ppm时，ATP/ADP比值基本保持在6左右，但在350 ppm和2000 ppm时，ATP/ADP比值分别下降到2.2和1.8₂(表1)．突变代谢导致特异性的改变wt模式:

在adg10 ppm CO时，ATP和ADP累积量分别为2.2倍和5.5倍₂在350ppm的CO中是1.3倍和1.9倍₂表明总腺苷酸浓度升高，但ATP/ADP比值降低。2000 ppm CO₂ATP含量增加不显著，而ADP含量下降，导致ATP/ADP比值与处理前的初始值相似(表2)1)．

三磷酸腺苷含量vtc1随着CO的增加，略有但稳定地下降₂而在0 ppm CO熏蒸实验前，ADP含量较最低水平增加了6.2倍₂，在350ppm CO中2.8倍₂2000 ppm二氧化碳含量为3.3倍₂(表1)．6 h后，ATP含量高，尤其是ADP含量低，导致ATP/ADP比值从9.8大幅下降至2左右(表2)1)．

pgr1限于类囊体酸化[18］．就像在vtc1， ATP/ADP比值在实验过程中下降到2左右，与CO无关₂应用浓度(表1)．然而，相对减少要少得多pgr1由于ATP/ADP的初始比率已经很低(vtc1: 9.8;pgr1: 2.9)。除ATP/ADP比值普遍较低外，总腺苷酸浓度也较低pgr1提示腺苷酸生物合成与adp磷酸化效率之间存在耦合。ADP含量与土壤中相似wt并没有像0 PPM那样增加vtc1而且adg1(表1)，而ATP含量略有下降，表明腺苷酸浓度的调节存在突变特异性差异，与ATP/ADP比值平行(表1)．

NADP体系的同化力与还原状态

同化力F_一个即磷酸化势[ATP]/[ADP] [P .]的乘积_我]和[NADPH]/[NADP]的比值⁺]，由ddhap /3-PGA比值计算(表1)，在[24］．F_一个表示与消耗需求相比，由光合光反应引起的代谢的能量。这种关系最初是由叶绿体定义的。由于能量与代谢物的耦合，也初步描述了叶片的能量状态[25］．F_一个增加了wt和所有突变体在CO中6 h₂与熏蒸开始时的数值相比(wt: 180%;adg1: 352%;pgr1180%;vtc1: 347%1)表示nadp系统处于高度还原状态(wt: 148%;adg1: 385%;pgr1194%;vtc1:与光照开始时相比增加326%)(表1)．在高CO时₂，即[NADPH]/[NADP .⁺］_calc突变体的比例几乎没有增加wt(175%),adg1(155%)和pgr1(123%)，但在vtc1(366%)与熏蒸开始时的值相比(表1)．计算了高CO时NADP的还原状态₂增加了wt(241%),adg1(152%)和pgr1(153%)，但几乎没有变化vtc1(108%)相对于环境条件(表1)．

CO中3-PGA含量明显下降₂在低CO条件下，自由空气的同化力增大₂（wt: 685%;adg1: 511%;pgr1: 301%;vtc1:相对于环境空气的326%)。在350ppm CO时，3-PGA含量略有增加₂在6 h的处理期间，保持不变wt2000 ppm CO₂在突变体中减少。

抗氧化保护

抗氧化酶和低分子氧化还原代谢产物构成植物的抗氧化防御系统。抗氧化酶活性的改变通常反映了组织氧化还原状态和ROS生成的一般变化，或对特定氧化还原变化的代偿反应[26］．

抗坏血酸含量和氧化还原状态

在熏蒸期开始时，抗坏血酸含量最低vtc11.44±0.31 μmol Asc/g FW反映了抗坏血酸生物合成的突变缺陷[17(图。1)．抗坏血酸水平最高见于wt，中间内容在adg1而且pgr1．在wt环境空气中抗坏血酸含量增加了约1.3倍，但在低CO和高CO环境中几乎没有变化₂．在adg1，以较低的含量开始比wt，抗坏血酸水平在350ppm时增加到高值，在0和2000ppm CO时保持不变₂．在vtc1由于一种主要的抗坏血酸生物合成酶发生突变，其抗坏血酸含量较低，但在CO中抗坏血酸增加了1.3倍₂在350ppm和2000ppm的CO中是2.1倍和1.8倍₂．它最大限度地达到了50%wt二氧化碳含量为350ppm₂．在pgr1在0 ppm时，抗坏血酸含量增加到4.5±0.75 μmol Asc/g FW，在350 ppm和2000 ppm CO时，抗坏血酸含量增加到6 μmol Asc/g FW左右₂．的有限公司₂可得性对抗坏血酸的氧化还原状态影响较小。从熏蒸期开始时几乎完全降低的水平，6小时熏蒸后的平均值表明，0 ppm和350 ppm CO的氧化水平略高(72 - 91%)₂比2000 ppm的二氧化碳含量高₂(图1)．

