摘要
背景
不同橄榄的花粉(Olea Europaea不同品种的Ole e 1含量和总体致敏性存在显著差异。此外，该过敏原的特点是其序列具有高度的多态性。本研究的目的是评估不同橄榄品种Ole e 1序列可能存在的差异。
结果
从10个橄榄品种中分别收集的花粉中的RNA用于通过RT-PCR扩增OLE E 1序列，通过使用不同的生物信息学工具分析序列。在整个序列中检测到许多核苷酸取代，其中许多含量在推导的蛋白质序列中导致氨基酸取代。在大多数情况下，单个品种内的变异性远低于品种的变化。与先前在文献中描述的“规范”序列的关键氨基酸变化包括：a）C19-与蛋白质 - ，b）的二硫键结构的取代替换为另外的N-糖基化基序和C.）影响OLe E 1区域的点取代已经描述了与蛋白质的免疫原性/过敏性相关。
结论
橄榄花粉的品种来源是决定Ole e 1变种多样性的主要因素。我们认为，这一信息对于高效和安全的过敏原配方的优化设计至关重要，对过敏原的改良形式的基因工程及其他应用也很有用。
背景
橄榄 （Olea Europaea花粉在广泛种植这种植物的地理区域的人群中产生呼吸道过敏，主要是地中海周边国家以及北美、南美和澳大利亚的一些地区[1，2]。截至目前为止，已有10种过敏原，即Ole e 1至Ole e 10，在Olea Europaeal .花粉(3.，4]．主要过敏原Ole e 1为18-22 kDa蛋白，表现为酸性pI和不同形式的n -糖基化[5，6]．除了在其他成员的同伴对同性恋中的高同源性之外木犀科家庭，如丁香和privet [7，8]，OLE E 1与来自玉米的ZM13的番茄ZM13和几个延长素展现出相关的相似性。拟南芥和烟草在其他蛋白质。这些蛋白已被索引，就像Pfam蛋白家族数据库中以“Ole e 1家族花粉蛋白”(登录号:PF01190)命名的成员[9]．这些植物花粉蛋白在结构上有关。它们最可能被分泌并包含约145个残留物。这些蛋白质序列中有6个半胱氨酸似乎参与二硫键。虽然他们的生物学功能尚不清楚，但他们已经建议参与花粉形成期间的重要事件，例如水合，萌发和/或花粉管生长[10.- - - - - -13.]．
来自不同橄榄品种的花粉在结合IgE抗体和引起过敏反应的能力上有很大的差异在活的有机体内和体外技术(14.- - - - - -17.]．值得注意的是，在几种橄榄品种的花粉中描述了OLE E 1含量的定量差异，其与这些花粉中存在的OLE E 1转录物的量呈正相关[17.]．虽然这些定量的差异是患者对不同品种花粉的不同反应可能负责，其他因素的concomitances不能丢弃。在这种情况下，来自橄榄花粉等主要和次要变应原的作用，和OLE的发散表位的存在E在不同品种1进行评估。
OLE E 1在其核苷酸序列中呈现了许多微观的细胞性[18.，19.]．在许多情况下，这些核苷酸的替换导致天然蛋白质中的氨基酸发生变化[20.据报道，已经据报道，影响IgE分子与OLE E 1蛋白的结合[21.]．然而，迄今为止，存在这种多态性的存在从未与测试的花粉的遗传来源有关。相反，来自不同来源的不确定原点或花粉混合物的市售花粉似乎是用于生化，分子和免疫学表征过敏原的常用材料。在橄榄中存在极宽的种质，在世界上培育了1200多种品种[22.明确指出这种遗传变异是Ole e 1序列不一致的假定原因。这项工作探索了Ole e 1变应原在多个橄榄品种的分子变异性，并讨论了这种多态性在植物生物学和过敏症状发展中的假定含义。
结果
序列分析
对8个橄榄品种花粉的RNA进行Ole e 1 RT-PCR扩增，并对每个克隆的PCR产物进行测序，得到24条原始序列。获得的核苷酸序列保存在GenBank™/EMBL数据库中(见表1)1）.
