基于微卫星的物种共识连锁图桉树并获得了一套新的230个微卫星标记

背景

桉树是世界上种植最广泛的硬木树木，全球面积超过1800万公顷，是碳中性可再生能源的重要来源，也是纸浆、纸张和实木的原材料。数量性状位点(qtl)桉树已经在谱系特异性的RAPD或AFLP图谱上进行了定位，这严重限制了这种QTL图谱在分子育种中的价值。获得具有可转移微卫星标记的全属遗传图谱已成为有效推进基因组事业的必要条件。本报告介绍了EMBRA开发的一套230颗新型微卫星，构建了首个基于共识的综合微卫星联动图桉树并巩固了该属其他物种中其他微卫星和候选基因的现有连锁信息。

结果

共识图谱涵盖了重组基因组的~90%桉树，涉及11个连锁群上的234个EMBRA位点，观测长度为1568 cM，标记之间的平均距离为8.4 cM。所有微卫星联动信息汇编发表于桉树允许我们在这个共识图和其他发表的地图之间的链接组之间建立同源性e .桉．对比作图分析还得出了其他41颗微卫星的链接群分配桉树以及已发表的木材和开花性状的候选基因和qtl。本报告显著增加了微卫星标记和测绘信息的可用性桉树证实了该属种间微卫星侧翼序列和位点排序的高度保守性。

结论

这项工作代表了向前迈出的重要一步桉树比较基因组学，为进化研究和分子育种应用打开刺激的前景。越来越多的种间可转移标记和共识作图信息的广泛使用，将允许更快和更详细地研究物种间QTL同向性，在不同遗传背景下验证表达-QTL，并定位越来越多与QTL共定位的候选基因，这些都将在关联作图实验中进行测试。

桉树是世界上种植最广泛的硬木树，全球面积超过1800万公顷[1］．而e .桉是葡萄牙、西班牙、智利和澳大利亚温带种植园的首选物种，精英杂交无性系涉及大肠茅而且大肠urophylla巴西、南非、印度和刚果热带地区的纸浆和造纸工业广泛使用，因为其木材质量好、生长迅速、抗溃疡病和产量高[2］．

基于快速而廉价的优势RAPD和AFLP标记的生成以及两代系谱的伪测试杂交策略的结合，在90年代初，几种森林树种可以进行遗传作图[3.，4]或利用针叶树的单倍体遗传学[5- - - - - -7］．伴随着这一发展，共显性标记的连锁图谱导致了少数物种的综合RFLP图谱的构建[8，9]以及比较映射的可能性[10，11］．然而，人们很快就清楚了，跨谱系QTL验证的真正进展，以及最终在林木中的标记辅助选择，将在很大程度上依赖于更高通量、更高多态性分型系统的可用性，如在密集遗传图谱中组织的微卫星[12，13］．在过去的几年里，一些研究报告了几百个RAPD和AFLP标记以及几十个EST、基因和微卫星(例如[14- - - - - -20.])。据报道，大约有100个微卫星的链接地图松果体taeda［21),杨树［22］．然而，为了更精确地比较QTL位置和验证谱系间假定的QTL，更大的微卫星集显然是必要的。

迄今为止，已有137个常染色体微卫星标记被发表桉树，包括12个来自e .桉以EMCRC为前缀命名[23]，八个来自大肠nitens，八从大肠sieberi， 26岁e .桉13个来自大肠leucoxyon分别以En、Es、Eg和El前缀命名[24- - - - - -27]和70 from大肠茅而且大肠urophylla命名为EMBRA [12，15］．近年来，我们在叶绿体DNA全序列的基础上，开发了一套35个叶绿体DNA微卫星e .桉［28］．亚属物种间的微卫星可转移性Symphyomyrtus根据它们所属的部分，变化在78到100%之间。对于不同亚属的物种，比如Idiogenes而且Monocalyptus在相关属中下降到25%Corymbia［29］．微卫星对比制图数据也显示了同一亚属物种间的基因组同源性Symphyomyrtus不仅在微卫星侧翼序列守恒方面，而且在连锁图上的标记顺序方面都非常高[30.］．尽管在RAPD标记的框架图上绘制了70颗微卫星[15]， 34关于AFLP标记的框架[30.]和40个组合RFLP和候选基因图谱[17]，属桉树目前还缺乏专门用微卫星标记建立的更全面的基因图谱。

一些QTL作图报告已经证明了一些与森林栽培和工业相关的性状存在主要效应QTL桉树［31- - - - - -39］．最近，对木质素相关基因转录水平的QTL分析表明，它们的mRNA丰度由两个与QTL共定位的基因位点调控，这表明相同的基因组区域调控着生长、木质素含量和组成[40］．在随后的研究中还表明，一个单一的eQTL可以解释超过800个基因的70%的转录水平变化，并且识别出具有共定位表达qtl的热点通常包含与特定代谢和调控途径相关的基因，这表明协调的遗传调控[41］．

