红花柱头的EST数据库

背景

藏红花(番红花sativusL.，Iridaceae）从希腊语 - 米诺文明以来，紫薇）花被用作香料和药用植物。可食用的部分 - 柱头 - 通常被认为是世界上最昂贵的香料，并且是特殊的二级新陈代谢的部位，负责藏红花的特征颜色和味道。

结果

我们从藏红花柱塞cDNA文库生产了6,603个高质量的表达序列标签（EST）。此集合可通过以下方式访问和可搜索番红花基因数据库http://www.saffrongenes.org。这些ESTs被分为1893个簇，每个簇对应一个不同的表达基因，并进行了注释。完整的EST原始序列及其电泳图保存在数据库中，使用户可以调查序列质量和EST结构特征(媒介污染、重复区域)。藏红花柱头转录组包含一系列有趣的序列(假定的性别决定基因，脂质和类胡萝卜素代谢酶，转录因子)。

结论

的番红花基因数据库代表了鸢尾科的基因组学，柱头生物发生的分子生物学，以及藏红花次生代谢的代谢途径的第一个参考集合。

藏红花(番红花L)是一种三倍体不育植物，可能来自野生物种番红花签字人．它已被繁殖并用作地中海地区的香料和药用植物数千年[1]．藏红花的驯化可能发生在公元前3000年至1600年的希腊-米诺斯文明时期。希腊圣托里尼岛出土了一幅描绘藏红花采集者的壁画，其历史可以追溯到公元前1600年。

藏红花通常被认为是世界上最昂贵的香料。如今，主要生产国是伊朗、希腊、西班牙、意大利和印度(克什米尔)。除了商业和历史方面，藏红花的其他几个特点使其成为一个有趣的生物系统:香料来自花的柱头(图)1），其手动收获并进行干燥。番红花，番红豆苷和鳄鱼苷糖苷的主要颜色以及主要味道，PicRocrocin和Safranal源自类胡萝卜素的氧化切割[2，3.)(图1 b）.藏红花属鸢尾科(百合目，单子叶植物)，基因组特征不明显，大小相对较大。

藏红花柱头的转录组特征可能揭示几个重要的生物学现象:香料风味和颜色生物发生的分子基础，雌蕊的生物学和鸢尾科的基因组组织。基于这些原因，我们对藏红花柱头的表达序列标签(ESTs)进行了测序和生物信息学特性分析。

测序和组装

成熟藏红花柱头lambda Uni-ZAP定向cDNA文库[2斯特拉斯堡大学Bilal Camara教授善意提供。对图书馆进行自动切除，并将CDNA插入切入PCR扩增并从5'末端测序。

使用Phred程序分析9769份电泳图[4]．从5'和3'末端除去低质量序列，进一步加工序列以除去载体污染并掩盖低复杂性和/或重复子序列。该过程将原始数据集还原为6,603个高质量序列，超过60个核苷酸。仅考虑将长度大于或等于100个核苷酸的6,202个酯碎片，用于提交NCBI DBEST划分。它们可在EX142501到EX148702的加入号码下访问它们。

EST数据集进行聚类/组装[5，以便对推定来自同一基因的ESTs进行分组，并根据推定的转录本产生暂定一致序列(TC)。生成的集群总数为1893个。每一簇应该对应一个独特的基因，即它代表一个基因索引。1376个簇由单个EST组成，因此被归类为单簇。其余517个簇由5324个est组成，组装成534个TCs(表)1）.在11个簇中，对ESTs进行组装，从而定义多个tc(范围从2个到6个)。一个簇中的多个tc具有高度相似的共同区域，这可能是由于可能的替代转录本、同源或域共享。图中报告了数据集中的GC内容分布2．平均GC含量约为44%。

数据库和Web界面

数据集用于构建番红花基因数据库(6]．该数据库体系结构由一个主要的MySQL关系数据库和两个卫星数据库myGO和myKEGG组成。使用HTML和PHP脚本创建一个用户友好的web界面。一个预定义的查询系统支持数据检索;实现html树图形显示，浏览酶类和代谢途径。与用户定义的标准相对应的转录本，可以实时地映射到KEGG代谢图上，这些代谢图可以作为GIF图像访问[7]．可以下载单个EST的电泳图以重新检查序列质量。

自动化功能注释

为了给每个转录本分配一个初步的功能，使用BLASTX与UniProtKB/Swiss-Prot数据库比较TCs和单例。在1910个转录本中，1158个(60.6%)没有命中，而其余752个(39.4%)在蛋白质数据库中至少有一个显著匹配。在后一组中，131(6.9%)被描述为假设的、未知的或表达的蛋白质，因此不能确定转录产物的有效功能作用。