通过核苷酸 - 核苷酸爆炸（BLASTN）计划单独分析这些序列[23.]．在所有情况下包括较高的身份分数，在所有情况下都存在于NR中存在的OLe E 1的不同变体（非冗余所有GenBank + Embl + DDBJ + PDB序列 - 但没有EST，STS，GSS，环境样本或相0，1或2 HTGS序列 - ）数据库，包括以下简章：X76396.1，X76397.1，Y12426.1，X76395.1，AY159880.1，S75766.1，Y12428.1和Y12427.1。显着的分数（E.值阈值：2E-99）也与来自的OLE E 1样蛋白相对应Ligustrum vulgare.（X77788.1，X77787.1），Frakinus Excelsior.（AF526295.1、AY652744.1、AY377127.1），紫丁香丁香(X76539.1, X76540.1, X76541.1)和野橄榄-醋芥- (AY159881.1)。身份分析涉及这些变异的整个序列，除了一个简短的5'片段38-44核苷酸，包括ATG起始密码子，由于使用的扩增策略，在RT-PCR扩增片段中缺失了这个密码子。
将查询序列与数据库中搜索的序列进行BLAST成对比对，计算出不同的树视图(见图)。1作为一个例子)。结果表明，不同橄榄品种间的序列差异明显高于同一品种内的差异。一些品种(如Picual和Bella de España)之间的差异在某些情况下高于橄榄品种和来自成员的Ole e 1-like蛋白之间的差异木犀科家庭。
对应于较高分数树视图（E.值阈值：2E-99）所提交的奥莱的BLAST成对比对E的NR数据库中1组的序列。的Ole e9同一品种起源1个序列在树的同一分支经常分组。一些橄榄栽培品种（即皮夸尔和贝拉西班牙）之间的距离分别为在某些情况下比橄榄栽培品种之间的较大和OLE E 1-样蛋白从其他属的成员木犀科家庭（即Bella deEspaña和Fraxinus/Ligustrum）.
将获得的24条核苷酸序列用ClustalW软件进行多序列比对后进行详细序列分析。分析显示在几个位置存在微异质性，特别是在5'编码区域和3'非编码区域(见附加文件)1]．然而，在Bella de España对应的序列中发现了主要的变异，其中3'非编码区缺失了38个核苷酸片段。在许多情况下，报道的变化也影响了相应的氨基酸序列，如图所示2．
答:推导的Ole e 1氨基酸序列的多重比对显示在图1，附加文件中1和OLE的氨基酸序列ë1实验通过Edman降解法（20）测定的。保守的半胱氨酸在位置22，43，78，90和131由箭头（为半保守19C连续线箭头）指出。预测N-糖基化基序用框标记。免疫T细胞表位（A，B和C），通过实验[24]来确定由括号显示。IgE和IgG的B细胞的奥莱免疫显性区域E 1，由[25]通过分和酒吧中分别示出确定。编号遵循Edman降解获得的实验的Ole e9 1序列。B:根据[53]的JALVIEW程序计算的序列保护指数。作为数值指数（0至10）测量保护，反映了对准每栏的物理化学性质的守恒：身份得分最高，并且下一个最保守的基团含有含有相同物理化学类别的氨基酸的取代．
所获得的序列中检测到的核苷酸和氨基酸取代（包括保守取代）的数值分析以及显示相对高百分比的身份的序列2。Ole e 1序列之间的相同核苷酸百分比在86%至100%之间，而Ole e 1和其他来源的Ole e 1样序列之间的相同核苷酸百分比木犀科成员比例在86%至93%之间。
对预测序列进行分析时，Ole e 1序列中相同氨基酸的比例在82 ~ 100%之间(与其他序列相同氨基酸的比例为84 ~ 96%)木犀科在考虑了保守的变化后，对于Ole e 1序列，这些百分比提高到90–100%，对于Ole e 1和Ole e 1类序列，这些百分比提高到90–98%。