虽然QTL检测报告的数量在桉树随着QTL定位的日益复杂，绝大多数QTL定位在RAPD或AFLP图谱上，因此基本上不可能比较相同或相关性状的QTL位置，这严重限制了这种QTL定位工作在基因组学和育种应用中的长期价值。例外情况是QTL研究中可转移的标记，如一些微卫星[30.，38]或候选基因[14，38]，因此至少有可能在连锁群水平上对QTL位置进行粗略的初步比较。尤其是在属中桉树世界各地的育种家通过杂交利用木材特性和抗病性的种间遗传变异，获得具有高度可转移微卫星标记的强大的全属遗传图谱已成为基因组事业有效推进的必要条件，包括跨谱系的QTL验证，QTL共定位和指导关联作图实验的候选基因。定位克隆qtl，最终标记辅助选择。

本工作报告构建了覆盖所有11个遗传连锁群的共识遗传连锁图谱桉树据我们所知，这是迄今为止最完整的基因图谱桉树以及迄今为止完全基于种间可转移微卫星的森林树木。除连锁图谱外，还报道了230个新的微卫星标记，其中35个标记被选为锚位点，用于图谱信息内容的表征。最后，基于一套与其他微卫星共享的方案桉树图谱研究，进一步的41个微卫星，候选基因和开花性状的qtl被分配到共识图谱中，使其成为现有物种连锁信息的第一个统一来源桉树．

微卫星多态性桉树

从十大肠茅设计了多(AG)和多(AC)重复序列富集文库，共450对引物与微卫星侧翼序列互补。其中70个已被绘制、表征并已发表引物对序列[12，15］．在这项工作中，对剩下的380个引物对进行了PCR扩增的稳健性测试，然后在映射群体中筛查多态性、遗传和分离(图1)．虽然所有引物都设计在相同的退火温度(56°C)下扩增，但在48°C到60°C之间进行一些优化是必要的，以提高基因型的解释。在评估的380个标记中，230个产生了可靠且易于解释的基因型，可以令人满意地用于个体基因分型和遗传作图。其余150对引物要么不扩增，甚至降低了退火温度，要么可能由于非特异性扩增而扩增出复杂的分离模式。在230个新标记中，167个(即73%)在一个或双亲中杂合，允许分离分析，63个(27%)在这个特定的种间谱系中没有分离。167个多态微卫星标记引物对将171个分离位点扩增为4对引物(EMBRA134、EMBRA154、EMBRA218、EMBRA231)扩增的重复位点在图上用字母(a)和(b)表示(图)2)．用同一引物对扩增的两个位点映射到不同的连锁群，由此推断位点重复。附加文件1总结了本研究中报道的230个标记(EMBRA71至EMBRA395)以及较早发表的标记(EMBRA1至EMBRA70)的所有信息[12，15]，包括设计微卫星引物对的原始序列的Genbank登录号。

微卫星分离与连锁分析

构建共识图谱时使用的237个隔离标记(167个来自本研究，70个来自早期发表的[12，15]共有241个分离位点，因为检测到4个位点重复可映射。在这241个位点中，有234个位点可被高置信度地绘制出来(图2)．由链接组组织的亲本图和共识图的主要属性的描述性摘要被编译(表1)．在这项研究绘制的234个标记中，74个仅为女性(大肠茅)资讯丰富，32名男性(大肠urophylla)信息。共有128个(55%)是完全信息性的，即与父母双方分离，共有3或4个不同的等位基因。没有观察到1:2:1的分离标记，即在双亲中同样杂合。然而，在128个充分提供信息的标记中，只有122个可以放在共识地图上。6个标记，虽然与双亲分离，但无法在共识地图上定位。这些标记，在地图中用下划线表示(图2)，分别为EMBRA21、EMBRA147、EMBRA055、EMBRA111、EMBRA216和EMBRA218a。对于这6个标记，在亲本中至少检测到一个空等位基因，可能是什么阻碍了它们的整合映射。事实上，在241个分离标记位点中有20个观察到零等位基因的存在，即一个或两个等位基因在位点上没有扩增。20个缺失等位基因的微卫星中，有12个是纯合缺失的大肠urophylla但是放大了两个等位基因大肠茅；有4个标记在父母双方均有至少1个空等位基因大肠urophylla纯合的:在两个位点上为零的;3个为杂合子缺失大肠urophylla只有一个标记有一个空等位基因大肠茅不是在大肠urophylla(表2)．零等位基因的总体频率为241个位点中的5个大肠茅在241年有19个大肠urophylla．观察到较高的杂合度大肠茅与父树相比大肠urophylla．共有208个标记为杂合子大肠茅166个大肠urophylla．即使不考虑14个没有放大的微卫星标记大肠urophylla(为纯合子null)，大肠茅仍然会显示194个杂合标记，即比大肠urophylla．这种观察到的杂合度差异最有可能是由于特定亲本的不同近交状态，而不是物种特征。

链接图构建

在采用统计严格度进行连锁分析时，母系大肠茅图谱上共有202个标记，分为11个连锁群和父系大肠urophyllaMap在12个连锁群中标记数量较少，为160个，比预期数量(n = 11)多1个。这个额外的基团是一个由三个标记组成的集合，它们映射在第4个连锁基团的末端大肠urophyllaLOD阈值低于3.0。这三个标记很可能属于这一组，但将需要更多的标记来将它们一致地连接到第4组。七个标记虽然提供了信息，但在仅用微型卫星绘制的地图上仍然没有联系。这些标记分别为:本研究报道的230个新标记集中的EMBRA94、EMBRA96、EMBRA103、EMBRA163、EMBRA178、EMBRA190，以及先前映射到第11连锁群RAPD标记框架中的EMBRA62大肠urophylla在Brondani等．［15］．EMBRA62与本研究构建的图谱没有关联，可能是由于第11组微卫星标记的密度非常低大肠urophylla(图2)．

