的金属公差轮廓遏goesingense模仿拟南芥异源表达丝氨酸乙酰转移酶

背景

ni hyperAccumulator遏goesingense耐受尼法≅锌，≅CO和略有耐用> CD。以前观察到，由丝氨酸乙酰转移酶（SAT）的组成型活化驱动的升高的谷胱甘肽在Ni耐受性中起作用T. Temingense.．

结果

在这里，我们表明，谷胱甘肽的升高浓度，以前所示导致升高的耐受性拟南芥异常表达T. Temingense.线粒体丝氨酸乙酰转移酶（SATM），也会导致CO和Zn的耐受性，同时略微增强对CD的抗性。对每个金属提供的耐受性的水平排名为ni≅Co， > Zn， > Cd, Ni≅Co、>Zn耐受性与谷胱甘肽（GSH）的积累和抵抗这些不同金属诱导的氧化损伤的能力呈正相关。根据所使用的每种金属的相对浓度，观察到这两种金属对镉的抗性水平相对较低T. Temingense.和TgSATm表达线和CD电阻与GSH积累最短。

结论

这样的数据支持这样的结论升高谷胱甘肽水平，通过组成型增强SAT活性在超富集从动T. Temingense.，扮演的这个镍，钴和锌宽容和其他遏物种具有重要作用。在发展过程的通过SAT的过度活化是用于工程在潜在用于植物修复的转基因植物具有增强的耐受性金属极好的策略。

耐重金属的超富集专业植物中的自然现象已经引起了植物生理学家，植物生态学家和进化生物学家的利益超过50年[1］．对植物物种耐金属性的首次调查是由进化生态学家进行的，他们研究的是初级演替物种，这些物种可以在新形成的含金属土壤(如矿山废弃地)上定居[2］．近年来，金属（准）耐受性生理基础的理解已经因提高到新的分析和分子技术的发展[3.那4.］．我们的研究主要集中在金属超积累植物的耐金属生理方面，这些植物对其超积累的金属具有明显的超耐性。但是,某些Thlaspi.超积累物种也显示助耐受金属不一定存在于它们的天然生境[5.］．金属耐受性和金属超法差异不同但与相互相关的现象，并已广泛审查[1那4.那6.那7.］．在金属超法器中，金属耐受和积累的遗传决定因素独立隔离，确认不同的基因对这些现象负责[8.那9.]此外，通过揭示一系列可能控制超积累细胞摄取、积累和耐受的协调基因表达差异，转录谱分析为了解驱动金属超积累的遗传变化的身份打开了一扇窗户[10.-12.］

植物的金属毒性通常是由活性氧(ROS)的产生引起的[13.-17.］．降低的谷胱甘肽（GSH）强抗氧化剂可直接减少一些活性氧物种[18.]并且还提供了抗坏血酸的抗氧化剂GSH循环还原当量[16.］．之间以前的生化比较T. Temingense.以及密切相关的非累加器A. Thaliana.透露，在T. Temingense.由丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的更高活性驱动的谷胱甘肽水平的组成性升高，是在该物种中观察到的镍耐受性升高的部分原因[19.］．的异种表达T. goesingense SATM在A. Thaliana.显著增加谷胱甘肽水平，类似于T. Temingense.因而增强了对Ni的抵抗力[19.］．升高的拍摄水平O.乙酰基-L-丝氨酸，SAT的产品和谷胱甘肽的生物合成的前体最近一直显示到相关成分也与十字花科在众多属镍/锌超积累能力[20.］．

SAT和其产品OAS已显示控制负责硫酸盐还原和半胱氨酸的生物合成在植物[酶21.］．OAS和半胱氨酸的生产还限制了谷胱甘肽生物合成的总体速率和升高的谷胱甘肽池的维持[22.那23.］．含硫同化机制和GSH的产生是由重金属处理和氧化应激高度诱导的高度诱导[24.那25.］．虽然使用转基因方法增加了植物中的氧化胁迫耐受性，以产生升高的OA，Cys和GSH [26.-28.]，对类似的增加可能对植物的耐金属性产生的影响知之甚少。这些代谢物的增加，通过其生物合成中涉及的特定酶的过度表达，被发现导致植物耐镍A. Thaliana.[19.]和CD耐受性芥菜[29.］．

在这里，我们报道了我们GSH的作用的意见在赋予多种金属公差A. Thaliana.异常表达TgSATm．这些结果与在镍超蓄电池中观察到的金属容限曲线具有有趣的相似之处T. Temingense.用含有自然增强谷胱甘肽水平。这样的数据支持了我们的结论，即组成性升高GSH起着在多金属的（Ni，Zn和Co）中起重要作用，耐受性和镉抗性中观察到T. Temingense.和A. Thaliana.异常表达TgSATm．

镍超蓄电池的金属容限剖面T. Temingense.