谷胱甘肽含量和氧化还原状态

谷胱甘肽含量最高，以抗坏血酸含量低为补偿vtc1在熏蒸期开始时。谷胱甘肽含量最低的观察adg1，而谷胱甘肽含量与wt在pgr1．在6小时的熏蒸过程中，所有样品中的谷胱甘肽含量增加到相似的水平和氧化还原状态(图1)．虽然没有显著差异，但平均值表明熏蒸期结束时减少的趋势略高(图1)．

抗氧化酶活性

相比wt3个突变体在高CO和低CO条件下抗坏血酸过氧化物酶活性增加₂．APx活性adg1有两倍于此的记录吗wt环境CO₂浓度(图1)．同时，SOD活性提高1.5倍adg1．比如APx的CO₂有效度对SOD活性影响不大vtc1．SOD和APx活性仅略高于对照组pgr1比在wt而该突变增加了0和350 ppm CO下谷胱甘肽还原酶的活性₂(图1)．令人惊讶的是，在0 - 350 ppm CO时，SOD和GR活性较低₂(图1)．

可溶性糖和水解糖含量

在wt，pgr1而且vtc1的有限公司₂可得性几乎没有改变可溶性糖的可得性，而在adg1，由于叶绿体淀粉生物合成的限制，350ppm CO时糖浓度较高₂比在wt．与此同时，可水解糖的含量通常很低adg1而在高CO时不增加₂．pgr1而且vtc1可溶性糖含量相似且略高于wt所有CO₂浓度。而水解糖的浓度则相对较低vtc1相比pgr1，这可能反映了有限的gdp -甘露糖焦磷酸化酶活性对细胞壁生物合成的影响[27］．一般来说,在wt，vtc1而且pgr1糖水平只在环境CO中升高₂，但不饱和CO₂在高CO的情况下₂，其中卡尔文循环活性应受到刺激，碳同化受到限制或碳水化合物消耗被激活，导致碳水化合物池大小与0 ppm CO时相似₂(图2而且2 b)．

环境空气中的ABA水平

与先前的观察相一致[14]， ABA含量增加2.1倍vtc1相比wt．adg1而且pgr1分别在1.2- 1.3倍的范围内显著增加(图2摄氏度)．

野生型和突变体的光合性能

测试wt而突变体的光合电子传递受到限制，在熏蒸期的最后2小时，植物的光合响应对光强从80 μmol量子m增加到285 μmol量子m增加了3.6倍^－2年代^－1通过监测叶绿素-a-荧光参数(表2)．在环境空气中，光系统II (ΦPSII， (F_米的- f_年代) / F_米的)在标准光照条件下的wt，adg1而且vtc1稍微高一点pgr1．在对增加的光照的反应中，它在pgr1稳态水平为0.31。在vtc1，稳态ΦPSII最高，在wt而且adg1它略低。

在0 ppm时，所有植物的ΦPSII在光强增加之前都急剧下降(表2)．光照强度增加了3倍，ΦPSII进一步下降到0.032 (adg1)及0.093 (wt)表明光合电子传递效率严重降低。

2000 ppm CO₂(表2)， ΦPSII在标准光照条件下最高(F_V/ F_米在0.663和0.734之间)，并且随着光照增加到0.5英寸左右的水平而下降wt，adg1而且vtc1低至0.35英寸pgr1．

