基于cDNA芯片分析的向日葵低温和盐胁迫应答候选基因转录组学鉴定

背景

随着向日葵生产向干旱地区扩展，对干旱、低温、盐碱等非生物胁迫的耐受性成为制约向日葵生产的主要因素之一。差异器官特异性向日葵ESTs(表达序列标签)以前是通过减法杂交方法生成的，其中包括大量假定的非生物胁迫相关序列。本研究旨在利用荧光微阵列技术分析高氯化钠和低温处理下向日葵器官特异性ESTs基因的协同表达谱，以确定和跟踪对非生物胁迫早期响应的候选基因。

结果

通过使用器官特异性cDNA荧光微阵列方法对高盐度和低温下的非生物相关表达基因进行基因表达分析，研究了非生物相关表达基因的特征。试验包括3个独立的叶片重复。我们分析了先前从R1和R4发育阶段的叶、茎和花的不同器官特异性cDNA文库中分离到的317个单基因。通过方差分析和主成分分析，对80个盐度和/或低温胁迫的候选基因进行了统计分析。其中，50个基因在两种压力下都被上调或下调，支持共同的调节机制和对寒冷和盐度的一般反应。有趣的是，15和12个序列分别在一种胁迫下被上调或下调，而在另一种胁迫下没有。这些基因可能参与不同的调控机制，包括转录/翻译/蛋白质降解/蛋白质折叠/ROS产生或ROS清除。12.5%的微阵列候选序列通过qRT-PCR证实了差异基因表达模式。

结论

从向日葵器官特异性cDNA文库中分离出80个基因，作为向日葵低温和盐度早期响应的候选基因。低温处理和nacl处理的向日葵叶片的微阵列分析揭示了转录物丰度的动态变化，包括转录因子、防御/胁迫相关蛋白和稳态效应物，这些都突出了两种胁迫反应的复杂性。这项研究不仅鉴定了两种胁迫条件下常见的转录变化，而且还检测了向日葵中以前未报道的胁迫特异性基因。这是第一个器官特异性cDNA荧光芯片研究，旨在同时评估栽培向日葵在低温和盐度胁迫下的协同转录变化。

向日葵(向日葵L.)是全球第三大食用植物油来源，也被认为是生物柴油的有效来源(Sunflower Statistics NSA 2007, USA) [1]。考虑到向日葵的生产正在向地中海地区、北美、印度和阿根廷的干旱地区扩展，对干旱和盐度的耐受性成为育种计划的重要问题。2- - - - - -4]。此外，早期母猪对延长生长季节和逃避干旱胁迫的需求增加了对更好的耐寒性的需求，特别是在发育早期。响应这些压力的分子机制已经在模式物种中得到了广泛的研究拟南芥(5- - - - - -7]以及稻米等重要作物[8]。许多植物基因的表达受干旱、高盐和寒冷等非生物环境胁迫的调控[9- - - - - -12]。利用微阵列进行转录组分析已被证明是发现许多参与应激反应和耐受性的应激诱导基因的有力工具。非生物胁迫响应的宏观和微阵列研究拟南芥和栽培稻允许识别涉及功能蛋白和调节蛋白的基因[6，8，13- - - - - -23]。第一类包括膜转运蛋白和水通道蛋白，它们是渗透石生物合成的关键酶;解毒酶和大分子保护蛋白。第二类包括转录因子(TFs)(即bZIP、MYC、MYB、CREB/CBF、HD-ZIP)、参与信号转导和基因表达调控的蛋白激酶和蛋白酶。据报道，这些调控系统要么依赖于脱落酸(ABA)，要么独立于ABA，这表明在非生物应激信号的感知和基因表达之间存在复杂的调控机制[20.，21]。

据报道，干旱、寒冷和盐度之间的串音信号级联答:芥以及大量的胁迫诱导基因，包括渗透反应基因rd22BP1、AtMYBB2、DREB1A和DREB2A，以及激活效应物SOS3 (Ca^{2 +}结合蛋白)，SOS2 (Ca^{2 +}依赖性激酶)，SOS1 (Na⁺/小时⁺膜反转运蛋白)[8，22]。关于对低温的反应，许多物种中都报道了冷诱导基因，如紫花苜蓿[23]，拟南芥(24- - - - - -26]，大麦[27]和小麦[28，29]。这些基因中有许多编码功能未知的蛋白质，其中一些被描述为LEA蛋白(晚期胚胎发生丰富)[30.]。其他抗寒基因(COR)如LT1、KIN、RD和ERD主要是从植物中分离出来的拟南芥。这些基因在结合CBF和DREB (C-repeat结合因子/脱水反应元件结合蛋白)tf的启动子区域中呈现CRT/DRE (C-repeat结合因子/脱水反应元件结合蛋白)。而独联体冷响应基因中的元件结合DREB1/CBF tf，干旱响应基因的调控区域结合属于dreb2型蛋白的tf [5，31- - - - - -33]。

如前所述，对不同非生物胁迫组合的耐受性是向日葵和其他作物众所周知的育种目标。在不同的植物系统中记录了同时暴露于胁迫下的研究[8，13，34- - - - - -41]。然而，对于植物对不同胁迫组合的适应反应的比较分子机制知之甚少[42]。

基因表达数据库呈指数增长，结果信息被存储和分类。虽然强大的软件算法允许物种之间的结构序列相似性比较，但基于与确定为不同物种中特定性状的决定因素的同源基因的比较来预测分子功能出现了困难。物种间的真同源性鉴定是候选基因检测的有力工具，特别是在比较已完成全基因组测序的物种和基于EST测序项目的物种时。在…的情况下菊科种(包括向日葵)，仅有小的同生片段具拟南芥它们的进化涉及主要的染色体重排，这使得同源基因对难以识别[43]。即使在其他植物分类群中，对作物基因组的比较功能转录组学研究也相对较少[35]。微阵列分析答:芥目的:鉴定燕麦、杨树和大豆中同时保守和差异表达的基因大戟叶。(“多叶刺草”)最近被报导[44]。

