植物赤霉素信号通路组分的进化保护

背景:

赤霉素(GA)是一种植物激素，可以调节发芽、伸长生长和性别决定。它们普遍存在于种子植物中。赤霉素受体的发现，以及对拟南芥和水稻赤霉素信号传导关键组分功能的了解，揭示了一条相当短的赤霉素信号转导途径。该途径主要由GID1赤霉素受体组成，该受体与F-box蛋白相互作用，进而调节下游DELLA蛋白的降解，抑制ga控制的反应。

结果:

拟南芥赤霉素信号化合物的序列被用于筛选包括原生生物在内的多种植物的数据库，以寻找同源物，为该途径的保护程度提供指示。这种通路在原生生物苔藓中完全不存在Physcomitrella金属盘与拟南芥蛋白只有有限的同源性，因此缺乏经典GA信号通路的基本特征，而石松卷柏moellendorffii包含每个组件的可能的同源物。经典GA反应的发生还不能与信号通路的同系物的存在联系起来。GA信号组分在相邻连接树上的比对和显示证实了裸子植物、单子叶植物和双子叶植物之间的密切关系，这与先前的研究结果一致。

结论:

ga信号通路的同源物主要存在于维管植物中。GA信号系统的进化分子起源可能是在Physcomitrella金属盘较高浓度的气体会影响向地性和伸长生长。

赤霉素(giberellins, GAs)是一大类激素，在植物整个生命周期的一系列反应中起着重要作用。它们主要刺激发芽，使细胞膨胀，调节开花时间。由于它们的高经济相关性，气体对细胞伸长的影响受到强烈的科学研究。绿色革命的基础是水稻和小麦品种的矮化选择。最近有研究表明，这些矮化基因干扰了GAs的产生或作用[1]。对GA生物合成的化学干扰通常用于限制植物(包括树木)的生长[2]。气体首先被分离出来赤霉菌属（镰刀菌素）fujikuroi(3.]。这种真菌会导致水稻的伸长生长，这种水稻被称为“愚蠢”水稻，因此更容易倒伏。

除了赤霉菌属、其他菌类(Phaeospheria，AphacelomaSp .)和各种细菌[4能够合成气体。因此，在许多植物物种中都发现了气体，并且在光合作用生物中广泛存在。在单细胞和多细胞藻类中检测到ga样物质[5- - - - - -7]，地衣和苔藓[8]和蕨类植物[4但最重要的是，它们被广泛接受为种子植物中一般的生长控制激素。4]。

在生物体中存在气体并不一定意味着它对这些化合物有反应。例如,赤霉菌属本身不会对外源GA起反应[3.]。根据单细胞藻类的种类，GA可以略微增加生物量[9]。在大多数种类中，气体对单细胞藻类伸长生长的影响要么很小，要么不存在[10]。然而，据报道，多细胞藻类的生长有所增加Porphyra在二倍体中，丝状孢子体螺珠期，与生长素结合，在匍匐茎中石莼以(10，11]。

而ABA、生长素和细胞分裂素可诱导苔藓类植物特异性发育改变Physcomitrella金属盘，而ga的应用并无此影响[12，13]。然而，一些较早的报告确实指出，在特定的苔藓物种上施用ga可能会略微提高生长速度[14，15]。此外，施用ga可能会干扰苔藓的向地性Ceratodon紫色(16),Pottia媒介物(17]。事实上，到目前为止，还没有在苔藓中发现赤霉素，有人提出激素信号通路是在陆地植物进化的后期发展起来的[13]。然而，这样的途径并不完全出现新创因此，GA可能从其进化而来的前体应该存在于苔藓中。叔丁烯是赤霉素生物合成的关键中间体。最近，有证据表明p .金属盘作为次级代谢物产生大量的挥发性化合物，如四环二萜[18]，并具有双功能的对烯合酶[19]。

据我们所知，尚无关于GA调控蕨类植物生长的报道。相比之下，它们对种子植物(如针叶树)的伸长和发芽的刺激作用已被广泛记录[20.，21和被子植物，包括单子叶和双子叶植物。

