栽培红花的DNA序列多样性及来源(Carthamus tinctoriusl;菊科)

背景

红花(Carthamus tinctoriusL.)是一种二倍体油籽作物，其起源在很大程度上未知。红花被广泛认为是4000多年前在新月沃土的某个地方被驯化的。之前关于红花起源的假设主要集中在该科的另外两个物种上。Carthamus- - - - - -c . oxyacanthus而且c . palaestinus-被认为是最有可能的祖先，尽管人们对第三个物种(c . persicus)作为可能的候选人。在这里，我们描述了使用七个核基因的数据对整个部分进行系统发育分析的结果。

结果

单基因系统发育分析表明存在一定的网状或不完整的谱系分选。然而，对组合数据集的分析揭示了红花和植物之间的密切关系c . palaestinus．相比之下,c . oxyacanthus而且c . persicus似乎和红花的亲缘关系更远。

结论

根据我们的研究结果，我们得出结论，红花很可能来自野生品种Carthamus palaestinus．正如预期的那样，红花的核苷酸多样性与其祖先相比有所减少，这与在驯化过程中群体遗传瓶颈的发生一致。本研究结果为红花驯化的遗传学研究奠定了基础。

红花(Carthamus tinctoriusL.)为蓟状，自交亲和，一年生二倍体(2n在炎热干燥的气候条件下生长旺盛的草本作物，能在极低的地表水分条件下生存。它被认为是4000多年前在新月沃土地区的某个地方被驯化的[1］．在最初的驯化之后，红花的种植被认为已经扩展到东方和西方[2]，与诺尔斯[3.最终承认了七个“相似中心”(远东、印度-巴基斯坦、中东、埃及、苏丹、埃塞俄比亚和欧洲)。每个“中心”的红花线在高度、分枝、刺、颜色和头大小上都非常相似;然而，中心之间保持一致的形态差异。

几个世纪以来，当地大规模种植红花是因为它的花朵，它是纺织品和食用色素的染料(红花胺)的来源，也用于宗教仪式。4］．植物提取物也被用来调味食物，历史上因其众多的药用特性而受到重视。在新大陆，红花的种植始于1899年，而作为油籽作物的红花商业化生产始于20世纪50年代[5］．最近，人们对红花越来越感兴趣，因为它有可能成为植物药物的大规模生产平台[6，7］．

迄今为止，系统发育研究Carthamus物种的研究主要集中在划分属内的部分[例如，[8，9]]，或发展用于调查红花品种间关系的DNA指纹鉴定方法[例如[10]]。然而，在每个部分中，密切相关的物种之间的关系却知之甚少，关于红花的起源和早期进化的细节也缺乏。我们目前所知道的是，红花属于一组密切相关的二倍体物种(组。Carthamus；所有2n= 24条染色体[11])，其分布范围西起土耳其中部、黎巴嫩和以色列，东至印度西北部。除了c . tinctorius，本节由c . curdicusHanelt,c . gypsicolaIljin,c . oxyacanthusBieb。（=c . oxyacantha穿上灰西服时m),c . palaestinusEig,c . persicusDesf。Willd交货。（=c .刺蛾Spreng) [8，12］．然而，这些物种都表现出一定程度的相互交叉相容性[综述在[12，13]]因此不能仅用生殖隔离来划分物种。Carthamus curdicus而且c . palaestinus表现出有限的地理分布(分别是伊朗北部和以色列南部)，而c . persicus，c . gypsicola而且c . oxyacanthus在中东地区分布更广[12］．

关于红花起源的各种假说一直是研究的重点c . oxyacanthus或c . palaestinus尽管是最有可能的祖先c . persicus也被认为是可能的祖先[14］．在这里，我们报告的核苷酸多样性水平内和种之间的段。Carthamus，并利用七个核基因数据研究栽培红花的起源。

DNA序列多样性

从23个被调查个体的所有7个基因区域收集序列数据1而且2)，包括宗派内的所有物种。Carthamus．所有序列均已存入Genbank数据库，可在编号为EF483951-EF483974、EF483983-EF484014、EF519712-EF519729、EF519732-EF519751、EF519754-EF519770、EF519774-EF519792、EF519795-EF519811、EF519815-EF519834和EF519838-EF519857的数据库中查询。除索引子外，每个位点的序列长度从365到621个碱基对(bp)不等，并且所有序列都包括外显子和内含子(表2)3.)．因此，我们能够分析每个个体的3239 bp的对齐序列，其中1317 bp(40%)来自外显子，1922 bp(60%)来自内含子。在不同类群中，每个位点的indel多态性数量从4到13个不等，数据集中共有53个indel多态性。所有引物均被排除在核苷酸多态性分析之外。