向日葵通常对低温和盐度敏感[45，46]然而，关于非生物胁迫下基因表达的可用信息仍然局限于少数研究[35，45- - - - - -49]。最近有报道称，在暴露于长时间低温的植物中发现了大量下调基因[35]，表明向日葵不会适应寒冷的温度。同时，耐旱和不耐旱向日葵基因型的转录谱对水分胁迫的响应使得鉴定与氨基酸和碳水化合物代谢以及信号转导过程相关的差异基因表达[49]。在这项工作中，我们首次报道了一项基于向日葵器官特异性基因的荧光微阵列检测技术对低温和盐度早期反应中基因表达的协同研究。这项工作的目的是检测与这两种压力共同的调节和应激反应途径相关的候选基因，同时确定那些在每种应激条件下特异性表达的基因。

生物复制的数据分析和准确性

通过抑制减法杂交(SSH)获得的向日葵器官特异性序列的差异表达[j]50利用cDNA荧光微阵列杂交，然后进行Northern blot和qRT-PCR验证，评估了它们对低温和盐胁迫的响应。因此，对低温胁迫和盐度胁迫以及对照植物进行了3次生物重复评价。胁迫处理的设计考虑到向日葵通常对低温和盐度敏感[45，46]。关于耐冷性，只有一篇报道研究向日葵对低温的反应[35]。然而，在该研究中只评估了长期的适应性，这意味着检测到的基因表达变化主要反映了植物在次优条件下生长的代谢适应，而不是对寒冷的短期反应。栽培向日葵耐盐基因协同表达的研究尚未见报道。在目前的工作中，评估了对低温和盐度的早期反应，以检测在耐受过程开始时诱导的基因的早期转录变化。

通过应用于基因表达矩阵的主成分分析(PCA)进行第一步分析，以确定这些生物治疗的准确性和可重复性1)。结果表明，与对照组相比，生理盐水或低温胁迫下植物的生物样品在一般表达参数上表现出预期的变化。然而，该分析表明，其中一个生物对照重复(Ctrl 3)在对照组中表现出非典型的性能(图2)1)。主成分1、2所跨空间中生物复制的图形表示1,3和2,3如图所示1 a, b和1 c,分别。结果清楚地表明，Ctrl3与其他对照重复有显著差异，因此不做进一步分析。

候选基因选择

数据规范化-微阵列内的规范化

基因与处理之间的关系及其关联程度可以在表达矩阵的前两个主成分生成的双图中清晰地显示出来，其中行和列分别表示基因和处理(对照、低温和盐度)的重复(图1)2)。在该图中，基因显示为平面上的点，而处理复制则由扎根于原点(图的中心)的载体表示。这些载体描述了基因可以根据治疗反应排序的方向。在特定处理下，差异表达的基因沿着代表该处理的方向向量定义的轴有一个大的投影。同一处理下的重复处理具有相似的方向和较小的角度，这强调了处理的同一性(图2)2)。沿着“冷载体”显示的远离图中心的基因对应于在该处理中过度表达的基因，而沿着“盐度载体”显示的基因对应于在盐水培养基下过度表达的基因。另一方面，与前一个方向相反的基因是在这些条件下亚表达的基因。表示对照重复的向量比表示应力重复的向量短。这一发现支持了这样一个事实，即通过杂交实验使用一组对照植物作为参考，并且对每个基因进行对照处理的预期对数倍变化应该为零。

主轴1保留了总变异性的75.6%，根据基因在上(右)和下(左)表达条件下的折叠变化对基因进行分类，而不依赖于施加的胁迫条件。主轴2保留了17.2%的总变率，强调了冷处理和盐处理之间的差异。

虽然双图表示揭示了高质量微阵列数据的清晰画面，但它本身并不是一种推断技术。方差分析考虑了重复之间的可变性，以确定差异表达的显著性[35]。为了选择差异表达基因，采用了两步程序。首先对每个基因进行方差分析，只保留p值低于5%的基因进行补充分析。众所周知，使用原始p值作为选择标准会导致大量错误发现。这是一个值得关注的问题，因为几乎所有评估的est中有50%在5%的显著性水平上是显著的。在这一点上，我们决定使用排序技术提供的信息来过滤基因，减少错误发现的几率。这一程序背后的合理性是，基因离图中心越远，表达水平的折叠变化越大。在这种假设下，位于双图边缘的那些基因应该与应激反应最密切相关。计算前两个主成分所跨越的空间中到原点的距离是作为评分系统对差异表达基因进行排名的第一步。因此，在那些被p值标准保留的基因中，我们保留了那些离原点距离超过70百分位数的基因^th的距离原点分布(图2)3.)。考虑到EST T411 (EST T111的组成部分，AN: BU671801)已经通过Northern-blot和qRT-PCR实验验证为差异表达，并且其在距离原点分布中的位置对应于70^th百分位(图3.)。因此，选择80个差异表达基因作为低温和盐度早期反应的候选基因(见附加文件)1)。

芯片验证

为了实验验证微阵列分析衍生的差异表达基因，我们对候选基因T411进行了Northern blot分析和qRT-PCR [GenBank: BU671801]，不仅验证了该基因的差异表达，而且在p值标准保留的基因内设置了Bi-plot分析的截止显著性标准。该基因在寒冷和盐度胁迫下被上调(见附加文件)2和3.)，其在原点距离分布中的位置对应于70^th百分位数，如前所述。