性别决定是另一种已知的遗传效应。在物种中轮藻， GA促进肛腺(男性性器官)形成[22]。同样地，在一些蕨类植物中，它们作为卵孢子体形成的启动子[23，24]。有趣的是，在许多苦子叶植物中，GAs也促进了雄花的发育[25]。相反，在单子叶玉米中，它们促进雌花的形成[26]。

据推测，最终导致种子植物萌发和伸长生长的GA信号通路由有限的几个因素组成(图2)1）.近年来，水稻的GA受体(GID1)和拟南芥已被发现[27，28]。受体能够以GA依赖的方式与DELLA蛋白相互作用[27，28];相互作用完全取决于DELLA蛋白中DELLA结构域的存在[29]。DELLA蛋白(如拟南芥中的RGA)是GA反应的抑制剂，在GA存在下被分解，从而促进萌发和伸长生长[30.]。这种降解是由E3连接酶介导的，该连接酶由F-box蛋白指定(如拟南芥中的SLY1或水稻中的GID2) [31- - - - - -33]。因此，GA信号通路本质上由三个相互作用的参与者组成。

在过去的几年里，三种植物的基因组已经完全测序[34- - - - - -36并通过表达序列标签(EST)测序和组装，努力解开“基因组更复杂”植物的基因库。有了各种开放获取的EST和基因组序列数据库，一次对大量物种进行比较基因组学和分子系统发育分析成为可能(plantGDB， [37])。基于上述工具，我们研究了整个植物界藻类和植物中GID1、SLY1和DELLA蛋白形成的GA通路的保守性，并使用不同主要植物类群的参考物种(图2)1 b）.现有的同源物是从各种高等植物中检索到的，但从Physcomitrella金属盘（页）.因此，GA信号通路的存在可能只与维管植物有关。

赤霉素受体

GA受体(GID1)属于激素敏感脂肪酶大家族，在整个植物界都有同源物，因为它们在序列上与各种羧酸酯酶相关[qh]38]。此外，这些蛋白质的预测三维结构是相似的。然而，GA受体含有不同的区域，这将它们与羧酸酯酶近亲区分开来[28，38]。在GID1蛋白中，通常存在氨基酸Arg265，而来自酯酶催化位点的His340残基缺失。

在进行TBLASTN搜索时，没有发现同源物(E < E -10)Cyanidioschyzon merolae(属于红藻门，红藻)，也不在衣藻reinhardtii(属于绿藻门，在绿藻中)。在青苔中Physcomitrella金属盘（页)，与the最接近的同源词拟南芥GA受体缺失Arg265，取而代之的是Leu(图)2）.这种精氨酸对赤霉素结合特别重要，因为蛋白质携带赤霉素gid1-2突变，其中残基变成Thr，在体外不能与赤霉素结合[27]。此外，N端和c端Physcomitrella与GID1蛋白不同。由AT5G23530编码的蛋白也缺少GA受体中特有的Arg265，但保留了酯酶催化位点的His340，它被GA受体中的Ile或Leu和Trp所取代页同系物。这些数据支持了最近的同源物在页是大型羧酸酯酶样基因家族的一部分，但缺乏完整赤霉素信号传导所必需的特征和在酯酶中保守的特征。

无籽维管植物卷柏moellendorffii(属于石松双藻门)有一种蛋白质，似乎是真正的GA受体同源物。它具有良好的整体一致性(47%相似度)，与来自页，它含有Arg265残基。它在340位也有一个保守的Ile，而不是已知GA受体典型的His。

从对蕨类植物有限EST集(~8000)的分析毛茛(蕨类植物门，水蛭目)，我们得出结论，它具有相关的羧酸酯酶，所有这些酶都具有酯酶活性所必需的保守的His340。然而，EST集合太小，不能完全排除真正的GA受体同源物的存在。