有202个标记的女性地图覆盖了1814.5 cM的观测长度，相邻标记之间的平均距离为10.7 cM，这是每个连锁群中相邻标记之间的地图距离的算术平均值，而不是简单地用地图总长度除以标记数量。为大肠urophylla重组图覆盖的总距离为1133.4，相邻标记之间的平均距离为9.2。配对t检验显示相邻标记间的平均重组分数无显著性差异大肠茅9.2分大肠urophylla——表1)，以比较两个亲本图谱。较大的观测到的总地图长度大肠茅因此，与之相比，最可能的原因是映射的标记数量(202)更多吗大肠urophylla(160)。共识图的观测长度为1567.7 cM，标记间平均距离为8.4 cM。共观察到19个遗传距离大于20 cM的图谱区间，分布在除第1和第4组外的几乎所有连锁群中，但只有5个区间大于30 cM，这表明仅使用微卫星标记时获得了相对均匀的图谱覆盖。虽然没有进行正式的聚类测试，但在亲本图和共识图上都观察到标记的聚类，特别是在第2、5和7组。然而，有趣的是，当使用同一组子代的RAPD标记构建这些连锁群时，也观察到标记的聚类[4，这表明了这种现象的生物学基础。

估计的基因组长度(G_{美国东部时间})为1683 cM，而观测长度(G_{奥林匹克广播服务公司})为1,567.7(表1)，导致观察到的基因组覆盖_{奥林匹克广播服务公司}= 93%。Lange和Boehnke(1982)利用方程得到的共识图谱的理论预期基因组覆盖率估计为C_经验值= 88.6%。

在11个连锁群中，两个亲本图谱的共有标记数量呈异质性。例如，对于有22个标记的连锁组1，有14个标记在亲本图谱和共识图谱上映射，而对于有21个标记的连锁组6，只有2个标记在亲本图谱和共识图谱上映射2)．

卡方分析显示，在241个微卫星位点中，有29个(12%)在alpha≤0.05时偏离了预期的1:1:1:1:1或1:1分离比，但只有一个(EMBRA81)在应用Bonferroni校正后仍然显著。除了第6组的EMBRA81之外，所有这些标记都可以自信地放置在共识地图上。16个扭曲标记主要聚集在2个连锁组(组2和组8)，其余14个分散在8个连锁组(图2)．

比较映射

所映射的122个信息充分的标记，允许对该连锁群的同源对进行鲁棒性鉴定大肠茅而且大肠urophylla基因组。无一例外，所有微卫星标记在一个物种的同一连锁群上也在另一个物种上映射。我们观察到，尽管对相同的微卫星标记观察到的重组频率的两点估计中约有17%差异很大(平均相差25%)，但在两个亲本图之间观察到位点顺序的守恒，82%的标记沿单个连锁群映射具有相同的线性顺序。通过连接父映射和共识映射的虚线，可以很容易地看到这种保守的线性顺序(图2)．序列变化很少发生，涉及到一个或两个标记与同一类群中的其他标记以不同的顺序映射，如第1组中的EMBRA92，第8组中的EMBRA30和EMBRA132，或第4组中的EMBRA156和EMBRA170。在第9组和第10组中观察到更高水平的标记顺序乱置，可能是由于该组中的几个标记仅从亲本中的一个或另一个分离出来。在大肠茅在可供比较的172个标记中，有153个(89%)在共识地图中保持相同的顺序。在大肠urophylla在美国，152个标记中，有140个(92%)的顺序与美国相同桉树共识地图。三幅地图上的122个标记具有可比性，其中85%的标记顺序相同。在两个物种之间没有发现染色体块重排的证据。正如预期的那样，共识图谱的大小介于雌性(1814 cM)和雄性(1133 cM)亲本图谱之间(1567 cM)。

微卫星多态性

由于可转移性和易于解释，我们确定了35个标记作为锚位点的遗传多样性，以指导未来的作图实验(附加文件2)．两个物种在这些微卫星标记上的平均等位基因数相近，分别为10.61±3.05大肠urophylla10.66±2.59大肠茅，它们之间有50%的等位基因共享，另外50%的等位基因只出现在一个或另一个物种中，这很可能是由于采样效应，尽管这表明这两个物种之间确实存在重要的微卫星等位基因频率差异。这些频率差异增加了检测标记分离的概率，从而为QTL作图提供了更多的信息。标记EMBRA201的多样性最高，最初是一个17个二核苷酸重复序列，在64个染色体样本中显示22个等位基因。两种植物共检测到8 ~ 22个等位基因，最大等位基因大小为320 bp，最小等位基因大小为75 bp。35个位点的平均观察杂合度约为66%，而预期杂合度较高，约为85%。这些结果与在自然居群中存在小水平的自交和/或相关的交配是一致的桉树．