转录本水平调控对高、低CO的响应₂

半定量RT-PCR分析至少3个重复，以评估从相应CO开始熏蒸6 h后叶片中选定基因的转录调控₂浓度(图。3.)．相比wt，在350 ppm CO₂可塑性基因的转录水平psaA而且psbA分别编码光反应中心I和II核心亚基的RuBisCO和核编码小亚基的RuBisCO在突变体中没有显著变化adg1，pgr1而且vtc1，反映了适应环境。铁蛋白-1的转录水平被认为是过氧化氢的标记基因[28]在所有突变体中都减少了。相反，Bap1的转录本是单线态氧信号的标记基因[28，在抗坏血酸缺乏突变体中特异性增加vtc1．

3种核编码的叶绿体抗氧化酶Csd2、sAPx和2CPA转录水平均表现出特异突变模式。Csd2和sAPx转录水平wt例如在vtc1，年增加adg1减少了pgr1的2CPA转录水平明显降低adg1．Stp1转录本数量受细胞碳水化合物可利用性的抑制[29]，被加倍pgr1增加了3.5倍vtc1，但在年没有变化adg1．

在adg1而且pgr1比如在wt，两个质体编码基因的转录水平psaA而且psaB核编码红细胞、Stp1、Bap1和ferrtin -1对0和2000 ppm的响应增加。无花果。3.在CO消耗或饱和时给出转录本的修改₂wt和突变体各自归一化到350ppm的水平。在vtc1在350ppm时，Bap1的响应最弱。2000 ppm CO₂治疗vtc1psbA转录本几乎没有增加psaA转录本甚至略有下降，这表明了一种特定的反应模式vtc1到高CO₂．

核编码的叶绿体抗氧化酶Csd2、sAPx和2CPA也表现出特定的反应模式。Csd2对CO的变化几乎没有反应₂可用性。只有在pgr1，其中转录水平在350ppm CO时下降₂， 0和2000 ppm CO均有所增加₂被观察到。在小拟南芥中，随着CO的增加和减少，sAPx转录本减少₂可用性，在大幅下降adg1用2000ppm CO处理₂并且在pgr10 ppm CO时₂．在vtc1，成绩单层面做出了回应wt比如0 ppm的CO₂而在二氧化碳浓度为2000 ppm时呈非典型性增加₂．2CPA抄本显示了之前报告的CO₂依赖项(30.］．的调节幅度增大adg1．高CO₂-response was cancelled inpgr1而在2000 ppm CO时，转录水平反而上升₂在vtc1．

光合活性和代谢依赖于核和叶绿体编码蛋白质的化学计量组合和调控的相互作用[31］．此外，不断变化的环境条件被感知并用于调节光合装置，以平衡能量、还原力和同化物的供应。调控的基本机制涉及基因表达的协调。虽然关于这一主题的各种研究已经确定了候选信号，但相互作用的复杂性和信号的多样性还远远没有被理解。本文根据CO的变化，分析了一组生化和生理数据及转录本₂-可用性，以初步确定潜在的信号依赖关系(表3.)．接近有限公司₂饱和释放了光合电子传递链中的电子压力，增加了PSI下的受体有效性，并降低了光呼吸强度。PSII的高量子产率(表2)表示有效的电子消耗。尽管代谢激活，NADP(H)的细胞还原状态增加wt欠饱和CO₂(表1)．与此同时，ATP有效性降低(表1) [6］．

ros反应基因的调控

在低、环境或高CO环境下照明6小时₂引起转录本丰度的显著变化。0和2000 ppm CO时，铁蛋白-1和Bap1转录本量增加₂表明在高CO和低CO条件下氧化还原失衡和刺激ROS信号₂［28］．这是令人惊讶的，因为电子压力弛豫应该是最大的饱和CO₂同时ROS生成率较低。然而，卡尔文循环的高激活状态需要有效的碳固定在饱和CO₂依赖于高度还原的硫氧还蛋白系统，进而激活氧化还原调节酶[32］．铁蛋白-1和Bap-1转录本水平的升高表明调控的电子引流维持了足够的电子压力，参与了ros相关标记基因的上调。