采用qRT-PCR方法对10个候选基因进行了验证:EF127 [GenBank: BU671885]， EF264 [GenBank: BU671886]， EF502 [GenBank: BU671910]， F171 [GenBank: BU671987]， F379 [GenBank: BU671983]， F443 [GenBank: BU671999]， F455 [GenBank: BU672004]， H360 [GenBank: BU672086]， T124 [GenBank: BU671806]和T411 [GenBank: BU671801]，使用为每个候选基因设计的特定olignucleotide(表1)1)。对独立cDNA合成的每个反应进行3次生物重复，并以来自向日葵的肌动蛋白序列[GenBank: AAF82805]作为内对照，使基因表达水平正常化。定量分析基因表达的相对变化^——ΔΔCT由Livak和Schmittgen [51]。实时RT-PCR结果与微阵列分析结果的比较显示出相似的表达模式。cDNA芯片与qRT-PCR折叠变化之间的Pearson相关系数为r = 0.60 (p = 0.0054)2)(参见附加文件4)。在本研究中，微阵列检测到的候选基因中有10%以上被qRT-PCR验证。考虑到报道的cDNA微阵列研究中，总候选基因的平均验证率通常低于5% [35，49，52]这项工作中验证的基因数量高度代表了微阵列技术检测到的转录谱模式(占差异表达基因总数的12.5%)(表1)2)。在所有病例中，观察到的转录变化证实了微阵列分析的结果。

器官特异性cDNA文库中转录变化的差异

根据之前所述分离的不同器官特异性cDNA文库分析基因表达差异[50)(图4)。叶片文库衍生基因(包括与R4花蕾一起被捕获的叶片差异序列)在两种胁迫条件下大多下调，而大量来自R4花发育阶段和茎文库的基因(分别代表与叶片一起被捕获的花蕾和茎的差异序列)则表现出上调的转录模式。考虑到这里在叶片组织中评估了盐和低温胁迫下的转录变化，这些结果证实了SSH技术在生成差异器官特异性文库中的效率[50]。从叶片文库中分离出的ESTs对应于对照条件下高表达的基因，而从花文库和茎文库中分离出的ESTs则相反。因此，在本实验中，来自叶片文库的大多数基因在逆境条件下被下调，而来自茎和R4花蕾文库的基因在对照叶中表达水平较低，在这些实验中出现了上调。本研究评估的基因集主要由在对照叶中高表达的基因(来自叶文库)或在对照叶中低表达的基因(来自茎和花蕾文库)组成。在控制条件下，在不同植物器官中具有相似转录水平的基因在该阵列中所占比例较低。与非减法cDNA文库的微阵列分析相比，27.8%(80/287)的评估基因在一种或另一种胁迫条件下出现下调或上调，因此这些结果也解释了在这些试验中检测到的转录变化/转录不变比率较高的原因[21]。

冷处理和盐处理之间的差异

通过分析基因图谱，可以证明不同处理下植物的特定基因表达模式(见附加文件)2)。干旱、盐度和寒冷胁迫降低了水分利用率，降低了细胞水势。为了避免脱水，植物的反应包括溶质积累、细胞壁成分修饰和保护蛋白的合成，以避免或修复细胞损伤[53]。这些反应的激活需要一个复杂的信号网络，其中许多由各种非生物胁迫共享，如涉及DREB/CBF途径的信号网络[9，54]和其他典型的来自确定的非生物压力[7，55]。

虽然的热图广泛用于微阵列分析，作为可视化和检测差异表达基因的工具[56(参见附加文件3.)，另一种更可靠的工具是评估个体基因转录谱(见附加文件)2)。事实上，最近已经发表了一些关于这两种方法在分析微阵列结果方面的有用性的报告[57]。

微阵列技术的可用性使得可以比较在特定条件下被调控的大量基因，这对许多研究人员来说是一个强大的工具。然而，在解释结果时应谨慎行事。例如，盐胁迫处理导致光合作用在几分钟内迅速下降[37]。因此，受光合作用调控的基因可能受到影响，但它们不受盐胁迫的调控本身。在另一项研究中，150个基因对伤害和昆虫摄食的反应进行了表达[58]，发现一些在这些过程中诱导刺激不明确的响应基因也具有干旱诱导的特征[59]。因此，几个因素可能导致转录水平的复杂模式，其中控制基因表达的刺激的相互作用可以相互覆盖。胁迫强度和基因诱导的时间过程也是需要考虑的重要因素[59]。主要和次要胁迫在不同的时间框架内诱导基因。

在拟南芥对协同基因表达的研究揭示了大量的抗寒和抗冻基因[6，60- - - - - -62]，但关于低温适应的研究却很少[63]。向日葵植物在暴露于一段时间的低温后获得霜冻耐受性的能力仍然知之甚少。然而，最近的研究结果表明，向日葵在15°C和7°C两种低温条件下是不适应植物[35]。因此，在本研究中，向日葵对低温的反应主要集中在幼苗对10°C 24小时处理的初步反应上，目的是检测在这一早期阶段诱导的调节机制。在许多国家，向日葵的生产面积正在扩大到生长条件不理想的边缘地区，并且为了延长生长季节，对早播的要求越来越高，因此耐低温性成为一项重要的性状。关于向日葵的耐高盐性，目前还没有太多的资料，但将作物扩展到更干旱的地区与日益严重的土壤盐分问题有关。

根据基于BLAST算法和GO术语的序列相似性分析的最佳命中值，根据推测的功能对80个转录水平在盐和寒冷条件下发生变化的序列进行分类(见附加文件)1) [64]。聚类分析基因表达谱的热图表示(见附加文件)3.)允许检测由个体基因转录谱证实的不同处理(冷却、盐度和对照)之间的基因模式(见附加文件)2)。在80个候选基因中，有50个基因在两种非生物胁迫下都被上调或下调，从而支持共同的调控机制和对低温和盐度的一般反应。15个和12个序列分别在低温和盐度胁迫下上调或下调。最后，3个基因(F171、T107、E502)表现出倒置表达模式[GenBank: BU671987] [GenBank: BU671799] [GenBank: BU671910]， 39个差异est与未知预测功能的基因相对应[64]。在盐胁迫和低温胁迫下上调或下调的基因数量如图所示5按指定的分子和/或过程功能分组。转录模式在低温和盐度胁迫下的变化将根据其预测的功能类别进行讨论(见附加文件)1)，基于基因本体[65]。那些没有go术语关联的加入通过手工程序列入特定类别。