微卫星联动信息汇编

基于在其他连锁研究中绘制的EMBRA标记桉树，可以建立该共识图的连锁群与其他已发表的连锁图的连锁群之间的同源性(表3.)．该分析允许对其他实验室和来自不同国家的其他41颗微卫星进行链接群分配桉树种:4个EMCRCe .桉26颗微卫星e .桉(Eg)，七从大肠nitens(恩)还有四个来自大肠sieberi(Es)。此外，Thamarus等人先前绘制了18个木材纤维和花卉性状的候选基因。[17]也可以被分配到这张共识地图的组中。

在此之前，在植物物种遗传图谱的构建方面取得了重要进展桉树．尽管一些RFLP标记被映射进来大肠nitens［9),e .桉［17]，积累了最广泛的遗传作图数据，主要以优势RAPD和AFLP标记为主[4，42- - - - - -45］．虽然RFLP标记在个体、物种甚至更远的分类群之间的比较作图是有用的，但高通量基因分型、探针分布和维护是困难的。另一方面，RAPD和AFLP标记虽然可以生成数百个标记，并提供非常好的基因组覆盖，但信息含量有限，对于跨谱系和物种的比较作图研究和QTL验证几乎毫无用处。本文报道的230个新微卫星标记，与之前报道的70个标记相加[15]，总共有300颗相对较大的微型卫星，应该可以在这方面取得重大进展桉树遗传研究。此外，所提出的连锁图涉及234个位点，估计覆盖了重组基因组的90%桉树这是迄今为止完全基于微卫星标记的最全面的森林树木遗传连锁图谱。

微卫星的发展

整合自我们最初研究以来的所有发展和筛选数据[12]，从设计的450对引物中，我们获得了300个可操作可用的标记，即标记开发的最终效率为67%。在这300颗微卫星中，我们能够在237颗(即79%)的特定测绘种群中检测到多态性和孟德尔分离。虽然目前还没有发表的研究对其他领域的大型微卫星标记进行详细评估桉树在谱系中，当热带桉树的子代在该段内进行基因分型时，可以获得类似比例的信息性标记Latoangulatae共生菌亚属。事实上是在密西西比等．［46能够轻松地选择100个分布在地球各地的信息微卫星桉树地图上的十字大肠茅×大肠urophylla杂交亲本的QTL定位。将微型卫星转移到其他商业上重要的物种，比如e .桉(部分Maidenaria)或大肠camaldulensis(部分Exsertaria)首先是可转让性问题，然后才是信息内容问题。而在早期的一项研究中，基于100颗微型卫星，我们指出，可转移性为78%大肠茅来大肠dunni(部分Maidenaria) [29]，对可转让性和信息内容的估计仍然局限于基于测绘的一些微型卫星的报告e .桉［17，44),大肠camaldulensis［47]和一个稍微更广泛的研究，包括e .桉而且大肠tereticornis［30.］．然而，这些研究加在一起表明，这300颗微型卫星的可转让性Symphyomyrtus尤其是跨区域Maidenaria在哪里e .桉而且大肠nitens归属，应该保持在80%左右。一旦可靠地转移，很可能会以与本研究中相似的比率检测到多态性，即70%至80%。因此，除了其他小组发表的67个微卫星标记外，这套完整的300个EMBRA微卫星标记应该可以在涉及水稻种植最多的任何种的任何分离科中定位200个或更多的信息性标记桉树．

除了微卫星，其他基因标记的来源，如EST、基因基和SNP已被发现。14，17]并且可能会越来越多地被映射到地图中桉树为定位克隆和关联作图实验提供重要的锚定位点和候选基因。然而，这些标记需要基于单核苷酸多态性分析的高通量分型技术，才能在谱系间广泛应用。微卫星的其他来源对迄今尚未考虑到的基因组区域取样也很重要。例如，93个可操作的微卫星来自对3兆碱基的鸟枪DNA的样本测序研究桉树茅［48］．EST衍生微卫星是新型微卫星的另一个重要来源。利用Genolyptus项目中构建的大型EST数据库[49]我们一直在迅速扩大目前映射在一组参考谱系上的标记的数量。在这方面，必须指出三个重要方面:(1)est衍生的微卫星将有效补充从丰富的基因组文库中对地球不同部分进行采样而开发的微卫星桉树基因组;(2)转录区域的微卫星，特别是5'-UTR等非翻译区域的微卫星，在进化上应该比非编码区域的微卫星更古老，因此在一些主要单子叶和双子叶物种的调查中报告，它们应该更具多态性[50];(3) est衍生微卫星的基因图谱将利用转录信息丰富该图谱，为qtl和候选基因在高重组区域的共定位开辟了前景。