的有限公司₂在突变基因背景下，依赖性反应发生改变。在adg1， 0 ppm诱导的Bap1转录水平较低，2000 ppm诱导的Bap1转录水平较高(图3.)表明叶绿体碳水化合物储存的限制影响单线态氧信号的响应性。人们很容易假设adg1增加APx和SOD活性(图1)在低CO条件下拮抗Bap1的诱导₂(图3.)的抗氧化保护作用较强，而在2000 ppm CO时转录本积累较高₂由于淀粉生物合成能力不足，碳水化合物抑制光合电子传递。转录本量共调节分析显示，Bap1与抗坏血酸含量相关性最强(K = -0.74;表格3.)．与op den Camp等人的假设一致。[28]，抗坏血酸有效性的拮抗作用以及与抗氧化酶活性的负相关，支持了整体细胞抗氧化能力控制Bap1诱导的结论。因为总谷胱甘肽含量明显降低adg1在开始和结束熏蒸时间(图1)，表明在bap1调控中对Halliwell-Asada-Cycle的抗坏血酸特异性组分具有特殊的调控功能[33］．

相反，对于铁蛋白-1，它被认为是由H₂O₂［28]，与低分子量抗氧化剂的可用性或抗氧化酶的活性没有密切的关系。与水解糖的可用性相关性最高(K = -0.62;表格3.)表明通过碳水化合物代谢进行调节。在编码质膜单糖转运蛋白的Stp1中也观察到与水解糖含量相似的负相关[29］．甚至比铁蛋白-1转录本丰度和Bap1转录本丰度更强的是，Stp1与谷胱甘肽含量和谷胱甘肽池的氧化还原状态呈正相关(表1)3.)表明谷胱甘肽依赖调节。然而,不包括adg1-相关分析的数据表明，至少Bap1和Stp1与谷胱甘肽数据高度相关adg1-特异性调节谷胱甘肽池，因此，也可能是由于叶绿体碳水化合物代谢紊乱所致。

Ascorbate-dependent监管

在全基因组转录分析中vtc1植物，Pastori等。[14]鉴定出171个表达改变的基因，其中防御基因是一个重要的亚群。这里是稳定状态，在350ppm的CO中₂2CPA、Csd2和sAPx的转录水平基本平衡。铁蛋白-1转录水平甚至降低。随着CO的变化，Bap-1的转录水平增加了3.73倍，且构成性较高₂-可用性，表明转录本丰度主要由抗坏血酸生物合成的突变缺陷调节。

Bap1、Fer1、rbc和Stp1的转录水平与抗坏血酸含量呈不同程度的负相关，与还原状态呈正相关。显然，代谢诱导的抗坏血酸水平的改变引起了与抗坏血酸生物合成中的基因突变相似的转录变化[14］．在我们的分析中，抗坏血酸和防御基因表达之间的相关性更强时的数据集vtc1-突变体不包括在内(K = -0.67)vtc1硬化反应可能会掩盖由CO变化引起的信号₂可用性。

在2CPA中，抗坏血酸的还原状态和转录水平调控之间的关系最强。在以前的实验中，抗坏血酸应用后观察到2CPA转录的强烈抑制[29，34，35］．在这里，我们分析了抗坏血酸含量内部变化的反应。强负相关(- 86%;表格3.)与抗坏血酸还原状态相关，与抗坏血酸含量无相关性(K = 0.23;表格3.)排除感知抗坏血酸可用性。据推测，脱氢抗坏血酸或更可能的是脱氢抗坏血酸还原过程中的电子消耗调节2CPA转录本丰度。

转录本丰度调控耦合

一组基因Bap1、psaA、psbA和Stp1对谷胱甘肽含量和还原状态、3-PGA和DHAP含量、计算的NADPH还原状态和同化力、水解糖等7个代谢参数均表现出相似的转录模式(表1)3.)．应该注意的是，psaA和psbA的转录水平在对施加的代谢和突变菌株的反应中平行变化。这对比了psaAB和psbB在转移到先前Pfannschmidt等人描述的光系统I和ii特定光体制时观察到的反平行响应。[11］．结果表明，CO在0 ~ 2000 ppm之间变化₂在突变背景下，在非常低的光子通量密度下，比改变光质量从红色到远红色引起更严重的代谢和信号传递变化[11］．然而，随着CO的增加，电子压力降低，光系统I转录本psaA相对于光系统II转录本psbA减少₂可用性(图3.)，例如从1.07 (0 ppm)至1 (350 ppm)至0.88 (2000 ppm)wt这表明在0 ppm CO中PS-I反应中心蛋白的基因转录更强₂以及在2000 ppm CO中编码PS-II反应中心蛋白的基因₂．在adg1时，逐渐反应不受影响，但通常情况下，psbA的转录本丰度高于psaA(图3.)．在pgr1相对转录丰度归一化为wt在这三种CO下，350 ppm的含量也更高₂这表明较高的psbA转录水平是由光抑制高碳水化合物可用性或Rieske活性的限制引起的。