氨基酸替换分布在整个Ole e 1序列中，除了几个区域，这些区域在所有分析的序列中都非常保守，与起源的多样性无关(图)2）.这些保守区域包括在第22,43,78,90和131的位置22,43,78,90和131的6个Cys保守残基中的5个相对应的那些，以及在111位的推定的N-糖基化位点。
几种高度保守的序列还对应于OLe E 1过敏原的免疫肿瘤性T细胞表位，其特征在于[24.]以及与IgG和IgE结合有关的氨基酸残基[25.]．一些预测的序列与[20.]，在Edman降解后为OLE E 1获得。除了序列S75766之外，这些相同的序列是从品种Lucio，Menara和Picholine MaRocaine获得，除了先前在我们的实验室中获得的Pollen源之前获得的。
另一方面，使用不同的生物信息学工具和那些被描述为与过敏原反应相关的序列进行分析[24.，25.]允许我们鉴定与若干品种对应的序列中的关键氨基酸取代，这些序列在附加文件中列出3.．这些替换的包括:a) Cys残基在6个序列的19位被替换(3个来自Bella de España, 2个来自Arbequina，与野生橄榄-acebuche-对应)b)一个额外的n -糖基化位点在50位，在从Bella de España和c中获得的三个氨基酸序列中，通过ScanProsite软件预测，这些序列的点替换描述为Ole e 1过敏原的免疫显性t细胞表位，特征为[24.]以及与IgG和IgE结合有关的氨基酸残基[25.]．
讨论
多态性是过敏原分子的常见特征。许多不同来源的过敏原都有不同程度的多态性，包括室内尘螨[26.]，食品[27.，28.]来自不同草和树花花粉的过敏原[29.，30.]．然而，尽管过敏原多态性开始在分子水平上表征，但在许多情况下对这种多态性的起源少众所周知。在几种情况下，过敏原多态性已归因于多烯蛋白质家族的存在[31.]．在其他过敏原中，翻译后修饰的存在也可能决定多种形式过敏原的存在，如Ole e 1 [32.]．在苹果（Malus Domestica.)，多达18个Mal d 1基因已被鉴定。该过敏原的等位基因多样性被认为是苹果品种间存在显著差异的主要原因[28.]．在Ole e 1中检测到的高核苷酸替换率表明这些替换不太可能代表体外作为误差的结果，通过使用的PFU聚合酶掺入。本文证明，OLE E 1多态性与分析的花粉的品种（遗传）起源明显相关，因此代表进一步研究与该基因产物的生物学功能和过敏性的研究的基础。
这是我们之前报道的[17.发现不同橄榄品种花粉中Ole e 1的含量存在数量差异，并与花粉中Ole e 1转录本的含量呈正相关。结果还表明，这些花粉中也存在Ole e 1过敏原的质的差异。三个主要参数已被证明在较高或较低程度上影响Ole e 1对IgG和IgE抗体的反应性[21.]：三维（3D） - 折叠，聚糖组分和氨基酸序列的几个点变化。本文纸质报道，基于所得序列，这些特征的修饰可以与分析的花粉的遗传来源有关。
来自不同品种的OLE E1中的序列取代在整个序列中没有同等地分布。保守区域包括对应于位置22,43,78,90和131的保守半胱氨酸残基的那些。缺乏对OLe E 1或任何OLE 1样蛋白的3D模型的日期，其中包含与该蛋白质的显着身份的蛋白质PDB数据库不可能将氨基酸取代的推定涉及能够达到蛋白质的构象变化，这可能影响蛋白质的生物学功能或IgG / IgE结合能力。但是，我们可以推测潜在的变化。19C的取代可以显着改变OLE E 1蛋白的三级结构，因为先前建立了19℃-99C-90C之间的二硫键存在[33.]．这些作者提出的构象应该由OLE E 1家族的大多数蛋白质成员共享，其中6个半胱氨酸残基的相同分布是广泛的，无论它们的系统发育距离或关系。因此，可以预期对构象表位的抗体反应性的重要修饰，因为OLE E1对人IgE抗体的结合已被证明高度依赖于二硫桥的完整性[21.]．在一些Ole e 1形式中，19C-90C二硫键的假定缺失，也可能是对Kunitz蛋白家族和Ole e 1相关花粉蛋白之间的同源性提出的额外提示[34.