中央新陈代谢/光合作用

低温暴露与高辐照相结合会导致番茄、黄瓜和玉米等多种植物的光合作用受到快速抑制。已经确定了导致这种抑制的几个因素[66]。对光系统II还原性侧的损害有很好的记录[67，68对于中度敏感的物种，如玉米，它可能是整个植物在冷却后光合作用受损的主要原因。然而，在大多数对寒冷敏感的物种中，如番茄，基质双磷酸酶的还原激活受损似乎是在光照下冷却后限制碳同化的主要因素[69]。夜间的低温也会导致一氧化碳的严重减少₂固定在一天后冷却。在这项研究中，向日葵在这两种胁迫下，编码与能量代谢相关功能的产物的基因被下调。其中，光系统蛋白、叶绿素结合蛋白、Rubisco和光收获蛋白等可能编码参与光合作用成分的基因在本研究中表现出差异表达模式。考虑到向日葵是中等耐寒性植物[45]，有研究表明，能量代谢的减少是向日葵对低温反应的细胞过程之一[68]。本研究表明，这一过程不仅在低温胁迫下下调，而且在盐胁迫下也下调h . annuus。据报道，干旱胁迫下向日葵中果糖-1,6双磷酸酶的下调主要与水分亏缺时气孔关闭有关[j]。69]。然而，观察到NaCl降低了植株的光合活性菜豆不依赖于气孔关闭，并通过影响RuBP再生潜力来减少RuBP池的大小[70]。因此，光合作用对盐度的响应下降可归因于盐度对气孔和非气孔控制的影响[70]。然而，来自盐生野生稻的同样的酶，Portesia coarctata盐会降低其催化活性，并且可能具有内在的结构特性来承受这种下降[71]。

向日葵等逆境敏感植物的卡尔文循环主要受脱水和盐胁迫的影响。然而，冷应激对这一途径的影响尚不清楚。先前有报道称，在冷驯化过程中，在Suc合成途径和卡尔文循环途径中，Pi和磷酸化中间体的可用性都有所增加，并且两种途径中酶的能力都有所增加[72]。然而，这些长期变化的一个后果是细胞质中Pi的有效性和合成这种物质的能力可能会通过三磷酸糖转运体从叶绿体中抽出过多的碳。这反过来又会降低卡尔文循环再生RuBP的能力，抑制光合作用。然而，耐寒物种如答:芥冬季谷物在低温下经过数天至数周的冷驯化过程，能够恢复其光合能力并恢复生长[72- - - - - -74]，实际上几乎没有证据表明向日葵在冷应激后的几天里会做出反应。

关于低温、盐度和干旱等不同胁迫诱导的防御信号有许多报道[8，35，75- - - - - -77]。在这一类别中，我们报告了十个具有差异表达模式的基因(见附加文件)1)。其中一个在两种胁迫下都上调(EST T411，类似于一种塑性醛缩酶)[GenBank: BU671801]，第二个在低温胁迫下下调(EST T340，类似于一种绿塑性谷氨酰胺合成酶)[GenBank: BU671843]，而第三个在盐胁迫条件下下调。的塑性醛缩酶基因烟草植物可分为两个亚科:AldP1和AldP2。首次报道AldP2在盐胁迫下上调，而AldP1在盐胁迫下被抑制[78]。因此，本研究中发现的在两种胁迫下都上调的EST T411，假设与盐胁迫下观察到的AldP2型上调相似。另一方面，EST H136(类似于叶绿体干旱胁迫蛋白)[GenBank: 04002]的转录谱在低温和盐胁迫下下调。通常，是通向CO的途径₂在非生物胁迫下，固定和光收获受到抑制;尽管有证据表明谷氨酰胺合成酶的过度表达可以增强植物的耐盐性[79]。

信号和转录机制

调控蛋白如TFs (bZIP, MYC, MYB和DREB)以及蛋白激酶和蛋白酶参与非生物胁迫下的转录变化[5]。激活调控盐依赖性基因表达的转录机制需要诱导特异性tf和RNA聚合酶[80]。许多调节蛋白，主要鉴定于答:芥(76]，显示了环境压力下TFs的变化。在这一分析中，与之前的一份报告一致[35]，研究发现，一个编码与锌指家族蛋白相似的蛋白的EST在低温下被上调，尽管该转录因子(TF)与之前报道的转录因子没有显著的相似性。锌指蛋白与生理盐水应激有关拟南芥最近报道[81]，与先前确定为DREB1A的不同[32]。

许多候选基因已被鉴定为TFs或钙信号的感知受体在网上分析结果显示，在我们小组开发的器官特异性cDNA文库中，转录机制相关基因的相对丰度[50]。在本研究中，通过胁迫器官特异性cDNA文库分离的两个DNA结合蛋白(T187, T454) [GenBank: BU671817] [GenBank: BU671860]和锌指蛋白在低温处理下特异性表达上调。中发现的大量TFs拟南芥，表明植物次生代谢的复杂性[82]，可以解释这些蛋白质在非生物应激反应中的戏剧性含义，而不是植物与环境之间的关键相互作用，以及在dna中发现的复制水平拟南芥基因组(83]。答:芥参与应激反应的tf传统上分为aba依赖性和aba非依赖性调节途径。根据微阵列分析，该物种对非生物胁迫有几种独立的反应，其中之一涉及DREB/CBF调控[34]。DREB1基因受寒冷特异性诱导，而DREB2基因受脱水和高盐诱导，但不受寒冷的影响[7，32，84，85]。这种反应在水稻中也有报道[33]。