总GSH成熟T. Temingense.和A. Thaliana.（Wassilewskija）以前测量，发现为412.5±80和±268.86 48.1纳摩尔克^－1FWT分别[19.].对T. Temingense.通过测量与不耐性相对相比，通过测量根生长来研究包括Ni，CO，Zn和Cd的各种金属，通过A. Thaliana.Wassilewskija（WS）（图。1）生长在含有镍，钴，Zn或Cd固化的MS培养基上的植物。当比较的根生长或抑制50％所需的金属的浓度（I_50.）T. Temingense.被发现对Ni≅Zn.≅CO，耐抗CD水平低（表1）.计算相对耐受指数(RTI)为I_50.(T。goesingense]/一世_50.[一种。蒂利亚纳]．通过使用Rti作为耐受性的比较衡量标准T. Temingense.对Ni≅Zn.≅CO，与...相比，耐低水平耐抗CDA. Thaliana.（WS）（表1）.为了研究有多少中观察到的金属耐受性T. Temingense.是由于氧化损伤的抗性增加，我们测量芽脂质过氧化T. Temingense.和A. Thaliana.在Ni, Zn, Co或Cd的存在下生长8天后(图。2）.我们观察到相对于A. Thaliana.超剖觉T. Temingense.在的Ni，Co和Zn的存在下生长后包含少显著过氧化脂质，然而在镉的存在下生长后没有观察到差异。

金属耐受特征A. Thaliana.异常表达T. Temingense.丝氨酸乙酰转移酶

以前，我们报道了异源表达T. Temingense.SAT（TgSAT_米），导致拍摄升高GSH水平，导致了增强的镍容忍A. Thaliana.[19.］．总GSH存在于此TGSAT-M.从平板作为幼株汇总的异源表达线是（S 4-9,496±20），（S 3-1,369±5），（S 5-4,188±9）Nmol G.^－1和代表高、中、低SAT表达子，而两个表型相同的空载体对照分别为(e1 - 5, 172±9)和(e4 - 5, 142±5)nmol g^－1FWT [19.］．除了TgSATm镍公差显示在垂直板上增长(图。3A，30 d）中，我们还发现金属公差对于Co（图3B.， 18 d)和锌(图。3C，18 d）和耐镉（图3d，18 d）。ni容忍TgSATm先前使用金属生长，抑制区分布，在板上进行量化，[19.] （无花果4A倪)。使用相同的圆盘分析，我们量化了植物的异质性表达TgSAT_米也耐受CO（图。4B.）和Zn（图4C），以及显示出增强的对Cd（图阻力。4D.）.通过使用线测量的水平TgSAT_米谷胱甘肽的表达、酶活性和积累[19.的高s4 - 9(黑色)、中s3 -1(灰色)和低s5 -4(白色)或非表达谱线，空载体e1 - 5(条纹)，对Ni、Co、Zn和Cd的生长响应A. Thaliana.转变为TgSAT_米．虽然这种分析方法只产生相对的公差测量，量化为与金属浸盘的距离，它允许高度可重复的结果和测量公差和积累在连续梯度的金属浓度。在这种方法中，我们使用不同的参数来评估植物的生长，而不仅仅是根的长度，包括正常直立茎子叶的发育，次生叶的形成，以及根与培养皿底部接触弯曲时根钩的形成。数据表示为金属浸泡盘周围每个环的幼苗总数的百分比。该分析充分利用了当金属从圆盘扩散时建立的金属浓度梯度，允许分辨线和各种金属之间的金属容忍差异。根据垂直平板和圆盘测试板上的茎和根生长的估计(图。3.＆4.），异源表达TgSAT_米观察到以提供具有镉抗性微量沿耐受的Ni，Co和Zn显著增加。