在种子植物中，包括裸子植物和被子植物，GID1同源物广泛存在。在邻居连接(N-J)树中可以看到单子树和双子树之间的明显分离(图2)3.）.有趣的是，松树的同源物属于双科植物的不同序列，这表明该蛋白在高等植物中具有高度的保守性。总的来说，基于ClustalW序列的GA受体N-J树显示了一种高度让人想起今天普遍接受的进化方案的关系[39]，总体上最相关的植物聚集在一起。

昏昏欲睡的同系物

不(E < 1e)⁴)中发现了F-box蛋白SLY1的同源物衣藻reinhardtii,也不Cyanidioschyzon merolae使用TBlastX。

一个相互的爆炸产生另外三个拟南芥蛋白(At3g44326、At2g27310、At2g36090, BLASTP评分分别为71、56和55)与该蛋白关系更密切页图中SLY1(997094760)的同源物4)比SLY1本身(BLASTP评分54)，表明在页。事实上，与sle1同源性最高的，在页蛋白质，发生在F-box区域。该区域是与scf复合物内Skp1伴侣相互作用所必需的，并且不赋予底物特异性。后者通常由c端部分实现[40]。c端子部分页同系物与水稻和水稻高度不同拟南芥F-Box蛋白GID2和SLY1(图4）.GGF (AA)在图中的位置为120-1604)和LSL动机，在GID2和sl1中保守[31，41]，在…页同源性，与GA相关的F-box蛋白同源性较低，几乎没有同源性。因此，这是值得怀疑的，而且不太可能页蛋白可以识别DELLA蛋白作为底物。

从卷柏，可以检索到与sle1全长同源的蛋白，包括c端富含亮氨酸的盒子(图2)4）.互反blast表明该蛋白可以被认为是高等植物蛋白的同源物(相似性为51%)。

蕨类植物的EST数据库Ceratopteris只产生了一个c端分化的F-box蛋白(数据未显示)。因此，F-box蛋白存在于蕨类植物中，但仍未发现与SLY1同源的蛋白。

与GA受体类似，在裸子植物和被子植物中，SLY1同源物广泛存在。然而，F-box蛋白是一个非常不同的多肽家族。在N-J树中形成一个聚类(图1)5)，而单子叶植物与裸子植物归为一类。有一个独特的组包含高粱甘蔗和许多针叶树序列。在这组序列中，到sle1的进化距离大于到sle1的进化距离页同系物。第二个单被子裸子植物群与最接近的sle1同源拟南芥，打喷嚏(SNE)，和它的同系物(图5;(42])。SNE过表达拟南芥可以接管遗传信号事件，但尚未发现自然条件下遗传信号的明确参与。

DELLA相关转录因子

DELLA蛋白属于植物特异性的GRAS (GAI, RGA，稻草人)蛋白家族[43]。的RGA1基因cDNA序列拟南芥用于TBLASTX筛选其他物种的同源物。

没有DELLA同源物(产率为0,E = 1e)⁴)在Cyanidioschyzon merolae或衣藻reinhardtii。

的n端部分拟南芥使用tBLASTx对RGA1的基因组痕迹和ESTs都没有产生对应的RGA1页。对最接近的RGA1同源物的基因组区域进行重建，证实在n端DELLA结构域不存在实质性的同源性(图2)6）.不是DELLA主题，而是页蛋白质含有氨基酸DQGFR。此外,页蛋白质缺乏四个保守的Tyr残基中的两个，这些残基在蛋白质中具有重要的结构意义拟南芥DELLA蛋白RGL2，并使RGL2易受GA介导的降解(图2)6;(44])。

相比之下,卷柏包含一个清晰的RGA1同源物。蛋白质(图)6)由基因组序列重建，因为匹配的ESTs没有覆盖n端部分，可能是由于EST库中没有该部分。来自基因组重建的部分序列可能代表内含子，尽管覆盖c端部分的EST(图中从位置340开始)6)与基因组序列相同。