最近的研究报道了HD-ZIP tf在DREB转录级联方面的独立途径中对干旱的响应的重要性[86]。在拟南芥， digital northern分析的ESTs文库代表了13%的信号相关基因[87]。本研究中描述的adp -核糖基化因子的上调(EF127) [GenBank: BU671885]可以解释通过囊泡的细胞内运输的调节[88]。此外，在两种胁迫下，另一个基因(T234)被低调控[GenBank: BU671830]，与细胞外Ca高度相似^{2 +}检测到传感器。这种受体最近在答:芥(89]。作者证明了Ca^{2 +}细胞外水平调控Ca^{2 +}-依赖的细胞内信号通过特定的传感器。通过这种方式，这些受体将调节钙依赖性激酶，这些酶以前主要被描述为在低温驯化下高度表达的酶。这方面的知识已被报道紫花苜蓿低温暴露10分钟后的植株评估[90，7]。钙依赖性蛋白激酶在不同环境胁迫下的作用也被报道答:芥(91]和米饭[92]。

翻译机器

一般来说，参与这一细胞过程的基因在非生物胁迫下被上调，作为对关键酶活性的保护机制(见附加文件)1)。翻译机制的调控被认为是细胞应激反应的一个组成部分[77，93]。有研究表明，核糖体蛋白不仅对翻译效率至关重要，而且具有核糖体外功能[94]。在目前的分析中，这是证实了上调核糖体蛋白在两种压力下。此外，编码伸长因子的cdna被检测到是盐诱导的，正如之前报道的一些系统中的应激相关基因[8，95]。

蛋白质周转/折叠/蛋白质相互作用

在迄今为止报道的所有生物体中，应激期间的蛋白质降解是一种高度保守和受调节的现象[96]。在该分析中，EST F443 [GenBank: BU671999]与番茄中的铜伴侣蛋白相似，在两种胁迫下均下调，正如之前在水稻幼苗冷胁迫诱导的MALDI-TOF分析中报道的那样[97]。这种番茄的伴侣似乎在铜从腐烂器官向生殖结构的动员中起作用，有助于植物其他部位的生长。98]。此外，EST F231 [GenBank: BU671928]类似于亲环蛋白，在低温和盐度下也下调。检测到3种肽基脯氨酸异构酶(PPI)拟南芥NaCl处理的植物是一种类似于盐胁迫下下调的亲环蛋白[61]。

相比之下，与热休克蛋白相似的EST T124 [GenBank: BU671806]在两种胁迫下均上调表达。热休克蛋白(HSPs)，通常被称为应激蛋白，现在被认为在正常生长条件下和对热休克以外的应激反应中对一系列生理和细胞功能都很重要[99]。从20世纪80年代中期开始，分子伴侣的概念从生物化学家和细胞生物学家的工作中发展而来，一些热休克蛋白很快被认为具有这种伴侣功能。蛋白质组学分析表明，在低温胁迫下，杨树中有几个HSP表达上调，其中一个与另一个HSP表达强烈相似h . annuus在这项工作中发现[38]。

ROS-scavenging网络

冷胁迫、盐度和干旱，加上强光条件，导致光合机构产生ROS的增加，因为这些条件限制了CO的可用性₂对于暗反应，留下氧作为光合作用的主要还原产物之一[One hundred.]。干旱、盐和冷胁迫都会诱导活性氧如超氧化物、过氧化氢和羟基自由基的积累[75]。H₂O₂在过氧化物酶体中由乙醇酸氧化酶的酶活性产生[42]。在本研究中，与乙醇酸氧化酶(T120)同源的EST [GenBank: BU671805]在两种胁迫下均上调，可能参与了不同非生物胁迫下ROS的一般生成。这些ROS可能是诱导ROS清除剂和其他保护机制的信号，也可能是导致植物胁迫损伤的破坏性因子[101]。叶片和茎中编码过氧化物酶、硫氧还毒素、过氧化氢酶和氧进化增强子蛋白的cDNA文库中的许多ESTs在研究的胁迫下显示出转录变化。由于氧化应激过程中这些产物的积累，这些蛋白在两种应激条件下都被上调。然而，nadh -质体醌还原酶和催化水解酶下调。编码与细胞内稳态(呼吸、细胞生物发生和DNA修复)相关的蛋白质的基因在非生物胁迫下明显下降[37]。

运输

盐胁迫下离子稳态受钠通量、运输和区隔化的影响[j]。8]。在一项涉及杂交向日葵物种的差异基因表达研究中，已经描述了大量的运输相关基因，这些基因优先表达于向日葵酶类，一种局限于沙漠生境的旱生物种[102]。这些基因在沙漠土壤的极端环境中似乎很重要，它们既是渗透传感器，又是防止干燥的离子调节剂。103，104]。

在这项研究中，与ATP合酶相似的EST H360 [GenBank: BU672086]在两种胁迫下均上调，与推定的载体蛋白相似的EST F557 [GenBank: BU672042]也上调了。这些转录变化可能是离子转运体在耐盐和钾营养过程中大量活动的结果[105]。钾转运蛋白可能在钾的转运中起作用⁺，它是许多酶必不可少的辅助因子[75];或控制K⁺钠的吸收和调节^{2 +}吸收，这是耐盐性的重要决定因素[12，106]。此外，载体蛋白、水通道蛋白和糖转运蛋白被认为在应激条件下通过质膜和细胞膜调节渗透压[21]。另一方面，脂质转移蛋白(LTPs)是另一组与脂肪酸代谢相关的运输相关蛋白，可能在修复应力诱导的膜损伤或改变膜的脂质组成方面具有功能，可能调节对有毒离子的渗透性和膜的流动性[107，108]。许多ltp已被证明影响细胞壁的延展性或在NaCl胁迫下分泌[109]。近一半可检测到的LTP转录本拟南芥根微阵列在NaCl处理下下调[61]。此外，ltp与拟南芥在低温胁迫下，向日葵的LTPs也出现了下调[35]。在本研究中，我们发现了一种EST (EF502)与LTP蛋白[GenBank: BU671910]高度相似，在低温胁迫下上调，在盐水环境下下调。