人们很容易认为这种信号是由依赖pq的氧化还原信号传递的。然而,在vtc1更多的psaA比psbA在350ppm的CO₂，在0 ppm CO时，psaA/psbA比例平衡₂在2000ppm时的反向比值，表明抗坏血酸的可用性影响转录物的化学计量，因为光反应的中心是CO的变化₂可用性。用350ppm CO熏蒸6小时后₂， PS-II的稳态量子产额((F_米的- f_年代) / F_米的)是wt如(表2)，而光强加倍后，在4.5 min的光照下，量子产率提高1.23倍(表2)．在抗坏血酸可用性降低的背景下(图2)这表明光合作用电子传递链是受到保护的。叶绿素荧光分析表明，在低CO条件下，驯化不足以保护光合膜₂．PS-II的低量子产率2)表现出更强的光合作用损伤wt．PS-II的量子产率调控与psaA/ psba比值无关，这支持了光反应中心蛋白转录本丰度调控更依赖于抗坏血酸特异性信号而不是pq池的氧化还原状态的假设。pannschmidt等人假设的依赖pq的长期驯化反应[11]似乎进一步服从于与PGA和ddhap浓度代谢状态相关的信号，即NADPH/NADP⁺比例，同化力和水解糖(表3.)．在adg1可溶性糖浓度与psbA转录本水平呈极好的正相关(K = 1)，其他系呈高度负相关(wt: k = -1;pgr1: k = -0.96;vtc1: K = -1)，强调碳水化合物依赖信号在psaA和psbA调节中的重要性。

与腺苷酸状态相关

在动物中，通过胰岛素样生长因子1或amp依赖性激酶感知的能量状态在基因表达调控中发挥重要作用[36］．然而，除了2CPA仅有微弱的相关性(K = 0.41)外，没有发现腺苷酸状态与转录水平之间的相关性。由于植物的光自养性质，植物很少遇到能量剥夺。此外，叶绿体和细胞腺苷酸状态通过反馈和前馈机制直接协调代谢途径[37］．缺乏强能量连锁调控说明腺苷酸磷酸化状态可能不是一个主要信号，它直接与光合作用背景下核基因表达的调控有关。

然而，分析pgr1Csd2、sAPx和2CPA在CO改变时表现出突变的特异性调控₂可用性(图3.)．因为pgr1由于Rieske蛋白突变，无法使pH值低于6的类囊体腔酸化[18]时，ATP/ADP比值在早晨非常低，且不论CO含量如何，均普遍下降₂浓度(表1)．大多数代谢物的浓度对CO的改变没有显著的响应₂可用性比较wt表明有效的代谢补偿(图3.)．Csd2、sAPx和2CPA转录水平以突变特异性方式调控，rbc、Bap1、Fer1和Stp1转录水平响应wt比如证明ROS-和碳水化合物信号通路未受影响[28，29，38］．不同的处理方法pgr1sAPx的转录丰度与NADPH的还原状态高度相关(K = 0.99)，而其他株系的转录丰度与NADPH的还原状态不相关。因此，Rieske蛋白的突变限制了sAPx表达的精细控制，使其更依赖于基质氧化还原信号。sAPx调控之间的差异pgr1而且wt也证明了wtRieske蛋白影响sAPx的表达。不包括ros信号，因为Bap1控制是wt例如，PQ池的氧化还原状态或类囊体酸化/腺苷酸状态均可调节sAPx转录丰度。

在所有处理下，Csd2转录水平与APx活性呈正相关(表2)3.)．与此同时,在pgr1，也与NADPH的氧化还原状态几乎完全相关。与sAPx相比，Csd2转录水平受到更高幅度的调控。sAPx和Csd2转录本编码两种重要的叶绿体抗氧化酶，分别作用于超氧化物和H₂O₂哈利韦-浅田循环(抗坏血酸依赖水循环)基质部分的解毒作用[33］．转录本丰度的协调调控指出了表达的共同调控。

