转录分析抗旱性根受到外生菌根真菌的挑战Laccaria二色的

背景

真菌与林木的外生菌根共生关系在北方林木的营养、生长和健康以及营养循环中发挥着重要的经济作用。外生菌根的生态学和生理学研究松果体sp都有大量的文献记载，但与被子植物相比，关于这些与裸子植物相互作用背后的分子机制却知之甚少。

结果

利用微阵列方法，研究了2109个EST转录本在互作过程中的相对丰度抗旱性对具有外生菌根真菌的根进行了分析。结果显示，在新出现的侧根上地幔形成的早期阶段，共有236个ESTs表达差异显著，96个转录本在与真菌物理接触1天后差异丰富，5天后134个转录本，15天后仅6个。在菌根发育与Hartig网形成相一致的后期，通过定量反转录PCR进一步评估了细胞壁修饰和胁迫相关基因的子集。结果显示，参与一般防御机制(如抗菌肽)的基因转录本下调，以及参与细胞壁修饰的基因转录本下调(如富含甘氨酸的蛋白、木葡聚糖内do转糖基酶)。

结论

本研究首次尝试表征植物伴侣的转录组抗旱性- - - - - -Laccaria二色的模型系统。我们鉴定了236个est，它们对针叶树宿主共生功能的分子调控可能具有重要意义。研究结果与其他基于被子植物模型系统的研究结果相似，但在裸子植物外生菌根发育过程中基因调控的时间和空间尺度上存在一定的差异。目前的研究已经确定了一些潜在的重要分子事件，负责启动和调节全功能共生过程中的生化、生理和形态变化，这些变化与裸子植物宿主有关。

外生菌根(ECM)共生是北方针叶林树木生命和健康的一个重要特征，它在营养循环和森林生态系统的功能中发挥着重要作用。外生菌根根尖发育良好的树木，更能抵抗干旱等环境压力，以及根部病原体等生物压力[1，2］．外生菌根共生的建立是由双方产生的信号触发的[3.- - - - - -6］．这些信号导致植物和真菌的形态变化和特定结构的复杂发展。外生菌根联合的特征是三个结构组成部分的连续发展:包裹根的真菌组织的套或鞘，根内菌丝网络，称为哈蒂格网，和根外菌丝，延伸到根周围的土壤，负责水分和养分的吸收。Hartig网是真菌和根细胞之间代谢物交换的场所[1功能性ECM共生的个体发生需要植物和真菌的遗传程序之间在时间和空间上精细调节的串扰，这些程序涉及感知环境和细胞间的通信。

菌根前期对植物根系在形成地幔的适应、侵入性菌丝在表皮细胞间的穿透以及随后的Hartig网细胞间生长的分子机制仍不清楚。一些分子方法和大规模的基因图谱实验已经导致在植物模型系统中发现越来越多的共生相关(SR)基因桦木属翻车机，蓝桉，Quercus栎树而且椴树属platyphyllos［7- - - - - -12］．这些研究表明，在外生菌根发育过程中观察到的形态和生理变化与伴侣双方的基因表达变化同时发生，并在物理相互作用开始时发生[9，12］．基因的数量和它们表达的幅度随时间而变化，但在发育的早期阶段，即接触后不久，似乎更为重要。在感染前阶段，植物细胞中的细胞内信号由g蛋白触发，g蛋白负责阴离子和阳离子的外排，导致膜去极化、细胞外碱化、未知靶蛋白的磷酸化或去磷酸化，最后释放活性氧(ROS) [13，14］．过氧化氢(H₂O₂)在建立外生菌根共生关系中起着至关重要的作用[15- - - - - -17］．钙峰值已被证实是一种重要的细胞内信号，参与植物共生基因编程的启动[18，19和不同的钙结合蛋白，如钙调蛋白和钙网蛋白桉树而且桦木属sp。在此阶段[9，12］．深刻的细胞骨架重排和强烈的液泡活性也被描述。细胞壁和细胞外基质是最先发生剧烈变化的细胞结构。