从一个有限的EST组(~6000)蕨类植物Ceratopteris richardii我们只发现了一个与RGA1最接近的稻草人样基因(AY974159)。然而，对于SLY1，考虑到EST集合的规模较小，我们不能排除蕨类植物中DELLA同源物的存在。

虽然没有完整的DELLA蛋白序列可以从现有的松树的contigs和ESTs中检索到，重叠同源片段从两个不同的蛋白质表明存在真正的同源物(如相似的Pttc59241 - 59240长沙RGA1为46%)。在裸子植物和被子植物中，DELLA同源物存在于各种物种中(图2)7）.与GA受体和F-box蛋白的情况类似，单子房与裸子植物和/或裸子植物的关系更密切卷柏，而不是批评家。

值得注意的是，与DELLA编码序列同源的ESTs较多;然而，它们缺少跨DELLA域的n端部分(参见附加文件)1）.这可能是由于在可用的EST集合中缺乏编码序列的5'端，或者仅仅是因为某些蛋白质只包含与c端部分的同源性[45]。

外源GA处理对小笠藻生长的影响

由于气体在维管植物中是有效的生长刺激激素，并且Physcomitrella至少有一种蛋白质与赤霉素受体密切相关，问题是提示是否存在Physcomitrella对赤霉素有反应。10、100、500、1000 μM的GA处理_3.不影响原胞体(由绿胞和茎胞组成)的一般生长;(46])在正常光照条件下。然而，当在黑暗中直立生长时，对照和10 μM GA处理的植株都出现了向地性生长的细长茎生体。在相对高的GA下_3.浓度在100 μM及以上时，茎突的形成受到强烈阻碍，生长方向发生改变(图2)8）.而未经处理的原丝体垂直生长，GA_3.经处理后的植物向不同方向生长，呈现出与垂直方向不同的角度，表明其倾斜性存在缺陷(图2)8 k）.这种反应让人想起高浓度赤霉素(500 μM)对另一种苔藓原体向地性的影响。Ceratodon紫色(16]。

在进化的尺度上，GA信号通路是在哪里出现的?

植物进化研究的一个中心节点可能是对苔藓的研究页站立模型[47，48]。气体存在于各种苔藓中[8]。目前没有GA含量的数据Physcomitrella是可用的，但关键酶(基因GA1-GA5)的同源物拟南芥)，发现了GA生物合成途径(数据未显示)。虽然Physcomitrella有同系物的所有三个GA信号组件，这是值得怀疑的是否他们是真正的同源物。因此，赤霉素信号传导在苔藓中可能不像在维管植物中那样起作用。F-box蛋白序列在F-box外与SLY1的差异，以及与RGA1的近亲“DELLA”区域缺乏同源性，可能表明DELLA样转录因子与SLY1/ gid2样F-box蛋白之间存在其他识别动机。的della样蛋白Physcomitrella可能不作为GA调节的GA反应抑制因子，因为在GA治疗中表达时是稳定的拟南芥(13]。它更可能在植物发育中发挥调节作用，在GA处理下保持稳定，类似于水稻的slr样GRAS蛋白[45]。此外，由于“真正的”GA响应于Physcomitrella，例如刺激生长，这类激素在苔藓中可能效果较差。然而，外源赤霉素能有效地刺激肝草的生长Pellia epiphylla表明在进化早期赤霉素信号的存在[49]。

综上所述，苔藓可能已经失去了有效遗传信号的能力，或者使用维管植物的替代系统来传递信号。这是否涉及维管植物途径的同源物尚不清楚。在未来，它可能是有趣的研究轮藻这是一种更原始的胚胎Physcomitrella，据报对ga有反应[22]。

的lycophyte卷柏moellendorffii对GA通路的所有成分都有明确的同源物，并且是我们目前所知的拥有完整功能的GA信号通路的最原始物种;然而，表型反应仍有待发现[13]。因此，正如早期的研究表明的那样，它的顶端生长仅限于孢子体，维管组织的存在，根和叶的形成，甚至是它的基因组序列[50，51]，卷柏与种子植物密切相关。这在GA信号传导的分子成分水平上得到了证实。

非维管植物中的GA信号?