，35.]，因为二硫键排列是蛋白酶抑制剂蛋白家族分类的典型特征[36.].自由-SH组的存在（对应于90C）在这些在19C残基中有取代的Ole e 1形式中，因此不能形成19C–90C分子内桥，也可以在整个分子间二硫桥的形成过程中促进蛋白质二聚体形式的形成。据描述，Ole e 1的SDS-PAGE模式经常表现出由于20 kD二聚体的存在，int带为40 kDa[20.]，这可能考虑到OLE E的5％。我们的观察结果表明，这些二聚体E形式的OLe E 1在Bella deEspaña和arbequina的提取物中比在其余的品种中均比较高。OLE E 1的单体和二聚体形式也与OLE E 1的单克隆抗体面板差异差异，来自橄榄色过敏患者的血清（未发表的结果）。
还建立了糖e e1在抗体结合中的甘草部分的作用[6，7，21.，37.]．这些作者得出结论，碳水化合物部分可能构成了在超敏患者IgE结合中具有相对意义的决定因素，不仅在Ole e 1过敏原中，而且在其他过敏原糖蛋白中。在这种情况下,修改,如假定存在一个额外的网站N-glycosylation品种在这里报道的西班牙花园贝拉可能代表一个重要修改Ole e 1蛋白过敏能力的花粉,这应该进一步测试。
文献中有几个例子可以证明，序列改变不需要太大，就可以显著改变过敏原的免疫特性(包括抗原性和过敏原性):Der p2的遗传变异对T细胞反应和IgE结合产生显著影响[38.]．关于花粉过敏原，重组BET V 1过敏原与其高度过敏的BETV 1A对应物相比，其表现出降低的IgE结合，从中仅在九个残留量中不同[39.，40.]．在相对的手，奥莱的重组作用ë1 / 3C的同种型1ë[21.[与角色E 1 / 5C，RSIR V 1和RLIG V 1表格相比，显示最高程度的IgE绑定程度（最新紫丁香丁香和Ligustrum vulgare.(分别)，相对于Edman降解所确定的Ole e 1的氨基酸序列，其取代量逐渐增加[18.- - - - - -20.]．从九十年代以来，已经获得了IgG和IgE结合的OLE E 1的氨基酸序列的某些位置的实验证据，并获得了过敏反应的引发[21.，24.，25.，41.]．作为这些研究，B细胞，T细胞表位和OLE的IgE和IgG的B细胞的免疫显性区的结果e 1已被确定。可以预见的是影响到这些地区所描述的替代将在蛋白质的变应原性/免疫原性假定变化的特殊贡献。
此外，在过敏原中诱导微小变化和研究变异是一种常见的低过敏原工程方法。根据本研究的结果，Ole e 1在某些橄榄品种中可以自然出现一些修饰的变应原，甚至是低变应原形式。在描述了Ole e 1的三个低变应原突变体的产生和进一步的免疫测试之后，最近出现了这种方法的一个重要证据[42.]．由OLE E 1特异性cDNA的点定向诱变产生的三个突变体中的两个并产生毕赤酵母属pastoris(135Δ10和140Δ5缺失突变体)能够强烈降低橄榄花粉过敏患者血清中ige的结合能力。此外，135Δ10突变体能够保持其完整的T细胞反应性并诱导阻断抗体。从本文分析的序列来看，Bella de España对应的三个序列在135Y位置上出现了点替换，而Bella de España对应的三个序列、Picual对应的一个序列和acebuche对应的一个序列在144N和145M位置上都出现了点替换。基于Ole e 1突变区域的这一巧合，Bella de España的过敏原亚型可以被认为是自然起源的潜在低过敏性亚型。我们实验室获得的实验数据表明，在Western blotting实验中，与来自其他橄榄品种的Ole e 1相比，来自Bella de España花粉显示的Ole e 1变异减少了对橄榄过敏患者的IgEs的结合(未发表的结果)。未来对表位反应性的分析应该包括蛋白质其他免疫相关区域的推测修饰，这些区域也应该包括Ole e 1的n端，其序列在本工作中尚未分析。