几项研究表明，几丁质酶和蛋白酶等酶的编码基因的转录[9，12，20.或向细胞外空间释放过氧化物酶[21- - - - - -23]在菌根早期阶段。据推测，这些酶的功能是修饰植物和真菌的细胞壁结构，但也释放或创造二级信号分子，这是其活性的副产品。细胞壁与受体固定的质膜相连。在这一阶段，大量与应激信号、防御和细胞拯救相关的基因被发现在不同的系统中被诱导，尤其是发病相关(PR)蛋白。在这种防御反应中表达的一个典型基因具有同源性打赌V1过敏的蛋白质(9，12］．它们的表达被快速调节，可能是由真菌伴侣。克服这些一般的防御反应是下两个外生菌根发育阶段的先决条件，在这两个阶段中，菌丝体在地幔形成过程中包裹根部。在地幔形成后，菌丝穿透表皮细胞和皮层细胞之间，增加了共生体之间接触的表面积，并使共生伙伴之间的代谢物交换成为可能[19］．这一过程在相互作用的早期阶段引发了一种防御反应，与胁迫相关的基因上调，可能是为了限制真菌对根组织的入侵[24］．

这些研究中有许多是专门用被子植物宿主植物进行的，而很少有使用裸子植物宿主，特别是针叶树。被子植物和裸子植物被认为在1.3 - 9000万年前就分离了[25］．一些被子植物代表树(如杨树)能够同时形成丛枝和外生菌根的共生，而针叶树则完全是外生菌根的。

植物外生菌根共生的生态学与生理学松果体spp都有很好的记录，但关于这种共生关系是如何在分子水平上被调节的基本知识仍然缺乏。只有一篇论文，主要关注的是真菌伴侣Laccaria二色的他记录了以裸子植物为宿主建立ECM过程中分子事件的大规模分析[26］．

在这篇论文中，我们提出了一个微阵列的研究，重点在植物伙伴在抗旱性- - - - - -Laccaria二色的系统。主要目的是探讨针叶树根系识别和响应机制的分子基础(抗旱性-苏格兰松)与共生真菌的挑战Laccaria二色的。在接种后1、5和15天三个时间点对2000多个表达序列标签(est)的表达进行分析，发现了几个共生相关基因。当完全菌根定殖完成后，用定量反转录PCR (qRT-PCR)进一步研究了所选基因子集的调控。将结果与其他已发表的被子植物模型系统的研究结果进行了比较。

显微镜

活性黏附的均质化l二色的接种后数小时内，苏格兰松根系可见菌丝。在接种24小时后粘附菌丝(图。1)没有显示出任何生长，但在第5和15天，菌丝活跃生长(图。1 c)表明从均质化中恢复。尽管菌丝生长活跃，菌丝与松树根的物理接触增加，但在5或15 d.p.i的水平上，对照和菌根根之间的活细胞数量没有显著差异。这表明，外生菌根真菌的存在没有影响正常的生理和活跃的分生组织细胞分裂。在15d.p.i.时，观察到几个侧根的出现，伴随着外生菌根真菌的广泛定植(图。2 a - b)．

微阵列数据分析

使用2-混合模型对微阵列数据进行统计分析，得出236个EST转录本被认为差异丰富，在1,5和15天内至少发生1.4或-1.4倍变化(见附加文件)1)．共有52、109和5个est在每小时1、5和15天的转录水平增加，而44、25和1个est在同一时间点的转录水平下降。在折叠变化增加的转录本(>1.4)中，2个(nxsi_036_h01 -蛋白信号转换器和nxci_005_g03 -紫色酸性磷酸酶)在1和5天内常见，而在转录本水平下降(-1.4)的1和5天内常见3个(37E10-gibberillin调节蛋白)。其中三种无害环境技术没有已知的功能。

外生菌根发育早期基因调控的一般模式

根据分层聚类分析，对差异表达的236个基因进行分组。3.)．在这些簇中，确定了8种不同的表达模式。集群1包含的基因在相互作用的初始阶段被下调，但在其他时间点(5天和15天)没有显示出显著的差异表达。在该簇中确定的基因包括编码分泌过氧化物酶和与抗病性相关的基因(CC-NBS-LRR, TIR-NBS-LRR)。第二簇包含在1 d.p.i.时显著诱导的基因，但在5天和15天后没有差异表达(例如H+运输atp酶，preg样蛋白，漆酶)。此外，该簇中还存在几个编码细胞拯救和防御反应的ESTs，以及一个MLO蛋白同源体，在植物与病原真菌接触时的识别中发挥重要作用。