从拍摄材料TgSATm采集在离圆盘20毫米和35毫米处生长的细胞株和空病媒控制株，进行ICPMS分析，以调查各自的金属浓度。有趣的是，虽然对Ni、Co和Zn的耐受性在外源表达的品系中增加TgSAT_米其中，Zn的表达量最高(S 4-9)，中间(S 3-1) SAT的表达量和GSH的积累量均最高TgSATm从20mm的环收获线有1.3-1.5倍高的拍摄Zn浓度（8936±760 10050±458微克锌克^－1在（6704±656&6644±94μgZn-g）下，与低表达（S5-4）和非表达系（E1-5）比较^－1Dwt)。除Zn外，耐受性强的SAT品系总体上积累的金属含量均较高，其中Ni(~ 1200)、Zn(~ 6000 - 10000)、Co(~ 2000)和Cd (~ 2000) μg含量较高^－1DWT。

以确定是否增强的抗氧化应激在异源表达赋予的金属耐受性中发挥作用TgSAT_米在毒性水平的Ni，Co，Zn和Cd的存在后，我们测量植物芽中的脂质过氧化（图。5.）.这些结果表明，在使用Ni存在下使用的生长下，CO和Zn产生比Cd产生更大的脂质过氧化。他们还表明了具有相对强烈表达的线TgSATm（黑条），在Ni，Co或Zn存在下生长的植物中具有最低水平的脂质过氧化。但是，异源表达TgSATm在镉的脂质过氧化赋予没有减少暴露的植物，很可能是因为镉诱导的脂质过氧化作用是低的，即使在控制线（图5.）.

的异源表达TgSAT_米还观察到增加至过氧化氢电阻（图6.)。该测定法测量在强光下漂浮在不同浓度过氧化氢上的叶盘的剩余叶绿素含量。野生型和空载体A. Thaliana.用作对照并且产生相同的结果，对于空载体对照数据示（图6.）.这些结果确定了异源表达TgSAT_米也增强耐受一般氧化应激，超出特异性由生长在所测试的金属的存在而引起的。有趣的是，超富集植物T. Temingense.，已知已经形成了饱和活性并积累了升高的GSH [19.]，也表现出显著耐受性的过氧化氢的处理（图6.）.

GSH具有耐受性耐受Ni，Co，Zn的关联和增强抗CD的抗性

的异源表达TgSAT_米先前显示同时增加拍摄谷胱甘肽水平和Ni公差（Freeman等，2004）。在这里，我们看到，除了增加镍耐受性，提高GSH也导致增加的耐受性有限，锌和低程度的阻力，镉的生长抑制作用。然而，通过比较耐受镍，钴，锌，镉抗性的异源表达所赋予的大小TgSAT_米随着射击GSH的浓度，跨越具有不同水平的饱和表达，我们确定GSH在增强金属耐受的效果随金属而变化。针对幼苗环和金属的每条线和金属计算射击和根部的毒性百分比，在最高的情况下具有最大差异的差异SATm表达线与控制线进行比较。将这些公差值绘制针对每条线的GSH合成容量，并且发现该关系是线性的，随着GSH增加赋予Ni，Co，Zn和抗CD（DNS）的金属耐受性。从这些绘图的斜率，在芽和根部的每种金属中获得金属耐受Vs GSH浓度值（图。7.）.芽GSH浓度的等同增加最有效地在增加Ni和Co的抗血液耐受性时，其紧随其后的是Zn，并且最低有效是Cd抗性。GSH还引起了根部的升高的金属耐受性，其次是Ni和Zn，而根部的CD抗性与总GSH生产最短相关。然而，未测量根中的金属水平，并且这里CD可能高得多，因为已知CD积聚在根中。

这T. Temingense.在本研究中，选择线粒体版本的SAT，而不是叶绿体和细胞质版本的SAT，因为它向细胞传递了高水平的镍耐受性A. Thaliana.[19.]，并且由于其高序列相似性（95.0％的身份）到了A. Thaliana.线粒体同源At3g13110 [19.］．此外，在大肠杆菌那TgSATm赋予增强的抗性抗性[30.]，最初用于克隆这三个不同的SAT CDNAT. Temingense.[19.］．此外，过表达细胞质，线粒体或叶片坐落T. Temingense.或者叶绿体SATA. Thaliana.在大肠杆菌均授予Ni和Co大致相等的容忍度[30.］．SAT（TGSAT-M）的线粒体同种型也被选择用于本研究中的过度表达，因为过度表达了患者的不敏感A. Thaliana.同源物AtSAT-m（SAT A）在烟草中过度表达并靶向质体或细胞质溶胶时，已被证明在Cys和GSH浓度方面显著升高[21.］．除了使更多OAS，Cys和GSH在线粒体中，其然后可以被输出到胞质溶胶和其它细胞器，线粒体TgSATm的过表达可以降低镍引起的ROS的形成，使电子传递链仍然可以提供细胞有需要的功能的能量。