桉木微卫星特征

能够整合亲本图谱的信息丰富的标记一直被认为是更详细地研究森林树木QTL等位基因间相互作用的关键因素[51］．伪测试交叉设计和标记的全信息性显然是相互排斥的。基于RFLP的标记确实揭示了这种3或4等位基因的分离，但还没有达到可以对如此详细的QTL属性进行全图分析的程度。在桉树、33%、36%的全信息性RFLP标记被检出[9，17］．我们最初基于20个标记的映射集报告了80%的完全信息性微卫星标记[12]，由于多态标记的选择更强，这一比例有所上升，后来修正为更现实的60 - 70% [15］．在这项研究中，234个绘制的微卫星中有128个(55%)是完全信息的，没有检测到以1:2:1配置分离的标记。Thamarus等．［17]发现了类似比例的完全信息标记，在种内使用不同的一组微卫星，每40个中就有24个(60%)e .桉血统，也没有检测到任何标记隔离1:2:1。这些结果加在一起，现在基于来自不同来源的一组更大的映射标记，表明大约60%的筛选集桉树微卫星应以充分提供信息的方式进行隔离。此外，本研究中使用的谱系是种间的，不应该显著增加完全信息标记的比例，因为这一事实大肠茅而且大肠urophylla虽然属不同种，但同属一科(Latoangulatae)．

微卫星上的零等位基因在几乎所有物种中都有报道，在这些物种中进行了遗传定位或父系鉴定所需的两代分析(在[52])。在这项研究中，在241个分离标记位点中的20个(8%)中推断出了零等位基因的总体发生。大多数标记实际上是纯合的大肠urophylla但是放大了两个等位基因大肠茅(表2)．显示空等位基因的位点总体频率仅为2%大肠茅而8%的大肠urophylla极有可能反映了一个事实，即微型卫星最初是从浓缩铀发展而来的大肠茅图书馆。未见其他基因定位报告桉树提到了零等位基因微卫星标记的频率。然而，这项研究的结果表明，即使是被认为可以跨物种转移的微卫星，当我们转移到亲缘关系较远的物种时，零等位基因的频率也应该增加大肠茅．在杂合度中，零等位基因的存在对于单独亲本图谱的构建不是一个问题。通过以二进制方式对两个隔离等位基因进行评分，只观察一个等位基因就足够了，而另一个等位基因则被评分为null。然而，为了构建共识图谱，需要完整的基因型类信息来进行分析，导致排除了具有一个或多个空等位基因的位点。事实上，所有6个具有一个或多个空等位基因的完全信息标记都不能在共识图谱上定位。在所有可用的微卫星上积累遗传作图和零等位基因频率的数据将是有趣和重要的桉树，从而得到一组在微卫星启动位点序列多态性频率较低的鲁棒标记。EST衍生的微型卫星可能会提供这种标记的良好来源。

结合来自两个亲本图谱和共识图谱的连锁信息，共有234个标记位点在LOD 3.0上得到一致映射。大量的标记被隔离和映射在大肠茅地图(202)比上大肠urophylla地图(160)。原则上，这应该是由于较高水平的异质性大肠茅父树。然而，以往在这两个亲本中随机分布的RAPD标记的序列多态性调查显示，在272个杂合标记的分离标记数量上没有显著差异大肠茅286来自大肠urophylla用同一组任意序列引物检测[4观察到的可测绘微卫星的差异很可能是由于这两个物种之间的标记的不完全可转移性，因为它们最初是从一个物种发展而来的大肠茅图书馆。14颗微型卫星没有放大大肠urophylla(表2)．此外，一些大肠茅微卫星位点，虽然产生扩增子大肠urophylla在侧翼引物序列所定义的同一位点上，可承载修改后的简单序列重复序列大肠urophylla．当试图跨相关物种转移微卫星时，观察到这种现象，即PCR产物扩增但缺乏序列多态性[53，54］．在一个微卫星之间的可转让性研究Quercus而且齿栗叶，尽管对应连锁群中14个位点在侧翼区域具有高度的序列同一性，但在非源种中重复基序在某些情况下被缩短和/或修改[55］．

共识地图构建

在共识图中合并亲本图的效果一直是关于位点排序的最终质量和重组分数估计的争论。例如，当Maliepaard等．［56]的研究表明，合并重组率差异较大的连锁映射可能会导致集成映射中错误的标记顺序等．［57]发现，即使亲代减数分裂之间的重组存在显著差异，合并后的图谱在标记顺序上仅显示出轻微差异。为了更好地评估将双亲的分离数据组合在一张地图上的效果，我们选择展示使用广泛使用的方法和软件(pseudo-testcross和Mapmaker [4])，并将其与Outmap分析的综合分离数据得出的共识图进行比较。虽然在两个亲本图谱中，相同对微卫星标记的两点重组频率估计值中有17%存在显著差异(平均相差25%)，但总体分析显示，在比较两个亲本图谱时，相邻标记的平均重组分数没有显著差异。这一结果表明，在共识地图上报告的相邻标记之间的地图距离应该是足够的平均估计值。正如预期的那样，共识映射的总大小介于两个父映射之间。共识图的观测长度为1567.7 cM，标记间平均距离为8.4 cM。这一平均距离并不像人们预期的那样落在两个亲本映射的平均标记间距离之间(10.7和9.2)1)．事实上，共识图谱是基于继承自双亲的分离标记的合并而新构建的图谱。虽然共识地图的总地图距离是两个亲本地图之间的接近平均值，但共识地图上映射的标记总数更大或至少等于单个亲本地图，因此导致地图更密集，标记间的平均距离减少。