簇4包含最多的est，代表基因在阵列上上调到5d.p.i，但在1或15 d.p.i没有差异表达。大多数参与蛋白质命运和加工的ESTs在这里都有很好的表现(例如泛素连接酶、GST、伴侣蛋白、COP9信号复合体亚基)。簇5包含在第1天和第5天上调但在第15天没有上调的基因(如紫色酸性磷酸酶，蛋白质结合/信号转换器)。在第6簇中发现的基因与基因库中任何已知的蛋白质都没有同源性。该簇基因均在15d.p.i.诱导，在其他时间点无差异表达。另一方面，簇7包含在1和5 d.pi处被抑制的est。15 d无差异表达(如赤霉素调节蛋白、NBS/LRR蛋白)。簇3和簇8是单个ESTs，分别是在1和15 d.p.i诱导的富含甘氨酸的蛋白同源物，以及在15 d.p.i抑制的发病相关蛋白PR10。

差异表达基因的功能分类

对236个差异表达基因进行功能分类;21%的ESTs编码与植物代谢有关的蛋白质，11%编码与细胞拯救和防御有关的蛋白质，7%与蛋白质命运(折叠、修饰和破坏)有关，7%与能量有关，5%与细胞通信和信号转导有关，4%与细胞运输和运输机制有关(见附加文件)1而且2)．很大一部分ESTs(21%)被发现与数据库中任何已知基因的同源性非常弱或没有同源性。

1的结论

绝大多数差异表达的ESTs在接种后1 ~ 5天内被记录。大约13%的ESTs编码参与细胞拯救和防御的蛋白质。在该组中鉴定出编码MLO蛋白同源物和漆酶的基因。MLO蛋白在植物识别和对真菌入侵的反应中所起的作用早前已经被强调过。在真菌存在的情况下，包括TIR/p loop/LRR在内的几个抗病蛋白同源转录本上调了1个d.p.i.。一个编码过氧化物酶的EST (EC 1.11.1.7)被下调。

对于与细胞通讯和信号转导相关的ESTs, CC-NBS-LRR抗性样蛋白转录本与丝氨酸苏氨酸蛋白激酶转录本一起被发现减少。一个钙网蛋白、一个NBS-LRR抗病蛋白转录本、一个14-3-3蛋白转录本和几个具有结合结构域或信号转导功能的蛋白转录本在这个时间点被发现上调。编码RAN结合蛋白家族成员(分子核易位所必需的)的转录本被下调。在苏格兰松与ECM真菌相互作用的这一阶段，还发现了4个与转录过程相关的ESTs。一个磷酸酶调控基因(编码PREG样蛋白)参与调控对营养获取很重要的酶，其转录本显著上调。

大多数est转录本属于功能类细胞运输和运输机制，被发现下调。其中包括磷酸盐转运蛋白和膜内蛋白(孔蛋白MIP)。在这一组中还发现了另外两个与液泡功能和质子转移或运输相关基因同源的ESTs。与此相反，与其他作者的发现相比，水通道蛋白的转录本显著增加[8］．差异丰度为1d.p.i.的转录本中有很大一部分属于植物代谢功能类别(18%)，特别是氨基酸生物合成。这类转录本包括精氨酸脱羧酶和腺苷甲硫氨酸脱羧酶(E.C. 4.1.1.50)以及腺苷甲硫氨酸脱羧酶，它们的丰度均显著下调。有趣的是，一种无机磷酸酶也被发现下调了。属于与环境相互作用调节官能团的四个est转录本与植物激素生长素相关基因同源，均在此阶段被抑制。此外，很大一部分est转录本(16%)与GenBank中的任何蛋白质都没有命中或同源性。

5的结论

在5d.p.i.中含有最多ESTs的功能类别是新陈代谢。一些转录本编码的蛋白质与参与细胞壁修饰的酶同源(例如木糖葡聚糖内do转糖基化酶和β -木糖苷酶)。这两个转录本都增加了，和clavata1受体激酶一起，都是在侧根形成的细胞壁重塑过程中促进植物发育的重要成分。同时发现-蒎烯合成酶转录本下调。这种酶与-蒎烯的产生有关，-蒎烯是一种已知的抗真菌化合物。