超剖觉T. Temingense.对升高的Ni，Zn和Co的生长抑制作用具有显着的耐受性，对CD具有轻微的抗性（图。1和表格1)，在某种程度上，这似乎是由于抗镍、锌和钴氧化作用的能力增强(图2）.GSH水平升高中T. Temingense.被认为有助于这种植物的耐镍性，通过增强对这种金属的氧化作用的抵抗力[19.］．我们假设GSH的升高也导致了对Co和Zn的耐受性升高，但对Cd的耐受性较低。为了解决这个问题，我们使用了转基因A. Thaliana.异常表达TgSAT_米先前已表征为含有GSH的拍升高浓度的赋予增强的Ni [电阻19.］．

除了NI之外，我们对这些相同植物的金属耐受的分析表明，与控制线相比，在升高的CO和Zn的情况下，在升高的Co和Zn的情况下，它们也具有对生长的耐受性（图。3.＆4.）.有趣的是，高中和中级TgSATm发现表达系积累〜1.4倍的锌相比时低和非表达系。这表明，增加GSH，因此锌能力可能积极地影响植物锌积累机制。

此外，这些转基因植物也显示增加的阻力，以脂质peroxidizing Co和Zn（图的影响。5.），表明GSH在该增强的CO和Zn电阻中的至少一种的GSH的作用是抗氧化剂。这些结果镜像以前观察到的那些[19.］．然而，这些线中的GSH浓度升高对在CD存在下生长的植物中的脂质过氧化水平没有影响，表明GSH通过潜在的未知替代途径通过增加的合成植物精素（PC）来赋予CD的增强耐受性（PC）.考虑到这两种情况都非常低T. Temingense.和TgSATm与CD相比，可以耐受至少含有4倍的Ni，Co和Zn的平板上的增长。

我们的结果证实了TgSAT_米还能增强对过氧化氢和强光处理引起的其他氧化应激的耐受性(图。6.).超积累者T. Temingense.，已知其具有组成性升高的SAT活性和累积的GSH升高[19.[还显示出对过氧化氢处理的高耐受性（图。6.）.

对这些转基因品系中GSH赋予金属耐受性的能力的分析还表明，在芽中GSH最有效地赋予Ni=Co>Zn>Cd的耐受性（图。7A）.这种活性紧随通过在这些三种金属生长产生的脂质过氧化作用的图1中的水平（。5.）.GSH生产在赋予CD耐受性时最不有效（图。7A），这是由Cd处理（图后的脂质过氧化的无还原举例说明。5.）.根中谷胱甘肽赋予Co > Ni = Zn > Cd(图。7B.）.

同时T. Temingense.和TgSATm转基因，SAT增强的Ni，电阻似乎不涉及PC协调。这完全支持在这些植物中完全缺乏对NI的硫醇协调[19.那31.]也在大肠杆菌异源表达相同的基因[30.］．另外，Zn也不是通过锌耐受高沉积器中的PC或硫醇协调的T. Caerulescens.[32.］．它也已在遗传上确定A. Thaliana.PCS null突变体CAD1.，其没有可测量的PC，该PC不参与在任一的Ni或Zn电阻A. Thaliana.而是直接需要的镉抗性[33.-36.]。而PC显然不涉及对镍和锌的电阻A. Thaliana.，Co也未能激活A. Thaliana.纯化AtPCS1活性测定中的PC合成[37.］．因此，考虑到Ni和Co之间的化学相似性，我们可以推测，转基因植物中观察到的Co抗性增强是由于GSH增加的直接抗氧化作用。

我们的研究结果建立了升高的射击GSH和耐受脂质过氧化作用的耐受脂质过氧化效应的强烈联系T. Temingense.和转基因A. Thaliana.含有升高GSH浓度。这种链接是通过在两种转基因升高GSH水平的观察结果的支持A. Thaliana.和T. Temingense.与增强对过氧化氢和强光处理引起的过氧化物效应的抵抗力相关。