近年来，GA对非维管植物伸长生长的影响还没有令人信服的报道。关于GA对植物影响的早期出版物应该仔细阅读，因为在处理中使用的化合物的纯度通常不是那么明显[52]，由于缺乏现代分析技术。此外，一些分析是在其他激素如生长素或细胞分裂素浓度很高的情况下进行的[11]。由于在过去的二十年中，除了维管植物外，没有其他生物(浓度低于10 μM GA)真正的激素效应的报道，因此很容易推测GA信号是随着维管植物的出现而出现的(图中的假设1)9）.

如果这些早期研究中显示的影响确实是真正的GA效应，那么苔藓和其他分支可能失去了对GA的反应能力(图中的假设2)9）.然而，也有可能非维管植物采用了维管植物以外的其他机制来传递遗传信号，最终服务于其他尚未发现的响应。假设我们所知道的GA信号是维管植物的典型信号，而非维管植物有其他化合物和其他机制来触发GA样反应，那么可能存在与GA生物合成进化平行的机制。真菌赤霉菌属与植物合成气体的酶完全不同[3.]。因此，有人提出，ga的合成是真菌和植物趋同进化的一个例子，涉及副同源物而不是同源物。

在蕨类植物中，我们发现了羧酸酯酶和稻草人样基因家族成员的同源物，分别属于GA受体和DELLA转录因子。考虑到蕨类植物中GA响应的存在[4]和可用的EST序列数量有限，可以合理地假设，在未来，将发现与GA信号元件的同源物。

赤霉素是性别决定因素

除了可能在伸长中起作用外，有趣的是，在非种子植物中，如蕨类植物甚至蕨类植物，以及一些苦子叶植物中，雄性器官是由GAs促进的[23，25]。目前尚不清楚是否相同的受体、F-box和DELLA成分同时参与伸长生长和性别决定。GAs的第一个功能可能是刺激雄性配子体功能。因此，GA信号可能首先作为性别决定因素出现。GA受体首先作为羧酸酯酶家族的一部分实现，与PrMC3具有同源性。有趣的是，PrMC3最初是从玉米的雄性球果中分离出来的，并在玉米的雄性球果中特异性表达松果体放射虫纲(53]。未来的分子生理学研究有必要揭示这一羧酸酯酶家族在植物中的重要性，以及它们的一些成员特别是在(男性)生殖器官中存在的原因。

众所周知的赤霉素信号通路拟南芥水稻在石生植物、裸子植物和被子植物中保存良好，这反映了迄今为止已知的陆地植物中水稻的广泛分布。然而，除了受体外，苔藓中似乎缺少通路成分Physcomitrella，这表明苔藓植物可能从进化开始就对赤霉素做出了有效的反应，而赤霉素产生了比维管植物更多的反应(如向地性)。没有其他非维管植物和原生生物(如Charales)的核EST或基因组序列，也没有多细胞藻类，仅局限于蕨类植物。但是，大量的EST收集和各种生物的BAC克隆正在等待测序(CUGI, Clemson, SC)。随着更多基因组的测序，GA信号系统发育的更完整图景将被绘制出来。

序列检索

拟南芥GID1b、SLY1和RGA基因cDNA序列取自TAIR网站。这些序列被tBlastx用默认参数与Tigr的单基因集合搜索同源物柑橘类HarvEST数据库(加利福尼亚大学的Wanamaker和Close)， Cosmoss转录组和基因组(测序覆盖率为8倍)数据库(德国弗莱堡大学的Stefan Rensing)， PHYSCOBASE数据库[54),卷柏普渡大学的数据库[55),Cyanidioschyzon merolae东京大学数据库[56]，明尼苏达大学CCGB的火炬松ESTs铁树来自纽约植物园的EST集合和测序的EST集合绒毛附毛，Marchantia polymorpha，千岁兰君子兰，Ceratopteris richardii，Mesostigma viridae聚集在plantGDB。带有参考编号的表格可在补充数据中找到(见附加文件)1，2，3.）.