在此时间点鉴定的ESTs转录本中，约有13%属于细胞拯救和防御功能类(如Avr9激发子反应蛋白类、TIR/NBS/LRR抗病蛋白、金属硫蛋白类蛋白、thaumatine类蛋白PR5)。下一个主要的功能类别涉及细胞通信和信号转导机制(10%)。在这个相互作用的阶段，一些参与信号感知和转导的基因被强调了出来。发现蛋白激酶受体、TIR/P Loop/LRR同源物和蛋白结合/信号转换器(上调1和5 d.p.i)一起上调。几个与蛋白质命运相关的est以5d.p.i.的差异表达，在这个时间点代表了10%的est。铜伴侣分子、多泛素和泛素前体是在这一功能类别中发现的无害环境技术的例子。

15的结论

在这个时间点上，微阵列筛选确定了6个ESTs转录本的差异丰度。在这些ESTs中，发现一个富含甘氨酸的同源蛋白转录本上调。更有趣的是，另一个与发病相关蛋白PR10同源的基因在接种后15天被发现下调。其他无害环境技术没有已知的功能。

中存在的验证

采用qRT-PCR分析14个特定时间点的选定基因，对微阵列数据进行独立验证。对qRT-PCR和cDNA微阵列数据的分析结果表明，两种不同方法在估计所有三个时间点的表达水平的倍数差异方面的趋势和模式完全一致。不出所料，qRT-PCR检测到的转录本折叠值均高于微阵列检测到的转录本折叠值，基本上证实了微阵列数据(表5)1)．

外生菌根发育后期基因表达的qRT-PCR分析

为了进一步分析外生菌根发育过程中阵列中选定的基因的表达水平，在外生菌根发育的后期阶段(30 d.p.i)，从水培系统中的新生物材料中收获根组织。这些结果列于表中2。在这项分析中，qRT-PCR对选定的20个基因进行了分析，而不是大规模的分析。两个基因在1天后被发现下调，但在5和15 dp.i没有差异表达，在30 dp.i上调(假定生长素诱导和MtN21结节样)。已知这些基因参与植物微生物的相互作用，并被认为是由植物激素生长素调节。生长素也可由外生菌根真菌产生，并在外生菌根的发育中发挥重要作用[27］．

膜内蛋白编码转录本在1 d.p.i下调，也在30 d.p.i下调。参与类黄酮生物合成的花青素合成酶转录本在阵列上1 d.p.i.时被显著诱导，但在第5天和第15天没有差异表达。与此相反，编码查尔酮黄酮异构酶(另一种参与类黄酮生成的酶)的转录本在头15天内的丰度没有差异，但在30 d.p.i时有所下降。与Clavata 1、内切葡聚糖酶1或枯草菌素样前体同源的转录本在1到30 d.p.i之间有短暂的丰度。上调5 d.pi。谷胱甘肽- s -转移酶转录本在5和30 d.p.i上调，而在1和15 d.p.i没有上调，编码PR10蛋白的基因仅在15 d.p.i上调，但在随后的菌根形成活跃期下调。类似地，与细胞壁形成有关的转录本，如编码富含甘氨酸的蛋白质的转录本，在15dp.i时增加，在30dp.i时减少。

研究了应激反应相关基因和编码过氧化物酶、酪蛋白、肉桂醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶a硫醇酶的转录水平。选择这些基因是因为它们在松树幼苗抵御真菌入侵的防御反应中具有潜在作用。在与ECM菌互作1、5和15天后，这些基因均无显著差异表达，但qRT-PCR在30d.p.i.处有差异表达。另一方面，与肉桂酰辅酶a还原酶、查尔酮黄酮异构酶、s -腺苷甲硫氨酸合成酶和抗菌肽同源的其他一些防御相关基因在菌根化活跃期或Hartig网形成期被抑制在30 d.p.i.。

如前文所述，调控ECM形成的遗传程序目前主要是在被子植物中研究。从经济和生态的角度来看，裸子植物也是针叶林生态系统中的主要树种，理解有利于裸子植物生长的共生联系的分子基础是一个重要的研究重点。在本研究中，使用在体外系统中，我们对菌根发育的不同阶段进行了转录谱分析p的抗旱性与l二色的包括与主根和侧根的菌丝联系。