基因本体论术语自动分配给匹配的UNIPROTKB / SWISS-PROT数据库中的蛋白质的那些157转录物，其登录号出现在卫星数据库MyGo中（参见方法）。在许多情况下，可以将多种基因本体论术语分配给相同的转录物，导致分子函数的210分配，944分配给生物学过程，最后2,192级至细胞组分类。为了展示本体内容的广泛概述，整个本体集合都被映射到工厂GO SLIMS术语上。在分子函数本体类别中，最代表性的术语描述了催化（33.3％）和水解酶活性（20.0％）（图3）.剩余类别较少。考虑到生物过程类，绝大多数GO赋值对应于更普通的运输类别（〜78.8％）（图3 b）.最后，对于细胞组分类，该分配主要给予体液（36％），线粒体（33％）和细胞质膜结合囊泡（29％）组分（图3 c）.64个转录本与46种不同的酶相关联，因为它们被分类和描述到酶库[8]．46种酶中有35种映射到55个KEGG生化途径[9]．我们知道，有些酶可以通过多种途径产生;另一方面，有8种酶只作用于单一途径，被归类为途径特异性(数据未显示)。

番红花柱头表达的基因

contig中EST的丰度可以指示柱头组织中mRNA的相对丰度。我们鉴定了由≥20个ESTs组成的tc(见表)2）.最高表达的TC，CL000057：2（547 EST），对短链脱氢酶具有同源性（PF00106.12）。该蛋白质家族包括参与激素生物合成的成员，如ABA2.拟南芥促黄酮类化合物转化为ABA醛的基因[10，或在性器官身份，如TASSELSEED2（TS2)基因(图4）.TS2在玉米的雌蕊原基细胞中表达，激活细胞死亡过程，从雄性生殖器官中消除这些细胞[11]．生化研究表明，TS2蛋白是一种羟类固醇脱氢酶[12]．确定Saffron Cl000057：2产品的功能和衬底特异性将是有趣的。

大量细胞色素p450序列在藏红花柱头中表示，其中一些在非常高的水平（表2和3.）.此外，脂质代谢似乎非常活跃，从编码该过程中涉及的蛋白质的TCS判断（表3.）.

几种tc编码推测的类胡萝卜素代谢酶(见表)3.): Cl000944:1编码非血红素-β-胡萝卜素羟化酶，该酶在藏红花柱头中高度表达[13]．Cl000627：1个编码的推定的葡糖基转移酶，非常类似于UGTCs2，其能够糖基化藏花酸在体外3.)(图4）.Cl001532:1和Cl001032:1也编码推测的类异戊二烯GTases，其中一个可能代表仍然缺失的负责苦瓜素糖基化的酶(图)1）.Cl001432:1编码一种类似于质体末端氧化酶的蛋白质，参与phytoene去饱和[14而EST cr36_B21编码一种类似于纤维蛋白的蛋白质，纤维蛋白是辣椒色素质体中的一种类胡萝卜素结合蛋白[15]．Cl000468编码一个羧基甲基转移酶，非常类似于催化合成bixin的酶[16)(图4）.该TC似乎编码了来自Genbank的Annatto和Cacus甲基转移酶的“短”形式，可能来自替代剪接（图4）.虽然萨红星耻辱尚未描述甲基转移酶反应，但哌本断的生物合成和蟹蛋白的生物合成共有一些特征，因为两种颜料都来自类胡萝卜素的氧化切割[17]．最后，Cl000045:1编码了一种与花椰菜高度相似的蛋白质或基因产物，具有富含半胱氨酸的DNAJ结构域的塑性相关蛋白。占主导地位或突变诱导花椰菜花序中β-胡萝卜素的积累，提示或不知何故涉及染色体分化的控制[18，19]．

一些tc编码假定的转录因子(表3.）.最丰富的表达CL000348：1，用LHMYB的高相似性编码了一种高相似性的蛋白质（来自百合属植物， GenBank accession BAB40790非洲菊［20.] - 也显示与CL000348：2）和MYB305的相似之处（来自Antirrhinium［21])。这三种因素在花中都高度表达。Cl001329:1也是高表达的，它编码一个推测的MADS box转录因子。该蛋白与AODEF相似，AODEF是一种具有b功能的转录因子芦笋在雄蕊和内花被片中表达[22]并向LMADS1，一种百合蛋白，其各向异性负面形式的异位表达导致AP3.拟南芥的类表型[23]．

最后，Cl000209:1(61个est) Cl000582:1(18个est) Cl001827:1(5个est)和Cl000731(2个est)几个TCs与potyvirus序列具有相似性，表明测序文库可能来源于病毒感染组织。众所周知，像虹膜温和花叶病毒这样的potyvirus会感染番红花属［24]．这些TCS的序列将证明可用于诊断和植物检疫目的。