次生代谢

EST H123 [GenBank: BU672069]，显示出与肌醇代谢异构酶MIPS的高度同一性[IUBMB酶命名法:EC 5.5.1.4]。]在低温和盐度方面被下调。肌醇是一种天然的细胞壁渗透保护剂，在非生物胁迫条件下，亚细胞合成成磷脂酰-肌醇是一个复杂过程的一部分，然后再循环进入磷脂酰-肌醇循环作为一个复杂的信号机制。由MIPS基因产物介导的耐盐转基因烟草也在p . coarctata(110]。相比之下，在芝麻中，盐胁迫在种子萌发过程中下调了SeMIPS1基因[111]。此外，在肌醇及其衍生物的生物合成过程中，发现MIPS基因的转录受到盐度的影响[112，113]，而有证据表明，耐盐植物的MIPS基因在盐胁迫下表达上调，而盐敏感植物的MIPS基因转录水平则降低答:芥(114]。本文报道的向日葵(盐敏感作物)EST H123 [GenBank: BU672069]的下调与芝麻中的MIPS基因产物非常相似[GO Term GO: 0004512]。50]。

这项工作提出了第一个cDNA向日葵荧光微阵列分析，通过联合统计方法，研究转录的早期响应寒冷和盐度的变化。选择候选基因的统计方法结合了经典的跨处理等均值假设检验(即ANOVA)和基于主成分分析的排序技术，是一种有效的方法，可以识别出在低温和/或盐胁迫下总共80个候选基因。即使这代表了来自评估的器官特异性序列的初始数量的差异表达基因的高百分比(28%)，这一比例也低于方差分析确定的约50%。通过上述组合选择标准减少差异表达基因的数量有助于防止错误发现。通过Real-Time定量PCR对12个est中10个不同表达模式的候选基因进行了验证。在80个候选基因中，发现50个基因在非生物胁迫下上调或下调，支持共同的调控机制和对低温和盐度的一般反应。另外，15个和12个基因在一个特定的胁迫下分别被上调或下调，而其余3个基因表现出截然不同的转录谱，在一个胁迫下被诱导，在另一个胁迫下被抑制。有趣的是，在这项研究中检测到的几乎一半的差异表达基因(39个)对应于未知预测功能的基因。这个结果表明，即使ESTs数据库为菊科植物植物包含大量的序列(509,904)，其中许多序列没有指定的假定功能。在与完全测序的基因组物种的序列比较中找到同源对的困难拟南芥哪一个与菊科植物在向日葵基因组部分测序的表达研究中，可以解释大量未知或未分类的est。

不同的研究小组报道了在微阵列分析中使用ESTs的许多努力，以帮助鉴定那些在非生物胁迫下表达水平发生变化的候选基因[21，35，37，61，62，115]。然而，许多EST集合并不完整，并且来自于非胁迫条件下生长的植物的cDNA文库，是防御/胁迫EST的代表。以向日葵为例，针对不同形式缺水胁迫的功能基因组研究[49，89]已经使用低规模主题微阵列进行了研究，尽管有大量的est可用于该物种。从这个意义上说，我们认为这项工作对油料作物在低温和盐度两种非生物胁迫下的转录组特征的了解做出了重要贡献。这是第一个研究向日葵对盐度响应的协同基因表达的工作，允许识别涉及共同调节机制的基因，从那些特别与寒冷或盐度相关的胁迫。进一步研究这些候选基因在不同低温和盐度处理、不同胁迫强度和不同胁迫延长期下的表达谱，将有助于了解它们在与胁迫反应相关的复杂调控机制的不同点上的作用。选择的候选基因最终可以通过表达研究来检测其在转基因植物中的过表达或抑制目标基因的分子功能。这些候选序列同时也为开发基于SNPS/ indels的功能性分子标记提供了有价值的工具，以辅助育种计划的选择。

植物材料

向日葵(黄花草选用阿根廷EEA INTA Balcarce向日葵育种项目提供的自交系HA89植株，在温室(光周期16 h，温度20-24℃)标准条件下，在1升(容积)含复合土的盆栽中生长。三个花盆，代表三种生物样本，每个花盆含有4棵幼苗，每种处理包括对照植物，每天用自来水浇水，每周用Hakaphos (COMPO)施肥^®) 18-18-18 (NPK)，终浓度为100 ppm (0.55 W/V)，持续2周。

冷却和盐度处理

对于高盐处理，用150 mM的盐溶液浇灌2周龄幼苗(2个完全展开的叶片)3天(改编自Liu和Baird) [48]。对照苗用自来水浇灌，在相同条件下生长。对于低温胁迫，向日葵幼苗在两叶期受到10°C的低温胁迫(改编自Huang等) (46]。所有植物均在生长室(Conviron)中生长^®)，由日光荧光灯管提供16个光周期(Philips，阿根廷)。每个生物重复分别收集对照和胁迫幼苗的叶片，立即在液氮中冷冻，并在-80°C下保存，直到提取RNA。以三盆为代表的三种生物样品，每盆由四棵幼苗组成，分别对每种胁迫处理进行处理和评估:冷却、盐度和对照。

扩增和制备用于微阵列构建的cdna

利用bioppipeline对来自不同器官特异性cDNA文库的向日葵EST克隆进行分组[50]。运行BLASTN和BLASTX例程[116]， 319个向日葵序列具有显著的相似性(E值< 1.0 E)^-10年或BLAST评分> 80)到已知或预测参与主要应激/防御反应、主要代谢途径、基因表达或信号转导的基因进行微阵列构建。使用基于blast的GO术语预测应用程序将功能类别分配给定义的单一基因集合，考虑所有三种GO类别在最具体的术语中，如先前的工作所述[50]。GO注释更新是通过AmiGO完成的[65]。