西班牙不同地理来源的患者对Ole e 1的反应性存在差异[3.，43.，44.]可以通过与在大气中存在的花粉的品种引起的变异起源的ole E 1多态性的存在解释，因为主要的橄榄品种精确和离散地分布在地理区域上[45.]．已经针对主要房屋粉尘过敏原描述了类似的发现，其中已发现Der P 2的主要变体在不同的区域中是不同的[26.]．
这里显示的序列分析表明，来自Bella de España等品种的Ole e 1序列与来自Bella de España的Ole e 1样蛋白具有更高的同源性木犀科与Edman降解后的OLE E 1的“规范”序列相比[20.或者在文献中描述或者存在于数据库中的其他OLE E 1序列。Important implications of such relationships, particularly regarding the presence of cross-reaction phenomena are expected: i.e. the exposure to pollen from such olive varieties (mainly anemophilous, and therefore highly represented like an aeroallergen in broad areas) may spread, or even trigger patient's reactivity to pollens from mainly entomophilous, and only locally represented plants species with low frequency of allergic sensitization likeLigustrum，Fraxinus，紫红色和其他木犀科[46.，47.]．
各种各样的形态，生物识别，生化和分子特征已被广泛用于描述和表征橄榄种质[48.]．分子标记包括RFLPs、rapd、aflp、微卫星序列和小卫星序列。Ole e 1序列的品种内多态性较低，而品种间的多态性较高，这可能是利用变应原序列作为分子标记进行油橄榄育种的结果。例如，Ole e 1序列可以作为一个额外的标记，以补充密切相关的橄榄品种之间的鉴别，而其他标记没有或很少产生差异模式。本研究以Ole e 1相似性为基础，揭示了两个亲缘关系非常密切的品种是如何被区别对待的。这就是品种Picholine marocaine和Menara的情况，后者被认为是前者的无性系选择，在摩洛哥生长的基础上生产更好，更早结实率，更容易扦插繁殖[49.]．越来越多的分子标记将有助于阐明关于橄榄培养的重要问题，这些问题仍未得到解答。关于它们之间的系统发育关系存在着相互矛盾的假设Olea Europaea土地奥利亚相关物种，介于野生和栽培物种之间Olea EuropaeaL.和对文化的起源[50].橄榄花粉中过敏原多态性对花粉产生和性能的其他生物学影响最近得到了解决[51]．
尽管在橄榄花粉变应原多态性与品种起源的关系方面还需要投入大量的努力，但所产生的知识的优势是显而易见的，并且许多应用是可以预见的。对天然变异体的研究将导致开发提高目前用于诊断和治疗目的的提取物的疗效和安全性的方法，以及许多实验室质量控制的常规试验。将考虑设计低过敏性变体的新策略，并可使用来自不同品种来源的天然花粉提取物，以进一步个性化患者的反应性，或类似于天然低过敏性提取物，作为重组过敏原的替代或补充。最后，低过敏性品种育种的进展也可能是由对这种变异性的遗传基础的更广泛的了解所指导的。橄榄花粉中变应原多态性的临床意义在[51]特别是品种差异如何影响提取物质，诊断和治疗疗效和安全性以及新疫苗的发育。
结论
橄榄花粉主要过敏原OLE E 1中存在的序列多态性高度依赖于分析的花粉的遗传来源。预测来自不同橄榄品种的1蛋白可能显示出不同的定性性质。这些差异对橄榄花粉生物学具有许多影响。他们还应考虑最佳设计过敏原配方，包括重组过敏原的设计，以改善其效率和安全性。