在细胞中，代谢物、氧化还原和能量信号紧密相连，这使得信号级联的分化很困难。这项研究表明，在植物驯化协调方面具有特定限制的突变体的比较至少会暂时解除信号分支的偶联。的比较adg1，pgr1而且vtc1拟南芥野生型植物中Bap1、psaA、psaA和Stp1的协调表达，之前已经讨论过它们对单线态氧的特异性反应[28]，即PQ池氧化还原状态[11]和单糖可用性[29),分别。与铁蛋白-1一样，Bap1和Stp1与抗坏血酸含量的相关性最强，而psaA和psbA与同化力和NADPH/NADP的相关性最强⁺比率。2CPA表达的相关性，其转录受光系统I中受体有效性的控制wt［30.]，抗坏血酸池的氧化还原状态进一步加强了抗氧化系统与光合电子传递之间的联系，更具体地说，是叶绿体-核信号。据推测，在进化过程中，已经形成了一个稳定的网络，将光合代谢与核基因表达联系起来。突变体在标准条件下可能会很好地平衡，但环境变化的应用导致了适应的改变wt，可以初步区分平行诱导信号级联。

植物材料和生长条件

拟南芥wt(Col-0)突变体adg1［16),pgr1［15),vtc1［17]在光照10 h、100 μmol量子m的控制环境中生长^－2年代^－1， 23°C和14 h黑暗在18°C;50%相对湿度)在Frühsdorfer Erde Klocke P，珍珠岩和蛭石1:1:1的混合物上进行5周。光照后2小时开始，盆栽(wt，adg1，pgr1而且vtc1)在28升有机玻璃室或5升Sekuroka中用合成空气熏蒸6小时^®0和2000 ppm CO的手套袋₂，或保持在环境空气中。Millipore Tylan RO 7030系统控制气体流量为2 l/min。

代谢物的分析

总抗坏血酸和还原性抗坏血酸根据[39通过记录添加抗坏血酸氧化酶后在265 nm处的吸收下降，从冷冻在液氮中的植物材料中提取。从0.1 M HCl和5 mM二乙基三胺五乙酸中提取的组织中，用“反相”Hypersil BDS-C15 5 μm色谱柱进行衍生化后荧光法测定谷胱甘肽含量[40］．根据Dietz & Heber方法测定高氯酸提取物中3-PGA和DHAP的含量[41]， ATP和ADP与萤火虫酶根据凯撒和Urbach描述的发光测量方法[42］．同化力和nadph还原状态的计算如Dietz & Heber [24］．可还原性水解糖和可溶性糖根据Yemm & Willis测定[43用蒽酮试剂。ABA含量按照Weiler [44从冻干的叶子材料中提取。

Chlorophyll-a-fluorescence测量

CO发作后4-6小时₂熏蒸后，突变体对光强增加到285 μmol量子m的响应^－2年代^－1使用Mini-PAM荧光计(Walz, Effeltrich, Germany)监测4分钟。285 μmol量子m照射前后30 s^－2年代^－1，荧光参数F_年代和F_米的［45]用饱和光脉冲(1s;>3000 μmol量子m^－2年代^－1)．PS-II (ΦPSII)的量子产率计算为(F_米的- F_年代) / F_米的．