在转录谱分析中，使用2109个ESTs组成的异源阵列来监测接种后不同时间点的基因表达。虽然本研究中使用的阵列包含来自p . taeda在美国，我们将这些阵列与从其近亲中获得的RNA进行杂交p的抗旱性的根源。两者之间的高度杂交p . taeda数组和p的抗旱性早前范·齐尔(van Zyl [28］．研究的数量p . taeda微阵列证明了这些阵列是一种常用的和公认的工具，用于评估松科几个物种的差异基因表达[29，30.］．

在本研究中，发现236个转录本在外生菌根发育的早期阶段差异丰富。差异丰度转录本数量在互作的初始阶段增加，在15 d时下降，分别与物理接触和侧根形成的第一阶段相一致。这种基因表达的周期性和短暂性变化表明，在相互作用的早期阶段，宿主反应具有非特异性。在菌根化的后期，几个防御和细胞壁相关基因的下调可能是宿主适应共生生物的一种尝试。有趣的是，在相互作用的早期阶段，转录本谱的许多最初变化代表了参与代谢、细胞拯救/应激相关反应和蛋白质命运的转录本。代谢、细胞拯救/应激相关反应和蛋白质命运等功能类别转录本的过度表达与其他研究报告的数据一致桦木属翻车机［8]或蓝桉［7，12］．另一方面，在这些菌根发育研究中通常记录的一些基因，如编码金属硫蛋白的基因[12]和几丁质酶[8，9较少出现在我们的系统中。它们代表了对外生菌根真菌存在的广谱反应，被认为是为了限制共生体的侵入性生长而表达的[24］．脂肪酸变化或运输的证据是相互作用的早期阶段的一个显著特征p的抗旱性外生菌根真菌Pisolithus tinctorius［31，但在本研究中缺失。这些差异可能部分反映了在本研究中使用的阵列中这些组内基因家族的数量。

此外，我们的结果与其他作者报道的差异可能与不同的树种、实验微观环境条件(包括不同的接种方法)和功能外生菌根在不同组织中发育所需的不同时间计划有关。例如在桦木属翻车机- - - - - -Paxillus involutus系统中，地幔在两天内开始形成，到8天时，根尖的横截面上已经可以看到哈蒂格网，21天后活跃的菌根形成[8］．这与我们的系统形成对比，在15天内可以看到侧根的定植，但在30天内首次观察到皮质内的细胞间生长。我们的研究中也记录了所有系统的一个共同特征，即在相互作用过程中不同应激相关基因的短暂表达。参与细胞壁修饰的酶基因的周期性表达变化表明，它们在控制根内菌丝渗透中起着重要作用。在菌根发育的后期，我们的系统使用了跨越不同官能团的大约20个ESTs进行进一步的转录本分析。在与细胞壁发育或细胞拯救、防御和应激相关功能有关的编码蛋白质的大量变化中，出现了一些有趣的模式。

一个有趣的特征是编码抗菌肽的转录本的调节模式。这种转录丰度在最初接触时增加l二色的有松根的菌丝在1 dpi，但在其他时间点减少。在30d.p.i.时，抗菌肽转录物丰度再次大幅下降。最初的增加表明宿主组织的非特异性反应，但有可能在这种真菌被识别为有益伙伴后，该基因被关闭。在致病系统中，AMP过表达已被证明可减少真菌病原体的侵袭性生长[32］．本研究在对共生真菌进行识别后下调AMP基因的表达Laccaria二色的可能是菌丝穿透和随后在松树根组织内的入侵菌丝适应的先决条件。在上述PR10和PR5类别代码内的其他ESTs在阵列上的配置与AMP相似。它们都在1 dpi时略微增加，然后在5和15 dpi时下降，在30 dpi时变化很大。PR10，它与BetV1基因家族在其他ECM系统中也很突出，在30 d.p.i时继续减少。相比之下，PR5是一种具有抗真菌特性的类thaumatin蛋白[33]，在30 D.P.I.时增加，这与细胞间菌丝穿透表皮和皮质组织的时间一致。然而，很难解释这两种pr蛋白转录本调控模式的差异，但正如其他研究记录的那样，PR5的增加可能是短暂的。此外，我们还记录了另一种应激相关转录本谷胱甘肽- s -转移酶丰度的周期性调节。结果发现，该转录本在1 d.p.i时下降，在5 d.p.i时上升，然后在15 d.p.i时再次下降，在30 d.p.i时上升。相比之下，本实验评估的硫氧还蛋白转录本在1、5和15 d.p.i时不断下降，但在30 d.p.i时略有上升。硫氧还蛋白参与了对病原体和氧化应激的反应[34］．属于同一功能群的几个基因的这种上下调节突出了相互作用的复杂性。除了参与宿主防御外，这类基因可能具有双重功能。也最有可能的是，当菌丝试图进入新的细胞组织时，许多这些应激或防御相关基因的诱导表达被激发。