方法
植物材料
橄榄 （Olea EuropaeaL.）花粉在2002年5月和6月在2002 - 2005年5月和6月份的品种Lucio，Picual，Loime，Hojiblanca，Arbequina和Bella deEspaña（橄榄世界种质银行，Córdoba，西班牙）和Picholine Marocaine和Menara（Ain Taoujdat，梅克内斯，摩洛哥的橄榄藏品。通过剧烈摇动花粉，依次通过150和50μm网状尼龙过滤器沿着150和50μm的圆环过滤器筛分，以消除碎屑并保持在-80℃下的大型纸袋中收集花粉样品。
Ole e1转录本的扩增和克隆
如由[描述中使用RT-PCR程序17.]微小修改。简而言之，使用Rneasy植物总RNA试剂盒（Quiagen）从每个品种的成熟花粉中分离出总RNA。通过使用M-MULV逆转录酶（MBI FERMENS）和多DT血液适配器（5'-GACTCGAGTCGATCGA（T）进行cDNA合成17.3' ）作为引物，按照生产商的指示。PCR扩增从250ng的模板cDNA的进行，通过使用引物（5'-ACCTCCAGTTTCTCAATTTCAC-3' ）的5摩尔ρ正向和上述等量的聚-dT RACE适配器。将混合物在95℃下变性3分钟，并进行PCR扩增以Progene热循环仪（Techne公司）为94℃30个循环1分钟，57℃1分钟和72℃1分钟，用Pfu聚合酶（Stratagene）。通过凝胶电泳分析PCR产物后，将得到的条带（650 bp）的克隆到pGEM-T Easy载体（Promega）中，根据制造商的说明。从每个品种至少有三个克隆进行测序。
OLE E 1序列的生物信息分析
核苷酸序列通过核苷酸BLAST（blastn）程序进行分析[23.]．采用快速最小进化方法，最大序列差为0.75，生成BLAST成对比对和树视图。
利用ClustalW软件进行蛋白质序列比对[52]并使用JALView Viewer 2.2查看[53]．如[的计算）计算了保护指数54]．利用ExPASy蛋白质组学服务器上的ScanProsite在线设备搜索Ole e 1蛋白序列以寻找不同的基序[55]．
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致谢
作者谨感谢员工负责橄榄种质收集，以获得他们宝贵的合作，并康齐奇马蒂尼兹提供了卓越的技术援助。这项工作得到了研究项目JA AGL2003-00719和MEC BFU2004-00601 / BFI的支持。
作者信息
从属关系
相应的作者
附加信息
作者的贡献
JDA和Mirg设计了这项研究。AMHK和AJC设计了实验。AMHK，AJC和JCJL克隆并获得了序列。JDA和AMHK分析了序列。JDA，Mirg和Amhk准备了稿件。
电子补充材料
12870_2007_218_moesm1_esm.jpeg.
附加文件1：核苷酸序列比对。图中显示了Ole e 1核苷酸序列的多重比对1．启动和停止密码子（可用时）按框表示。注意与品种Bella deEspaña对应的序列中没有38bp片段。编号在ATG启动密码子开始。（JPEG 1 MB）
权利和权限
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引用这篇文章
Hamman-Khalifa，A.，Castro，A.J.，Jiménez-López，J.C。等等。橄榄色品种来源是OLE E 1花粉过敏原的多态性的主要原因。BMC植物杂志8，10(2008)。https://doi.org/10.1186/1471-2229-8-10
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关键词
- 花粉过敏原
- 橄榄品种
- Olea Europaea
- 重组过敏原
- 室内尘螨过敏原