EST库扩增

不同器官特异性cDNA文库制备重组质粒[50]，之前用于3'测序再次用于PCR扩增。利用LacZ1和2正向和反向引物在96孔板上用Eppendorf热循环器进行扩增。

(LacZ1) 5′-3′序列:GCT TCC GGC TCG TAT GTT GTG TG 5′-3′

(LacZ2) 5'-3'序列:AAA GGG GGA TGT GCT GCA AGG CG。

制备4个PCR反应板，每个低温试管中各有一个含有克隆的EST. Long Expand Template PCR System kit (Roche Diagnostics, Inc.)，最终体积为50 μl，由最终浓度为1× PCR缓冲液3,dNTPs 0.2 mM, 0.25 mM Lac Z引物，Taq Pol mix 0.75 u组成。从该体积中提取48 μl到96孔PCR反应板(MJ Research)的每孔中。将2 μl未稀释的质粒模板DNA加入48 μl主混合物中。将平板在1500转/分的转速下短暂离心30秒，然后在94°C的变性条件下放入Eppendorf热循环器中1分钟，然后在94°C的温度下循环32次，持续30秒;在60°C到55°C和72°C的渐变过程中设定退火温度30秒，最终延长到72°C 5分钟。PCR扩增DNA的典型产量约为50-150 ng/μl。

净化

PCR产物装入96孔板(Millipore #MANU3050)，在15 psi下真空过滤约10分钟，直到孔完全空。纯化产物(QIAquick 96 PCR纯化试剂盒，Qiagen，德国)在无菌水中洗脱。在1%琼脂糖电泳凝胶上对每个样品的一个等分进行电泳评估，以确定扩增的质量和数量。Low DNA Mass Ladder (Invitrogen 10068013, Invitrogen，阿根廷)在相同的电泳凝胶中同时运行，使用Typhoon (GE Healthcare Life Sciences，阿根廷)数字化机器和软件进行荧光比较，获得可靠的PCR产物定量。

定位，微阵列构建和印后处理

将纯化的PCR cDNA产物各5 μl(共317个)转移到含有5 μl 100% DMSO的384孔板上，并由Gentron Genomic Services (Gentron, Buenos Aires, Argentina)使用VersArray Chip Writer (BioRad, USA)在涂布玻片(Ultragap II，康宁系统，美国)上标记。阵列设计由4个超网格组成，每个超网格包含6个子网格，每个子网格64个位点(8 × 8)，每个子网格打印4份cDNA。三个与家鼠相对应的克隆体(亩骶)作为阴性对照[GenBank: NM009060, NM008690, NM019476]，而向日葵(h . annuus) [GenBank: AAF82805]作为阳性对照，在所有芯片载玻片中进行表达分析。使用UV Stratalinker 2400 (Stratagene, USA)在250 mJ的紫外线照射下将打印的阵列与载玻片交联。载玻片在使用前保存在干燥室中。所有的载玻片都用一个混合的对照RNA作为参考杂交。

微阵列衍生数据平台进入The Gene Expression Omnibus数据库[117，118]，从中分配平台加入号[GEO: GPL 4366]。因此，可以获得打印在阵列上的完整序列标识符表和器官特异性unique - igenes accession number [50]。

RNA，提取，纯化，扩增和标记

用TRIzol从约2g的叶组织中提取总RNA^®试剂遵循制造商建议(Invitrogen，阿根廷)。通过检测其在1.5%琼脂糖凝胶在ME缓冲液(400 mM MOPS, 100 mM Na acetate, 10 mM EDTA pH 8.0，在焦碳酸二乙酯处理过的水中)上的电泳迁移率来分析RNA的完整性。按照制造商的说明，使用RNeasy Mini色谱柱(Qiagen, Germany)进一步纯化RNA。为了控制个体之间的生物差异，在探针制备之前，将来自同一组织的三个生物样本汇集在一个样本上。参考(对照)样品为从温室环境不变的向日葵幼苗中提取的RNA，而冷却和盐度样品为从温室环境胁迫下的向日葵幼苗中提取的RNA。

使用SuperScript间接RNA扩增系统试剂盒(Invitrogen，阿根廷)根据先前报道的方法对RNA (800 ng)样品进行标记[119]。RNA扩增后(加入UTP氨基烯丙基)，用Cy3或Cy5酯在碱性培养基中孵育得到标记产物。

微阵列杂交反应

利用芯片载玻片，利用Cy3和Cy5杂交技术定量检测est在对照和处理叶片中的相对表达量。染料互换用于校正两种染料的掺入和荧光特性的差异，每个实验产生9张幻灯片(3张作为对照，3张用于每次处理)，考虑染料互换杂交，总共有18张幻灯片。微阵列载玻片在5× SSC、0.1% SDS、1% BSA中42℃孵育预杂交。第二天取下盖片，用1× SSC, 0.2% SDS(预热至42℃)洗涤1次;1次，0.2× SSC，室温下0.2% SDS;在0.1× SSC室温下1次。清洗时以100转/分钟的速度轻轻摇晃5分钟。载玻片在500 rpm下低速离心2分钟干燥。

切片扫描和信号定量

杂交载玻片使用VersArray芯片阅读器(BioRad, USA)扫描仪(两种不同的染料使用两个不同的通道)在三种不同的检测器灵敏度下进行扫描。使用免费开源软件Spotfinder进行图像分析和信号量化[120]，量化每个点的信号强度。然后，实现多个扫描过程的数据集成。

数据规范化-微阵列内的规范化

在计算比率之前进行背景减法。带有打印或杂交工件的元素在分析之前被标记并丢弃。只有两个通道中强度至少高于当地背景1.5倍的点才用于后续分析。然后对每张幻灯片的输出数据进行对数变换(使用log base 2)，并使用3-D归一化(取决于光斑强度及其在阵列中的位置)(Alvarez等.，未发表的数据)使用“R统计语言”[121]。潜在的伪影和假阳性被消除，只选择那些在原始杂交和相应染料互换之间表现出相似表达模式的克隆进行进一步分析[122]。生成基因表达矩阵，重点分析差异表达基因。