除了具有防御功能的基因外，参与细胞壁修饰的转录本的调控模式也很有趣。这类转录本中的一种编码富含甘氨酸的蛋白质(GLP)，在30d.p.i.时被发现显著减少，而在阵列结果中它在所有时间点都增加。GLPs是细胞壁的第三组结构蛋白成分。它们可以输出到邻近的细胞，在那里它们有助于细胞壁的加强[35］．对另一种细胞壁修饰EST(木糖葡聚糖内do转糖基化酶(XET))进行了类似的观察，XET在30 d.p.i时降低，可能在修饰细胞壁中发挥作用，使机械应力下的区域得到加强[36］．编码GLP和XET的转录本的同时减少表明细胞壁软化，这可能是在成熟的互惠联系中观察到的密集运输机制的准备步骤。同样有趣的是编码木质素生物合成中重要酶的基因的转录谱模式[37(肉桂醇脱氢酶(CAD)、肉桂酰辅酶a还原酶(CCR)、过氧化物酶)。CCR被认为是水稻防御信号传导的效应因子[38］．其转录本在30d.p.i.时的丰度下降可以解释为细胞壁软化，但也可以解释为细胞防御反应的衰减p的抗旱性允许真菌菌丝存在于植物根细胞之间。与CCR不同的是，过氧化物酶的转录水平在评估的所有发育阶段都有所增加。过氧化物酶是木质素生物合成的最后一种酶。过氧化物酶也与植物防御反应有关，它们在真菌入侵部位的植物细胞壁加强中发挥积极作用[39，40］．

本研究中使用的微阵列所观察到的折叠值一般低于文献中报道的其他方法。其他一些作者也报告了微阵列技术的系统性偏差[41］．在本研究中，由于技术原因，有必要使用SMART™PCR扩增所有分离的RNA样本p的抗旱性。这种方法可以有效地以指数方式放大RNA，但这种非线性放大可能导致与原始mRNA池相比，目标的序列表示发生倾斜[42，43］．这可能是我们研究中的情况，与qRT-PCR相比，阵列的折叠变化通常更低。然而，用于2-混合模型分析的统计方法的严谨性和威力[44]使我们能够检测到转录本丰度在统计学上的显著变化，其倍数变化低至1.4。14个基因的表达水平，代表了阵列上差异丰度转录本的6%，用qRT-PCR进行了验证，发现与阵列数据完全一致。与其他研究发现的数据相比，用qRT-PCR获得的折叠变化通常高于阵列数据[45，46］．

此外，与被子植物系统相比，我们在微阵列研究中观察到的可检测到的低变化也可能是由于其他几个因素。在我们早期的研究中[47，我们报道在裸子植物病理系统中，宿主的反应比广泛研究的被子植物系统慢得多。此外，组织化学显微镜研究结果证实，在我们的系统中，渗透前事件、幔和Hartig网的形成比被子植物系统晚得多。因此，所有这些以及RNA扩增的技术方面可能导致了人为的低倍数变化。

综上所述，微阵列技术是研究植物外生菌根共生发育过程中基因调控模式的一种有效技术抗旱性。根据我们的研究结果，在裸子植物宿主中ECM共生的发展与被子植物宿主中相似。裸子植物外生菌根发育过程中基因调控的时间和空间尺度存在一定的差异。目前的研究已经确定了一些潜在的重要分子事件，负责启动和调节全功能共生过程中的生化、生理和形态变化，这些变化与裸子植物宿主有关。