蛋白质序列重建

检索到的est卷柏moellendorffii扫描塞拉菌基因组寻找同源序列。5'和3'端几乎在染色体上行走，并在原始EST(与dna同源)周围约10 kbp的范围内分离出克隆拟南芥序列)。为Physcomitrella金属盘F-box蛋白，采用相同的方法。对于DELLA同源词来说拟南芥蛋白质序列被直接用于扫描cosmos数据库的基因组痕迹(Stefan Rensing, University Freiburg)。检索到的克隆(请参阅其他文件)4，5，6)提交到PHRAP过程以产生contigs。从这些组合中，蛋白质通过做an得到在网上翻译(57]。的页F-box蛋白同源物和DELLA同源物从cosmos数据库翻译为单个外显子。一个页受体同源物在R157和R158之间有一个预测内含子(图2)2）.预测的内含子在重建蛋白中被遗漏，并且在3'端离框2bp。对于图中的对齐2，采用Physcobase contig 12981的序列。在网上翻译也适用于来自松树的无害环境技术。检测打开的阅读框并检查与原始的同源性拟南芥BlastP中的蛋白质。

比对

使用VectorNTI包(Invitrogen)中的ClustalW算法进行蛋白质比对。利用ClustalW[]在线对编码序列和ESTs进行多次比对。58](京都大学生物信息学中心)，使用默认参数并选择philips输出。邻居连接树是在[58]。使用IUB进行多项对照试验(网址:[58])，在潘塔rhei包中进行对话[59];德国比勒费尔德大学)和MAVID [60对齐协议。所有的控制结果都相似。用VectorNTI软件(Invitrogen)计算相似值。

赤霉素对小立杆菌的治疗

Physcomitrella金属盘(Hedw)。如前所述，B.S.G.在液体和固体Knop培养基中培养[61]。遗传算法_3.由Duchefa (Haarlem, Netherlands)购买，0.25 M原液在EtOH中制备。将5 μl干重为100 mg/l的新鲜传代苔藓原丝体分别置于含有0、10、100、500和1000 μM GA3的Knop板或含有相应量EtOH的对照板上。在正常条件下(25℃，光照16 h, 55 μmol/sm)生长1周后²(8小时黑暗)用铝箔覆盖，直立放置7天。为了记录，这些植物被拍了下来。

遗传算法:

赤霉素

页:

Physcomitrella金属盘

Sm:

卷柏moellendorffii

GID1:

赤霉素不敏感侏儒，一种GA受体

狡猾的:

SLEEPY是一种参与GA信号通路的F-box蛋白

RGA:

抑制因子的ga1

一种DELLA蛋白

作为GA反应的抑制因子

菲利普·范登布舍是佛兰德斯研究基金会的博士后研究员。DVDS和RR分别感谢弗兰德斯研究基金会(two G.0313.05)和DFG (RE837/7)的资金支持。作者感谢J. Banks博士(普渡大学)访问Selaginella数据库。

从属关系

1. 单位植物激素信号与生物成像，根特大学分子遗传学系，Ledeganckstraat 35，根特，B-9000，比利时

   philip Vandenbussche和Dominique Van Der Straeten

2. 鲁汶大学微生物与分子系统系，Kasteelpark Arenberg 20，鲁汶，3000，比利时

   安娜·C·菲耶罗

3. 德国弗赖堡大学植物生物技术学院，Schaenzlestr. 1，德国弗赖堡79104

   Gertrud Wiedemann & Ralf Reski

相应的作者

对应到Dominique Van Der Straeten。

作者的贡献

FV和dvd孕育了这项研究。FV检索序列并进行比对分析。ACF有助于序列的组装和contigs的重建。GW对Physcomitrella金属盘。FV与RR和dvd一起撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。

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