微阵列间的标准化

在生物重复中使用的方法假设大多数基因在处理过程中不会改变其表达水平。在这种情况下，分位数均衡或其他归一化工具不会实质性地改变检测不同表达水平模式的变化。然而，根据探索性数据分析，确定了器官特异性ESTs的重要部分在处理之间确实表现出一定的表达水平差异。因此，在增加假阳性或阴性识别发现率的风险下，没有应用额外的规范化。为了根据实验误差对基因谱进行排序，基因表达矩阵在一个基因的基础上进行缩放，除以共同的处理内标准偏差，从而产生基因表达矩阵(如本工作所述)。

基因表达矩阵分析

与基因表达矩阵相关的全部分析使用Infostat 2006软件进行^®(123]。候选基因鉴定采用两步程序。首先对每个基因进行方差分析，只有那些p值低于5%的基因被保留用于补充分析。对完全随机设计下的固定效应模型进行方差分析。在第二步中，基因在基因表达矩阵的前两个主要成分所跨越的空间中的位置被用来过滤基因并减少阳性错误发现的比率。这一程序背后的合理性是，基因离空间原点越远，表达水平的折叠变化越大。在这种假设下，那些位于双图边缘的基因应该与应激反应密切相关。截止标准设置为EST T411 (EST T111的组成部分，AN: BU671801)到原点的距离。采用该EST作为切割点的主要依据是其已被Northern-blot和qRT-PCR实验验证为差异表达。EST T411在离原点距离分布中的位置对应于第70百分位。

不同治疗条件下基因表达的图示以热图形式呈现(见附加文件)2)。采用带欧氏距离的平均链接法，利用聚类关系生成聚类关系的热图函数在“R统计语言”[，#241]。

Northern

对于northern blot分析，从叶片中提取的总RNA (20 ug)在1.5%琼脂糖- mops 1x凝胶上分离，并印迹到尼龙膜上(Hybond-N+， GE Healthcare Life Sciences, Amersham，阿根廷)。在所有情况下，膜通过紫外线照射交联。将EST候选基因克隆对应的纯化PCR产物随机引物制备北杂交探针^(32页)-dCTP (NEN Perkin Elmer，美国)。杂交在42℃，50%甲酰胺(Ambion ULTRAhyb)存在下进行^®根据供应商的说明，在42°C下进行超敏杂交缓冲液(Ambion，美国)和洗涤。暴露于BIOMAX MR Kodak x射线胶片(Kodak, SIGMA Argentina)，在Typhoon设备中使用TN-image程序进行扫描和分析，计算相对于向日葵rRNA和肌动蛋白序列标准化的相对信号强度[GenBank: AAF82805]信号。

实时rt - pcr

为了证实微阵列实验的结果，我们检测了10个差异表达ESTs的转录物丰度。利用引物3设计基因特异性引物[124]。寡核苷酸引物序列如表所示1。根据制造商说明书(Invitrogen，阿根廷)，从500 ng DNase处理过的RNA中逆转录第一链cDNA。反应在含有15 ul quantiect™SYBR的30 ul体积中进行^®绿色PCR (Qiagen, Germany)，每个引物300 nm, RT产物cDNA 1 μl。PCR反应在ABI PRISM 7000 HT序列检测系统(Applied Biosystems, USA)中使用以下程序运行:50°C 2分钟，95°C 10分钟和40个循环，95°C 15秒，60°C 1分钟。PCR扩增后，反应经过温度斜坡以产生解离曲线，测量荧光读数随温度的变化，允许检测非特异性产物。解离程序为95°C 15秒，60°C 15秒，然后从60°C缓慢上升到95°C 20分钟。每个反应进行3次重复，以向日葵的肌动蛋白序列[GenBank: AAF82805]为内对照，使基因表达水平正常化。使用未转录RNA的阴性对照反应也用于确认基因组DNA的缺失。定量基因表达的相对变化^——ΔΔCT方法(51]。qRT-PCR与微阵列折叠变化的比较结果见表2。

本研究得到了ANPCyT/FONCYT的支持;BID 1728 AC/AR PID 267和PAV 137和INTA-PE 243.540。P. Fernandez博士是INTA的博士后研究员，Luis Fernandez博士是INTA的技术职位，硕士学位。Julio Di Rienzo是科尔多瓦国立大学统计学和生物计量学教授，R. Heinz博士和N. Paniego博士是阿根廷国家调查委员会Científicas y tacimnicas (CONICET，阿根廷)的职业成员，H.E. Hopp博士是Comisión de investigacaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC)的职业成员和布宜诺斯艾利斯大学(UBA)精确自然科学学院的教授。

从属关系

1. 阿根廷布宜诺斯艾利斯省卡斯特拉市(B1712WAA)， CICVyA研究所Biotecnología, Las Cabañas y Los Reseros

   Paula Fernandez, Luis Fernandez, H Esteban Hopp, Norma Paniego和Ruth A Heinz

2. Cátedra de Estadística y Biometría，阿根廷国立大学农业科学学院Córdoba, Córdoba

   胡里奥·迪·里恩佐

3. 布宜诺斯艾利斯大学自然科学学院，布宜诺斯艾利斯，阿根廷

   埃斯特班·霍普和露丝·海因茨

相应的作者

对应到露丝A海因茨。

作者的贡献

PF进行了减文库、DNA测序、cDNA斑点DNA扩增、杂交探针等工作，并参与数据分析和稿件制备;JDR指导数据芯片和统计分析，LF参与定量实时反应，HEH协调工作组，NP指导生物信息学和分析程序，RH设计实验，协调整个分析并起草稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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