单核苷酸多态性(SNPs)明显比单核苷酸多态性更常见。在整个数据集中共发现220个SNP，平均每15 bp序列有1个SNP。仅考虑11个红花个体，就有34个SNP，平均每95 bp序列有1个SNP。核苷酸多样性的估计c . tinctorius，c . palaestinus而且c . oxyacanthus载于表4．

虽然基因座的多样性不同，c . tinctorius与沃特森θ (θ_W)范围从0到0.0071(平均值= 0.0033)，总核苷酸多样性(π_合计)范围为0.0008 ~ 0.0102(均值= 0.0041)，无噪声点多样性(π_银)，范围为0.0006至0.0175(平均值为0.0057)。Carthamus oxyacanthus另一方面，θ表现出最高水平的多样性_W范围为0.0012 ~ 0.0277(均值= 0.0101)，π_合计范围为0.0014 ~ 0.0354(平均值= 0.0105)，π_银范围从0到0.0601(平均值= 0.0148)。Carthamus palaestinusθ_W范围为0 ~ 0.0078(均值= 0.0044)，π_合计范围从0到0.0095(平均值= 0.0051)，π_银范围从0到0.0180(平均值= 0.0081)。

由于每个基因片段中包含的外显子序列数量相对较少(平均188 bp)，因此必须谨慎看待同义和非同义多样性的个体估计。然而，跨基因座的平均值显示，我们对非同义变异性的估计远远低于我们对同义变异性的估计，这表明这些基因座的多样性主要由纯化选择决定(数据未显示)。经过多次比较校正后，田岛一家都没有D估计与零有显著差异(表4)．

系统发育关系

通过单基因分析得到的NJ树的比较表明，在该地区发生了网状进化和/或不完整的谱系排序Carthamus教派。Carthamus(无花果。1)．虽然从这些分析中可以明显看出树形拓扑结构的一些整体相似性，但在一些实例中，个体的系统发育位置取决于所分析的基因。在某些情况下，个体在一个或多个位点上拥有不同的等位基因，这可能表明当代杂交在宗派的进化中发挥了积极作用。Carthamus．特别值得注意的是c . gypsicola有时在不同的进化支中发现的等位基因(例如，基因A19和B12)。一些c . oxyacanthus等位基因表现出类似的模式(例如，基因A39和B27)。然而，当比较这七棵树的单个位点时，一些模式开始出现。总的来说,c . oxyacanthus最常被发现是相对较远的亲戚c . tinctorius，并经常与等位基因有关c . gypsicola．特别值得注意的是人与人之间的密切关系c . tinctorius而且c . palaestinus这表明，与红花关系最密切的物种(因此也是红花最可能的祖先)是红的c . palaestinus(无花果。1)．

尽管位点之间存在一些不一致，但基于组合数据的NJ、ML和贝叶斯树(它们在拓扑上几乎完全相同;无花果。2和未显示的数据)与我们对单基因分析的解释完全一致。Carthamus oxyacanthus解析为与红花亲缘关系最远的物种，具有较高的ML自举和贝叶斯后验概率。在c . oxyacanthus来自巴基斯坦的两条线比来自阿富汗的两条线更接近。Carthamus persicus似乎是过敏性休克，可能是最近的基因流动造成的。根据单个基因树的预测，c . palaestinus是与红花亲缘关系最密切的种，我们推断该种是红花最有可能的祖先。在贝叶斯分析中，所有四个c . palaestinus个体与所有红花个体一起被发现在一个支持良好的分支中。同样，在ML分析中，四个个体中的三个c . palaestinus在这支演化支中发现(87% BS)，在这支演化支的底部有第四个分辨的个体c . curdicus而且c . persicus．有些关系也可以在红花个体之间解决;例如，藏红花(saffAZ)和藏红花(saffAC)在红花根部形成了一个支撑良好的分支c . palaestinus组。然而，其他栽培品种之间的关系支持很差。