植物材料、真菌接种及实验设计

欧洲赤松(抗旱性)种子(来源Eksjö，瑞典)表面用33%过氧化氢(H₂O₂) 15分钟，用多次蒸馏水冲洗，播种在1%水琼脂培养皿上，在21℃光周期16小时的光照下发芽。外生菌根真菌接种(Laccaria二色的(Maire) Orton，菌株S238(俄勒冈州火山口湖国家公园)在液体Hagem培养基中生长21天后获得[48］．菌丝体用无菌蒸馏水清洗，在无菌搅拌器中均质60秒。为了接种，将14天的苏格兰松幼苗在无菌条件下转移到新的1%水琼脂培养皿上的湿滤纸上。用1ml均质菌丝体接种幼苗根部，用另一张湿的无菌滤纸覆盖。对照植物接种1ml无菌蒸馏水。每个培养皿用副膜密封，下半部分用铝箔包裹，以保护根部不受光照。在取样之前，将幼苗在21°C恒定温度下，在16小时的光周期下孵育。接种1、5、15 d (d.p.i)后，将根系置于液氮中冷冻，碾碎，-80℃保存。每个时间点采集3个生物重复(100株)作为对照和接种植株。

接种试验对附加时间点、30 d p.i.略有不同。在本实验中，两周大的幼苗被转移到15毫升无菌塑料管(120 × 17毫米聚丙烯管，产品编号62-554-502,Starstedt，德国)中，其中含有10毫升水(对照)或真菌匀浆，并在与其他实验相同的生长条件下培养。在15毫升试管的每个瓶盖上开一个孔，将根插入含有真菌接种剂的溶液中。瓶盖上的孔用副膜密封，以防止微生物污染，同时允许气体交换。用铝箔把管子包裹起来，以保护根部不受光照。制备三个生物重复，并按上述方法收获和储存根系。

用荧光显微镜测定细胞死亡

以1、5和15 dpi的速度从10株幼苗中收获主根轴(10 mm)的根区域。核染色如前所述进行[49］．首先在室温下用3% HCl和95%乙醇水解5分钟，然后在pH值为3.8的柠檬酸磷酸盐缓冲液中洗涤两次。最后，将根尖浸泡在含有0.001%吖啶橙的磷酸盐缓冲溶液中15分钟，在室温下进行染色，然后在柠檬酸磷酸盐缓冲液中洗涤两次。只有活细胞中活跃的细胞核才会发出荧光。在显微镜视野下，在×40倍率下，在激励滤波器I下计数荧光核的数量₂:英国石油(BP) 450 - 490。每个处理设3个生物重复。

扫描电子显微镜

5株幼苗主根轴的根尖区(10 mm)分别在1、5和15 d.p.i中用3% (v/v)戊二醛固定，然后在室温磷酸盐缓冲液中洗涤3次，每次10 min。随后在1% (w/v)四氧化锇中固定3小时。在蒸馏水中洗涤4次(4 × 15分钟)后，依次浸入10个乙醇比例逐渐增加的溶液(10% ~ 100%，10 × 10分钟)中脱水，然后进入丙酮比例逐渐增加的一系列乙醇:丙酮溶液(3:1,2:2,1:3，纯丙酮)中。样品最后使用极化龙临界点干燥器干燥，并安装在存根上。用极化龙E5000溅射镀膜机进行镀金，用日立S-4500扫描电子显微镜(SEM)在15 kV电压下对样品进行观察。

微阵列过程

本实验使用的微阵列来评估转录的变化抗旱性外生菌根真菌挑战的根基因Laccaria二色的包含2109个ESTs松果体taeda。实验步骤、目标制备和统计分析如前所述[47］．简单地说，用于微阵列构建的2109个est(表达序列标签)是从6个cDNA文库中获得的p . taeda。每个EST的DNA被打印在氨基硅烷涂层的载玻片上，分别在4次复制中以1d.p.i进行杂交，在2次复制中以5和15 d.p.i进行杂交。为了制备靶标，从受感染的和对照的根中分离总RNAp的抗旱性幼苗。使用SMART™PCR cDNA合成试剂盒(Clontech, USA)从等量的RNA (1 μg)合成cDNA。从受侵染根和对照根在各点产生的cDNA用Klenow方法分别标记Cy3和Cy5-dUTP (Perkin Elmer, USA)。标签、杂交和严格洗涤遵循北卡罗莱纳州立大学的协议。扫描切片，并使用Quantarray软件(GSI Lumonics)注册原始的非归一化强度值。实验设计包括在每个时间点(1,5或15 d.p.i)对接种和未接种样品进行比较。考虑到染料交换和技术复制，每个样品杂交6次，阵列上每个基因在1 d.p.i时共有72个数据点，在5和15 d.p.i时共有36个数据点。