的番红花基因数据库(6为藏红花柱头组织的表达模式分析及该物种的基因组特性的初步研究提供参考。完整的原始EST序列及其电泳图保存在数据库中，以便用户调查图书馆质量和单个EST结构特征(媒介污染、重复区域)。为单个ESTs及其组件提供注释(暂定共识)，以评估自动化功能分配的一致性。被确定与酶相关的假定转录本被组织成类，也可以从酶分配到代谢途径的角度来观察。这是研究柱头转录组特性的一种直接方法。如上所述，该转录组包含一系列有趣的序列，其功能现在可以使用体内或体外方法进行测试。

EST测序

成熟藏红花柱头lambda Uni-ZAP定向cDNA文库[2斯特拉斯堡大学Bilal Camara教授善意提供。使用exassist辅助噬菌体和溶液菌株根据制造商的方案（Stratagene Uni-Zap手册）和溶液，用氨苄青霉素，IPTG和X-GAL涂覆在体内切除噬菌体中含有噬菌体的PBLUESCRECT噬菌物。白菌落用手挑选，并在LB +氨苄青霉素的LB 384孔板中生长过夜。约。使用含有384销的工具（VP Scientific）在含有50μL的20μLPCR反应中，将每个饱和培养物中的每种饱和培养物中的每一个引物T3和T7（Stratagene）和0.5u Taq聚合酶（GE Healthcare）中的每种饱和培养物（VP科学）接种。使用以下PCR循环（94℃2'）扩增384孔格式的反应，然后进行变性步骤（94℃'），其次为35个变性（94℃45“）退火（50℃45”）和伸长率（72°C 2'），然后是伸长步骤（72℃10'）。约。通过在1％琼脂糖凝胶上加载2ml来检查PCR反应的1/4，还通过进一步加工含有> 80％扩增的鲁棒单带的平板。通过凝胶过滤在384孔深阱PVDF板上（康宁猫3531）纯化PCR反应。 Each well was filled with 250 mL of resin (3.5% Sephadex G-100, GE Healthcare) and the resin was packed by centrifugation at 3.000 × g for 5'; after addition of 150 mL of resin, the plate was re-centrifuged as above; 10 mL of the PCR template were loaded in each well and the purified reaction was collected by centrifugation as above.

3mL PCR模板用于用T3引物在384孔格式中以10mL的最终体积进行测序。根据制造商的说明，使用稀释1:16，使用Bigdye终结器套件V 3.1（应用生物系统）。使用6.5％Sephadex G-50良好（GE Healthcare），通过凝胶过滤除去染料终止剂（参见上文）除去染料终止剂。将反应加载到具有50cm毛细管的ABI 3730序列子上。

EST处理和CONTIG组装

使用在那不勒斯大学发育的管道Parpest分析电泳图[5]．使用phred进行序列呼叫[4的质量临界值为0.05。使用重复遮罩识别媒介污染[25]和NCBI的UniVec作为过滤数据库。RepeatMasker和RepBase [26]用于过滤和掩蔽低复杂度的子序列和分散重复序列。使用PaCE进行EST聚类[27]，使用默认参数。cluster中的所有ESTs使用CAP3组装成contigs [28的重叠窗口有60个核苷酸，最低评分为85分。

功能注释

使用BLASTX与UNIPROTKB / SWISS-PROT数据库进行比较原始EST数据和CONTIG [29]．筛选Blast搜索的e-value滤波比0.001更少。转录物与基因本体论术语之间的关联在MyGo数据库中报告蛋白质受试者的登录数量时发生。使用Map2slim.pl脚本将与每个最佳BLAST命中的所有GO术语转换为植物SLIM术语，作为Go-Perl包的一部分（0.04）分发。从......基因本体网页[30.]．如果EC出现在每个最佳BLAST命中的描述行中，那么转录本和酶委员会(EC)编号之间的关联就会发生。与EC数字相关的转录本也与myKEGG相关，并可以映射到代谢途径上。

多个对齐一代

集群序列比对[31使用EBI web界面执行[32]．

由意大利研究部(FIRB项目)和意大利农业部(Agronanotech项目)支持的工作。我们感谢Bilal Camara教授提供藏红花柱头cDNA文库，Laura Spanò教授指导DP博士工作，Francesca Cecchi帮助处理电泳图。这是DISSPAPA第151号捐款。

从属关系

1. 那不勒斯费德里科二世大学土壤、植物、环境和动物生产科学系，通过Università 100, Portici, NA, 80055，意大利

   Nunzio d'Agostino＆Maria Luisa Chiusano

2. ENEA, Casaccia研究中心，邮箱2400，罗马，00100AD，意大利

   Daniele Pizzichini和Giovanni Giuliano

相应的作者

对应到Giovanni Giuliano．

相互竞争的利益

作者宣称没有相互竞争的利益。

作者的贡献

GG计划并监督整个工作。DP进行测序。MLC计划并监督NDA实施的生物信息学工作。本文由GG和MLC撰写。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文在“生物资源”中央有限公司的许可下公布了这是一个开放式访问条款，分配根据创意公约归因许可证的条款（https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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