红花的由来

宗派成员之间的亲密关系Carthamus已根据交叉研究的数据提出[综述于[12，13]]，以确定部分物种的天然杂交种。[1，14]，以及涉及部分科成员的系统发育分析[9］．然而，在目前的调查之前，所有物种之间的系统发育关系在科。Carthamus没有进行过调查，红花祖先的身份仅仅是假设。而Ashri & Knowles [14]提出红花是由两种植物杂交而来c . oxyacanthus而且c . persicus我们的研究结果显然不支持这一假设。相反,Carthamus palaestinus而红花在同一枝中被发现，这表明这些物种之间的关系密切。因此，我们建议c . palaestinus它原产于以色列南部和伊拉克西部的沙漠，是红花的野生祖先。红花和c . palaestinus共享自兼容的育种系统[12];因此，在这些物种中几乎没有杂合位点(图。1)并不奇怪。Carthamus persicus一些种群c . oxyacanthus是自我不相容的，这是明显的存在，更多的杂合性在这些物种(图。1)．的非单一性的原因c . persicus由于这里必须采用的小样本量，仍然未知;然而，保留祖先多态性和/或当代基因流(c . persicus是自我不相容的)。

如引言所述，Knowles [3.发现了七个不同的红花“相似中心”，包括远东、印度-巴基斯坦、中东、埃及、苏丹、埃塞俄比亚和欧洲。有趣的是，我们的数据几乎没有支持来自这些不同地理位置的红花品种的独特性。事实上，虽然在红花中有少量明显的系统发育结构，但似乎本文调查的大多数材料在遗传水平上高度相似。此外，红花中的许多子结构在贝叶斯或ML分析中都没有得到很好的支持。例外的是来自美国和加拿大的一对(分别是saffAZ和saffAC)，以及可能来自埃及的一个(saff1067)。考虑到我们对红花种植历史的了解，北美的品种(藏红花、藏红花和藏红花)可能是最近引进的，从我们的数据来看，它们可能来自相对不同的祖先种群(图2)。2)．对“七个中心”假说的进一步研究，将需要开发和应用更多可变标记，以对可用的红花种质资源进行更可靠的采样。虽然最近使用rapd、ISSRs和aflp对红花品种进行了研究，但揭示了该物种内部的一些遗传结构[10]，作者没有解决这七个多样性形态中心是否对应于红花的遗传亚群的问题。

核苷酸多样性水平

植物物种的驯化通常伴随着遗传多样性的减少，这是由于在驯化过程中发生的群体遗传瓶颈造成的。尽管结果因物种而异，但作物的多样性通常只有其野生祖先的三分之二左右[15］．我们在这里发现了类似的值，与此相比，红花的核苷酸多样性减少了20-30%(取决于测量方法)c . palaestinus(表4)．因为θ_W与杂合度大致成正比，我们可以进一步得出结论，随机选择的一对红花序列平均每303 bp有1个差异(即1/0.0033≅303)。这使得红花的多样性大大低于玉米等作物(每105个bp中就有一个[16])及向日葵(每140 bp中有1个[17])，但远比大豆等作物更多样化(每1030个bp中就有一个[18])。

在基础研究和应用研究项目中，对作物植物起源和祖先身份的认识都具有重要价值。例如，对作物植物及其野生祖先进行比较分析，可揭示生物进化的遗传机制[19，20.］．类似地，这种比较分析可以成为识别农艺重要性状背后基因的有力工具[21- - - - - -23］．识别c . palaestinus作为红花的野生祖先，为这种属内的分析打开了大门Carthamus．此外，由于红花是一种现代油籽作物，与栽培向日葵同属一个家族，而栽培向日葵是最近大量研究的主题[24，25]，在红花中开展这样的工作将为研究菊科油籽作物的进化创造一个比较框架。

植物材料和DNA提取

用于DNA提取的组织要么从种子生长的活植物中获得，要么从植物标本室标本中获得1)．种子来自美国农业部西部地区植物介绍站的档案收藏。其中包括11个c . tinctoriusL.，三次c . oxyacanthus加上一个c . palaestinus．此外，R. Vilatersana博士(Institut Botànic de Barcelona)慷慨地提供了种子c . gypsicola而且c . persicus．植物标本室标本c . palaestinus(三次加入)和c . persicus(一次加入)由IPK Gatersleben植物标本馆(GAT)提供，以及c . curdicus(一份)由维也纳自然历史博物馆(植物标本馆W)提供。根据先前的调查，所有物种都假定为二倍体[在[11]]。

对于活的植物，用剃须刀片剪下种子，在培养皿中(黑暗48小时/光照48小时)的潮湿滤纸上发芽。然后将幼苗种在土壤中并在温室中生长。然后使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从100 mg叶片组织中分离出总基因组DNA。对于植物标本室的提取，组织裂解和提取遵循与新鲜叶片组织相同的方案，除了只使用约20mg的叶片组织。