蛋白质含量测定及酶活性生化分析

酶活性测定依据[34]并对用BIORAD蛋白质测定法测定的样品的蛋白质含量进行标准化(BIORAD实验室，München，德国)。

RNA分离、cDNA合成及RT-PCR分析

用500 μl苯酚和300 μl氯仿，在500 μl Tris-HCl、pH 8.5、25 mM EDTA、25 mM EGTA、100 mM β-巯基乙醇和2% SDS中提取100 mg左右的植物粉末。先用1ml苯酚/氯仿(1:1)重新提取水相，然后用1ml氯仿，在4℃下加入1ml异丙醇沉淀RNA。为了进一步纯化，沉淀物溶解在10 mM Tris, 1 mM EDTA中，用3体积8 M LiCl重新沉淀，并用70%乙醇洗涤。用分光光度法测定溶解在depc处理水中的RNA。用RNase-free DNase (1 U;Promega)。在cDNA合成之前，通过添加EDTA至最终浓度为2.5 mM并在70°C下孵育20分钟来灭活DNase。使用5 μg DNase处理的RNA进行cDNA合成，使用寡核苷酸(dT)和含有与所有质体编码基因匹配的寡核苷酸混合物的引物混合物作为引物[46在42°C下放置1小时。以肌动蛋白-2转录本量为标准。通过半定量RT-PCR (PCR设置:94°C, 3分钟，1个循环，优化循环次数:45 s 94°C, 30 s 50°C, 15 s 72°C)分析感兴趣的基因。PCR产物在溴乙锭染色的琼脂糖凝胶上分离后，用密度法定量[34］．使用肌动蛋白特异性引物，根据相同cDNA获得的强度对每个条带进行归一化。引物和基因编码如下:肌动蛋白(At5g09810)义5'-TACAACGAGCTTCGTGTTGC-3'，反义5'- ggacaacggggaatctctcagc -3';psbA(AtCg00020)义5'-GAAAATCAATCGGCCAAAAT-3'，反义5'-TTACCCAATCTGGGAAGCTG-3';psaA(AtCg00350)义5'-GATCTAATCCGCCACGAAAA-3'，反义5'-CAGGTGGTTTGGCCAATAGT-3';红细胞表面(所有异构体)义5'-AGAAGTAATGGCTTCCTC-3'，反义5'-AAGCTTCGGTGAAGCTTG-3';Csd2(At2g28190)义5'- ctccgttcctcagc -3'，反义5'-GCGTCAAGCCAATCACAC-3';2注册会计师(At3g11630)义5'-CTCTCCATCTGTTTCTTT-3'，反义5'-GTACCTTTTTCGTATCAT-3';sAPx(At4g08390)义5'-TGTTCCAGTTAGCTAGTG-3'，反义5'-GGTTGAGTAAATTAGGTGC-3';Fer1(At5g01600)义5'-ATGGCCTCAAACGCACTCT-3'，反义5'-CTAGTCCCTTCATAGCAACG-3'，Bap1(At3g61190)义5'-CTAAACCGGAGACCCATC-3'，反义5'-AGTGACCTTCAGGTGAATAC-3';Stp1(AT1g11260)义5'-TTCTTTCAACAGCTAACCGGA-3'，反义5'- ggctaatacactttttcctta -3'。

统计分析

从计算的平均值和标准差中，用Student's来确定差异的显著性t测试。数据集被指定显著不同，如果P值低于0.05。系数分析采用Pearson相关分析。高于r = | 0.6 |的系数定义为强相关，高于| 0.3 |与| 0.6 |的系数定义为弱相关。

2 cp:

2-cysteine酶类

3-PGA:

3 -磷酸甘油酸

APx型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

互补脱氧核糖核酸:

DNA复制

Csd:

铜/锌超氧化物歧化酶

DEPC:

焦碳酸二乙酯

DHAP:

二羟丙酮磷酸

F_一个：

同化的力量

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

PQ:

质体醌

插件可以:

酶类

PS:

光系统

ROS:

活性氧

rt - pcr:

逆转录成cDNA后，聚合酶链反应扩增转录物

二磷酸核酮糖羧化酶:

核酮糖1 5 5-bisphosphate,羧化酶/加氧酶

SOD:

超氧化物歧化酶

wt：

野生型

这项工作是在DFG资助的FOR 387 (TP1, TP3和TP10)框架内进行的。

从属关系

1. 植物生物化学与生理学，比勒费尔德大学W5，比勒费尔德，33501，德国

   Dennis Wormuth, Margarete Baier, Andrea Kandlbinder和Karl-Josef Dietz

2. 植物生理学，Osnabrück大学，FB 5, Osnabrück, 49069，德国

   雷麦克尔

3. 分子植物生理学与生物物理学，Julius von sachs研究所für Biowissenschaften, Würzburg, 97082，德国

   Wolfram哈

相应的作者

对应到Karl-Josef迪茨．

作者的贡献

DW进行了代谢产物分析，大部分基因表达分析，进行了统计分析，并参与了稿件的撰写。MB为基因表达分析做了前期准备工作，进行了叶绿素-a荧光分析，参与了项目的设计和验证，并参与了稿件的撰写。AK参与转录本分析和项目开发，并帮助完成稿件，RS提供技术支持和讨论，WH确定aba内容，K-JD作为主要研究者协调项目，参与数据解读和稿件撰写。所有的作者都同意最终的手稿。

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