所有链接的微卫星在两个亲本图谱的同一连锁群上映射一致，82%的标记沿同源亲本连锁群映射顺序相同，顺序变化主要集中在连锁群1、8、9和10上(图2)2)．虽然生物学原因，如两个物种之间的染色体重排可能涉及，这些顺序变化最有可能归因于分析原因。这些包括由于等位基因缺失导致的评分错误，产生明显的重组事件，以及当试图定义标记之间的顺序时，仅从一个或另一个父标记分离出完全有信息的标记，导致相邻标记的局部重新排序。

考虑到共241个微卫星标记扩增大肠茅而且大肠urophylla，只有12个期望在p≤0.05时偶然扭曲。然而，确定了29个(12%)，但只有一个在应用严格的Bonferroni校正后仍显着扭曲。除了一个畸变标记外，所有畸变标记都被映射到共识图谱上，超过一半的畸变标记主要聚集在两个连锁组(组2和组8)中，其余的畸变标记分散在八个连锁组中(图2)2)．在许多植物物种的测绘报告中，检测到比偶然预期的更大水平的分离扭曲一直是规则(例如[58，59])。在桉树，到目前为止，基本上所有的制图报告都检测到扭曲标记的预期比例存在显著偏差，尽管偏差程度不同，通常在种间[4，42，43，45]与特定内杂交相比[9，17］．扭曲的标记通常聚集在基因组的特定区域，因此排除基因分型错误作为潜在的原因。几种合子后选择现象可能导致这种分离扭曲。然而，在高度异种的未经驯化的森林树木，如桉树，最可能的原因是杂合条件下有害等位基因的表达[60]或杂交不亲和。Myburg等．［61]在a的回交家系中观察到高水平的扭曲大肠茅×e .桉并利用这些信息对这两个物种之间的合子后障碍进行了全基因组分析。尽管有可能证明在如此广泛的种间谱系中，正的和负的异种相互作用会影响渐渗率，但该研究是用显性AFLP标记进行的，这一事实排除了对扭曲来源进行更详细的分析。正如该研究中正确指出的那样，本报告中所描述的大量微卫星的可用性将是进一步研究胚胎合子后障碍性质的有力工具桉树从而指导先进代杂交育种，一个异常强大的方法，已普遍用于桉树培育精英克隆体。

这项工作中报道的共识地图不包含最初用于连接早期绘制的微卫星的RAPD标记[12，15］．虽然RAPD标记可以被集成，但试图打包大量标记可能会导致对微卫星标记顺序的支持可能性降低，这是本研究的主要焦点。此外，鉴于RAPD对其他谱系的可转移性非常有限或为零，它们的存在将为未来的QTL作图研究提供很少的信息。然而，值得注意的是，高吞吐量、高复用类型方法，如RAPD，特别是AFLP，将继续成为重要的辅助工具桉树高密度作图的遗传学[45]和高分辨率的抗病位点定位(例如[39)，最终允许基于地图的克隆工作。新的超高通量基因分型方法的转移，序列特异性标记，如DArT，成功评估桉树［62]和SNP数组[63]，结合本工作中描述的微卫星框架，很可能为该属的综合高密度QTL定位提供一个强大的平台桉树．

基因组长度和图谱覆盖范围

已发表的物种基因组长度估计桉树在919厘米至1551厘米之间变化，但迄今为止的大多数估计都保持在1300厘米至1500厘米左右(在[17])，主要基于任意序列引物生成的标记。在这项工作中，仅基于微卫星，我们获得了女性的总基因组长度为1814.5大肠茅地图，1133.4大肠urophylla男性分布图为1567.7 cM。而长度为大肠urophylla共识图与迄今为止的大多数估计一致大肠茅总长度变大了。这个观察到的长度可能被一些标记夸大了，尽管在LOD >3.0分组，但以不成比例的方式扩展了地图。它们不会在共识地图上以不同的顺序映射或映射，因此应该谨慎地看待。然而，它们被包括在地图上，以提供它们的初步联系组分配。这些标记包括:第3组上的EMBRA114延伸54 cM;EMBRA88在第8组上延伸37.7 cM;EMBRA140在第9组上将地图延伸57厘米。第10组的EMBRA102和EMBRA40将地图扩展到100厘米以上，并在上显示地图顺序大肠urophylla在共识地图上。从地图上去掉这五个标记，我们得到更保守的长度为1562.3厘米。作为参考，我们将这些观察到的长度与之前基于240和251个RAPD标记获得的相同亲本树的长度进行了比较[4］．为大肠茅， 1562.3 cM的保守估计接近RAPD地图的1552 cM大肠urophylla1133.4的微卫星图也接近RAPD图的1101 cM。本研究没有进行框架映射调整，因为主要目标是为所有报告的微卫星标记提供最可能的映射位置。但是，使用基于RAPD框架映射的估计总映射长度(1,620为大肠茅1156大肠urophylla, (4])，本研究报道的微卫星亲本图谱分别覆盖了估计基因组长度的96.4%和98%。然而，我们对估计共识图谱的基因组覆盖感兴趣。使用作为框架标记的微卫星标记比例的保守估计(即对数似然支持至少为3.0阶)，我们估计观察到的基因组覆盖率为93%，理论预期的基因组覆盖率为88.6%。这些估计使我们能够提出，微卫星共识图涵盖了大约90%的基因组。