如前所述，我们使用两个连续混合模型来估计转录本丰度变化的统计显著性[44，50］．转录本的表达变化小于两倍已被证明具有统计学意义。如果这些基因同时满足以下两个标准，则被认为存在差异表达:i)在三个生物重复中有两个或在所有三个生物重复中平均发生1.4倍变化ii) p值< 0.01。

本出版物中讨论的数据也已存入NCBI基因表达综合(GEO) [51]，可通过GEO平台GPL4039访问，系列登录号:GSE5407、GSE5408和GSE5410。

基因转录qRT-PCR分析

使用一个基因子集来验证微阵列结果，并在外生菌根发育的后期跟踪一个附加子集的表达，因为它们的功能相关性。1 μg总RNA按照制造商说明用脱氧核糖核酸酶I (Sigma，瑞典)消化，用定量it RiboGreen RNA检测试剂盒(Molecular Probes, Invitrogen，瑞典)定量。用M-MLV逆转录酶(瑞典Invitrogen公司)反转录RNA样本，作为反转录阳性对照，在反应混合物中加入5000份卡那霉素mRNA (Promega公司)。所有特异性引物对均采用Primer3设计[52引物大小为20 bp, Tm为60°C，扩增子大小为50 - 150 bp(见附加文件)3.)．根据制造商的建议，ABI Prism 7700序列检测系统(perkins - elmer Applied Biosystems，瑞典)使用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)检测相对转录本丰度。使用标准曲线方法(用户公告#2,ABI Prism 7700序列检测系统，应用生物系统)从已知数量的质粒(10⁶, 10⁵, 10⁴, 10^3., 10²拷贝/μl)。质粒DNA浓度使用定量it PicoGreen dsDNA试剂盒(Molecular Probes, Invitrogen, Sweden)测定。计算中考虑了基于卡那霉素扩增的反转录反应的校正。每个样品中产物的绝对数量由标准曲线计算，并与前面所述的RNA总量进行归一化[53］．

互补脱氧核糖核酸:

克隆脱氧核糖核酸

ECM:

ectomycorrhiza

美国东部时间:

表达序列标签

信使rna:

信使核糖核酸

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

存在:

定量逆转录聚合酶链反应。

该项目得到了瑞典研究和高等教育国际合作组织(STINT)、Carl Tryggers Stiftelse和瑞典环境、农业科学和空间规划研究委员会(FORMAS)的财政支持。作者希望感谢匿名审稿人的有用评论。

从属关系

1. 瑞典农业大学森林真菌学和病理学系，瑞典乌普萨拉

   Gregory Heller, Aleksandra Adomas，李国生，Roger D Finlay, Jan Stenlid和Frederick O Asiegbu

2. 美国北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学森林生物技术小组

   Gregory Heller, Aleksandra Adomas, Len van Zyl, Ron Sederoff和Frederick O Asiegbu

3. 美国北卡罗来纳州罗利NCSU统计部

   杰森·奥斯本

4. 芬兰赫尔辛基大学森林生态系

   弗雷德里克·O Asiegbu

相应的作者

对应到格雷戈里·海勒。

作者的贡献

GH:微阵列研究，验证，显微镜，生物材料制备和qRT-PCR分析30d.p.i和撰写手稿。FA, AA, GH:微阵列分别在1,5和15,dpi下进行研究。GL:生物样品制备15,dpi。JO:统计分析。LZ, RS:生成的cDNA克隆和阵列松果体taeda和起草的手稿。FA, RF, JS:构思研究，参与设计和协调，并帮助起草手稿。所有作者都已阅读并认可最终版本的手稿。

本文由BioMed Central Ltd.授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用授权协议(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，只要原著被恰当地引用。

再版和权限