因此，我们得出结论，在合金中观察到对Ni、Co和Zn的多种金属公差T. Temingense.是由于在这个超蓄能器中观察到的茎中谷胱甘肽水平的结构性升高。在拟南芥中，拟南芥通过异源表达拟南芥TgSATm该基因可导致叶片中谷胱甘肽积累增加，增强抗氧化应激能力。

植物生长板

植物在发芽并生长在0.8％的植物组织级含有1/2强度MS + Gamborgs B5培养基平板琼脂单独或与下16小时的白色光的不同的金属（120微摩尔米^－２年代^－1光合光子通量（PPF））。如前所述的所有干芽组织对不同金属水平进行不同金属水平的ICP-MS分析（Lahner等，2003）。

金属耐受测定

在金属性A. Thaliana.物在含有1/2强度MS + Gamborgs B5培养基中0.8％的植物组织级琼脂板（100×25mm）的测试。从种子A. Thaliana.异源表达goesingenseSATm空的矢量控制线被发现成同心环，从放置滤纸盘的平板中心辐射。将100μL的100毫米镍（无_3.）₂，100毫米钴_3.）₂，400毫的Zn（NO_3.）₂或50毫米CD（没有_3.）₂移液，24°C/20°C, 10 h/14 h光照/暗，120 μmol m^－２年代^－1PPF。13天后的增长从吸入具有完全扩展的子叶的直立幼苗的百分比，将次叶和钩状根用于每个环，以及来自金属浸泡过滤盘的距离。然后收获来自20和35mm环的幼苗以进行金属水平的ICP-MS分析。如前所述对干芽组织进行金属分析[38.］．

过氧化氢处理

涉及从完整的成熟叶片的中心切下1厘米直径的叶盘的过氧化氢处理。圆盘漂浮在为H₂O.₂在24°C恒光条件下(180 μmol m .^－２年代^－1生产可能性边界)。在96％乙醇中提取后654nm测量总叶绿素百分比[39.]，并归一化到水处理组织中观察到的叶绿素。对照的叶绿素含量（h₂o）所有植物的治疗均为每克的每克鲜重相同。总叶绿素mg g^－1FWT;T. Temingense.= 1.55±0.32，A. Thaliana.= 1.57±0.13，转基因TgSATm= 1.58±0.13。

总脂质过氧化的定量

将过氧化的脂质被测定为存在t高巴比妥一个creactive年代Pecies（TBARS）。在16小时白光下植物长17天（120μmolm^－２年代^－1PPF）在含有1/2强度MS + Gamborgs B5培养基中0.8％的植物组织级琼脂垂直琼脂平板上。经过4或8天转移到1/2强度MS + Gamborgs B5培养基中0.8％的植物组织级琼脂平板，含或者镍，钴，Zn或Cd，芽组织收获并如前所述测定TBARS [40.］．在金属暴露期间，所有植物都能存活并继续生长

根长抑制

T. Temingense.和A. Thaliana.在含1/2浓度MS + gamb5培养基、0.8%琼脂、不同浓度Ni、Co、Zn和Cd的垂直培养基上，在白光(120 μmol m .)照射16小时下培养18 d^－２年代^－1生产可能性边界)。(我^50.)这些数值是通过计算平板中的金属浓度来计算的，平板中使用的不同金属对两种植物的根系生长都有50%的抑制作用T. Temingense.和A. Thaliana.．在没有任何金属的情况下，在控制板上测量最大正常根生长。

¹这项工作是由美国国家科学基金会（批准号：0196310-IBN和0129747-IBN到D.E.S.）和印第安纳州21世纪的研究及科技基金的支持。特别感谢普渡Ionomics中心，尤其是布雷特Lahner为电感耦合等离子体的分析。

从属关系

1. 植物环境压力生理中心，普渡大学，园艺和景观建筑部门，西拉斐特，印第安纳州，47907，美国

   约翰·弗里曼和大卫·索尔特

2. 科罗拉多州立大学生物系，分子植物生物学，科林斯堡，科罗拉多州，80523，美国

   约翰·弗里曼大号

相应的作者

通信约翰·弗里曼大号．

作者的贡献

DES设想的实验主要来自JLF。JLF撰写的论文主要来自DES, JLF主要负责进行实验。所有作者都已阅读并批准了最终稿。

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