中链接数据的合并和比较映射桉树

利用在其他独立研究中绘制的EMBRA标记，有可能将其他41个微卫星分配到这个连锁群级别的共识地图上。要确定这41个微卫星相对于连锁群上其他标记的确切顺序，需要在同一组子代个体上进行基因分型。然而，本研究中进行的关联数据的合并表明，更全面的微卫星地图提供了扩大整个比较绘图机会的力量桉树物种。

此映射采用的链接组编号遵循最初为RAPD标记映射建立的链接组编号。这是一个任意的编号，但是为了将微型卫星整合到现有地图上而保留下来。RFLP、AFLP、EST、其他微卫星和候选基因的其他报告使用了不同的编号。显然需要统一链接组编号桉树物种以促进新的标记和基因的持续添加。虽然这里提出的编号现在朝着这个方向迈出了第一步，但建立一个正确的染色体编号系统，从而为连锁基团，应该来自使用先前筛选的BAC与特定的微卫星作为细胞遗传学研究原位杂交探针。

微卫星连锁图谱数据的整合也将扩大对假定的QTL synteny进行比较分析的前景，例如在桉树通过品牌等．［30.]的无性繁殖性状和Thamarus等．［38]为木材密度qtl。另一个有趣的机会是提出主要效应qtl的假定候选基因。例如，早开花QTL命名Eef1是最近由密西亚绘制的地图等．［46]在标记EMBRA27和EMBRA164的连锁群2上。联动组2对应Thamarus的联动组4等．［17]即EAP1, the桉树功能上等同于拟南芥Apetala1基因被绘制出来。EAP1的异位表达拟南芥由35S启动子驱动导致植物提早开花[64]这一比较定位信息提供了一个有趣的线索，以测试该基因作为潜在的Eef1QTL。同样，Thamarus第10连锁群顶端CCR基因的连锁群分配等．［17]表明该候选基因应该位于该共识图第10连锁群的一个末端，或者靠近EMBRA33和EMBRA10，或者靠近EMBRA155和EMBRA127。CCR基因的多态性最近被认为与微纤维角的变化有关桉树nitens而且e .桉［65］．这一组合信息对于在微纤维角分离人群中定向筛选与CCR相关的微卫星标记非常有价值，试图在不同人群中验证该QTL桉树物种。以类似的方式，一旦微卫星被定位到EgMYB2基因附近，最近表明它与木质素含量的QTL共同定位[66]，将有可能验证该QTL，并评估该候选基因在不同遗传背景下的影响。

本报告描述了一套由230颗EMBRA微型卫星组成的新型卫星的开发，构建了第一张具有234个位点的共识链接图，覆盖了全球90%的区域桉树基因组。基于一套与他人共享的微型卫星桉树在图谱研究中，另外41个微卫星、候选基因和开花性状的qtl被分配到共识图谱中，使其成为植物现有连锁信息的第一个统一来源桉树．本报告显著增加了微卫星标记的可用性桉树证实了该属物种间微卫星侧翼序列和位点排序的高度保守性。这项工作代表了向前迈出的重要一步桉树比较基因组学，为物种的进化研究和分子育种应用打开刺激的前景。微型卫星的可用性桉树应该在未来几年内根据现有的大型EST和基因组序列数据库进行快速扩展。越来越多的种间可转移标记和共识定位信息的广泛使用，将允许更快和更详细地研究物种间的QTL同向性，在不同遗传背景下验证表达-QTL，并定位越来越多的候选基因，以在关联定位实验中进行测试。

植物材料和DNA提取

这组新的微卫星标记的遗传图谱是在一个由92个F1个体组成的映射群体上进行的，这些个体来自于一个雌性之间的杂交大肠茅(克隆G44)和男性大肠urophylla(克隆U28) [4］．这两个种属于同一亚属Symphyomyrtus．对于映射信息内容的表征，有32棵单独的树桉树， 16岁大肠茅16个来自大肠urophylla这些树是从自然种群中收集的种子生长而成的树的种质资源中随机选择的。如前所述，从-20°C保存的叶片中提取基因组DNA [4］．

微卫星标记分析

微卫星的研制、PCR扩增、检测、遗传和分离分析如前所述[12］．在这项工作中，设计了380个新的微卫星引物对，并使用两个亲本和四个个体的子代样本进行了扩增和多态性测试。PCR扩增条件为:94℃5 min, 94℃1 min，引物特定退火温度1 min, 72℃1 min, 72℃终扩增5 min，循环30次。不同的退火温度，从54°C到60°C，用于扩增特定的微卫星标记。微卫星标记用相同的首字母缩略词(EMBRA，桉树巴西的微型卫星)较早前采用[12]，后面跟着一个按顺序分配的数字。