基因座选择与测序

本研究中使用的7个核基因(表2)是从最近开发的一套通用标记中挑选出来的，这些标记用于菊科[26］．本研究中选择的基因座都产生了一个可以直接测序的单扩增子(只有那些插入/缺失杂合的个体被克隆)。其中3个位点(A25、A39和B27;表格2)在植物标本室材料中没有很好地扩增，可能是由于DNA降解;因此，设计内部引物来扩增两个重叠片段中的这些位点，然后将它们对齐成一个单一的contig。对于A39，第一部分仍然不能在植物标本室标本中扩增，因此被评分为这些个体的缺失数据。

PCR在总体积20 μl、模板DNA 20 ng、Tricine pH 8.4-KOH 30 mM、KCl 50 mM、MgCl 2 mM的条件下进行₂，每个dNTP 100 μM，每个引物0.2 μM, 2单位Taq聚合酶。热循环后“着陆”协议,最终退火温度50°或55°C,如下:(1)初始变性步骤3分钟在95°C,(2)十周期30年代变性在94°C, 30年代退火60°、65°C(退火温度降低1度/周期),45 s在72°C扩展时间,(3)30周期30年代在94°C, 30年代50°或55°C, 45 s在72°C,(4)最后20米在72°C的延伸。PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳证实扩增子的存在。

为了准备DNA测序，每个PCR产物10 μl与4单位的外切酶I和0.8单位的虾碱性磷酸酶(USB, Cleveland, OH)在37°C下孵育45 m。酶随后通过加热到80°C 15分钟变性。将纯化的PCR扩增物(0.5 ~ 2 μl，浓度不同)与初始PCR所用引物进行测序。使用DyeNamic (Amersham, Piscataway, NJ)或BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA)化学方法进行测序，遵循制造商的协议，并进行了微小的修改。通过Sephadex (Amersham)清洗从测序反应中去除未合并的染料，并在Basestation (MJ Research, San Francisco, CA)或ABI 3730xl (Applied Biosystems)自动DNA测序仪上进行测序。对于在特定位点上的indels的杂合个体(由初始测序色谱图证明)，未纯化的PCR产物按照制造商的协议使用pDrive (Qiagen)或TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA)克隆载体克隆。为了防止Taq除了使用T7和M13通用载体引物外，每个克隆反应制备5个阳性克隆的PCR产物并按上述方法测序。

数据分析

DNA序列使用Chromas 2.12 (Technelysium, Helensvale, Australia)编辑。未克隆PCR产物的杂合碱基通过双峰检测，并按照国际生物化学和分子生物学联盟的惯例进行编码。利用最大似然算法PL-EM [27]在HapAnalyzer软件内[28］．使用Clustal W2对序列进行比对[29]，然后进行手动调整。使用GapCoder将indel作为附加字符进行评分[30.]，尽管不能明确对齐的区域和简单序列重复的长度变异被排除在分析之外。杂合子是常见的，等位基因是分开的，用于个体基因系统发育分析。然而，对于合并的数据集，跨位点的等位基因的相位不能可靠地确定。因此，克隆的等位基因对被分解为每个基因的单一基因型，然后七个基因被连接到每个个体。

核苷酸多样性的估计值(π和θ，按每个位点计算)以及田岛的估计值D［31]，对三个类群的3个或3个以上样本(c . tinctorius，c . palaestinus,c . oxyacanthus)使用软件包DnaSP 4.00.5 [32，33］．使用PAUP* ver分别为每个位点和组合数据集生成邻居连接树。4.0 b (34］．合并后的数据集还进行了最大似然(ML)和贝叶斯分析。ML分析采用PHYML v2.4.4 [35]在HKY+Γ分子进化模型下，有4个替代率类，500个自举重复。采用MrBayes进行贝叶斯分析[36]在genous包(v3.0.6;Biomatters有限公司，奥克兰，新西兰)。MCMC分析同时使用4条链进行110万代，每200代进行次采样。10万代之前的样品被视为老化并丢弃。

我们要感谢J. Burger和四名匿名审稿人对手稿早期版本的评论，R. Vilatersana的种子和K. Pistrick (IPK Gatersleben)和E. Vitek(维也纳自然历史博物馆)发送的植物标本室标本。这项工作得到了国家科学基金会(DBI-0332411)和美国农业部(03-35300-13104)对JMB的部分资助。

从属关系

1. 佐治亚大学米勒植物科学楼植物生物学系，佐治亚州雅典30602

   马克·A·查普曼和约翰·M·伯克

相应的作者

对应到马克·查普曼．

作者的贡献

MAC和JMB构思了调查，进行了分析，并撰写了论文。MAC进行PCR和测序。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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