亲本图谱联动分析

每个亲本树单独的连锁图是完全基于处于杂合状态的微卫星构建的，因此以预期的1:1比例分离。先前公布的70颗微卫星(EMBRA1至EMBRA70) [12，15]与本研究中开发的一组新的分离标记一起绘制。使用MapMaker 2.0进行连锁分析[67)。首先使用“group”命令将链接标记放置到链接组中，阈值LOD评分为3.0，最大重组分数(theta)为0.35。然后使用“一阶”和“比较”命令来确定链接组内最可能的标记顺序。使用“ripple”命令验证本地顺序的日志似然支持。对于最终的标记排序，我们选择不采用严格的对数似然支持3.0，只保留框架标记，因为研究的主要目标是在链接图上定位所有开发的微卫星。因此，对标记排序的对数似然支持在不同的地图段中是可变的。当所有标记都包含在分析中时，所呈现的标记顺序是基于最高总体可能性的最佳可能顺序。利用Kosambi映射函数将重组分数转化为估计的映射距离。连锁群编号遵循Grattapaglia和Sederoff最初提出的方法[4]的RAPD遗传图谱大肠茅后来被用于微卫星测绘[12］．

共识图谱构建和基因组覆盖

利用所有92个F1子代的配子类建立了一个组合数据集，构建了一个综合连锁图谱。使用非亲本的结果是，发现了两种不同类型的分离:信息较少的1:1分离位点，两个不同的等位基因只从两个亲本中的一个分离出来(伪测试杂交);信息完全丰富的1:1:1:1分离位点，双亲杂合，三个或四个不同的等位基因从两个亲本中分离出来。采用卡方检验(alpha = 0.05)检验基因型类与预期孟德尔遗传比的偏差。综合连锁分析，包括估计重组分数和位点顺序使用基于窗口的包OUTMAP [68]是一种专为绘制异交树共显性位点而开发的程序，与其他现有程序相比，该程序的绘制效率更高。69］．采用1:1:1:1的完全信息标记进行对比作图分析，揭示两个独立亲本图之间以及它们与共识图之间微卫星标记顺序的差异。

估计的基因组长度(G_{美国东部时间})，用常用的Hulbert估计[70］．为了产生这种估计，必须只考虑框架标记，以避免由于聚集标记而高估基因组大小。我们保守估计，53%的共识标记是框架标记，即基于之前为这两个亲本标记估计的框架标记的比例，分配了3.0或更高的LOD支持。4］．观察到的基因组覆盖率(C_{奥林匹克广播服务公司})，然后估计为观察到的总基因组长度(G_{奥林匹克广播服务公司})到估计的基因组长度(G_{美国东部时间})．一个理论上预期的基因组覆盖率(C_经验值)为共识地图，并使用方程C ._经验值=单电子^{xn / 1.25武功}［71]，其中X为相邻两个标记之间的最大距离，N为框架标记的数量，(G ._{美国东部时间})为估计的基因组长度。

微卫星表征

如前所述，获得了35个选定微卫星的等位基因多样性以及观测到的和预期的杂合度估计值[12对32棵不相关的树进行基因分型后，发现其中16棵大肠茅16个大肠urophylla从自然种群中取样。根据这35个位点沿11个连锁群分布均匀、易解释的基因型生成和对其他位点的高转移性，选择它们作为推荐锚位点桉树物种。确定了以下参数:在每个物种中观察到的等位基因总数和它们之间共享的等位基因总数，观察到的等位基因(H_{奥林匹克广播服务公司})和预期(H_经验值)各种杂合度及组合。

微卫星联动信息汇编

对迄今为止文献中所有可获得的微卫星连锁信息进行了汇编，以确定本共识图的连锁群与其他已出版的地图之间的同源性大肠茅×大肠urophylla［72]和其他桉树物种(17，30.，44］．定位在所有这些图谱上的EMBRA标记被用作锚点来定义连锁群之间的编号对应关系。这些锚定标记允许将其他实验室开发的微卫星(首字母缩写EMCRC, Eg, En, Es)以及由RFLP绘制的候选基因分配到这一共识图中的连锁群。

我们感谢巴西科技部FINEP通过生物技术竞争性赠款向D.G.提供的财政支持;教育部，CAPES博士奖学金给R.P.V.B.;巴西国家研究委员会- CNPq研究奖学金给D.G.;Aracruz Celulose S.A.，以提供对测绘人口的访问。

从属关系

1. EMBRAPA Recursos Genéticos e生物技术，CP 02372，巴西利亚，DF, 70770-970，巴西

   Rosana PV Brondani, Claudio Brondani和Dario Grattapaglia

2. 细胞生物学系Brasília UnB, DF, Brasília

   Rosana PV Brondani

3. EMBRAPA Arroz e Feijão, CP 179, Goiânia GO, 74001-970，巴西

   Rosana PV Brondani & Claudio Brondani

4. CSIRO林业和森林产品，E4008，金斯敦，ACT, 2604，澳大利亚

   艾姆琳·R·威廉姆斯

5. 基因组科学和生物技术研究生课程，天主教大学Brasília，巴西利亚，DF, 70790-160，巴西

   达里奥Grattapaglia

相应的作者

对应到达里奥Grattapaglia．

作者的贡献

RPVB进行了大部分的实验工作，包括微卫星的开发、基因分型和数据分析、亲本图谱的构建和第一版手稿的起草。ERW负责构建第一个版本的共识地图。CB为微型卫星的发展做出了贡献。DG负责项目构想，数据分析，从文献中收集现有的链接信息，并撰写最终版本的手稿。

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