共表达和启动子含量分析在植物利钠肽的生物和非生物应激反应中发挥作用

背景

植物利钠肽(PNPs)是一类与扩张素关系较远的系统可移动分子。虽然已经报道了对PNPs的几种生理反应，但它们的生物学作用仍然难以捉摸。在这里，我们使用了表达相关性分析的组合，基因表达谱的元分析在响应特定刺激和选择突变体，启动子含量分析来推断的生物学作用拟南芥AtPNP-A PNP型。

结果

基因本体分析AtPNP-A25个表达相关性最高的基因显示了作为系统获得性抗性(SAR)途径一部分的基因注释的显著过度表达。这些基因的转录在水杨酸(SA)及其功能合成类似物苯并噻二唑s -甲基酯(BTH)、许多生物和非生物胁迫(包括许多SA介导的SAR诱导条件)以及本构SAR表达突变体中被强烈诱导cpr5而且mpk4SA水平升高的表达式AtPNP-A与SAR标记的转录因子显著相关，WRKY 70的发起人AtPNP-A相关基因在核心WRKY结合W-box中富集独联体元素。在构成性表达中WRKY 70的表达式AtPNP-A以及相关基因，包括SAR标记基因，PR-2而且PR-5，被确定为强诱导。

结论

野生型和突变体的共表达分析提供了令人信服的证据AtPNP-A可能是植物防御反应的组成部分，特别是SAR。提出的证据还表明，表达AtPNP-A受WRKY转录因子控制，尤其是WRKY 70。AtPNP-A与PR蛋白有许多共同特征，包括其转录被强烈诱导以应对病原体挑战，它含有一个n端信号肽，并与PR-1, PR-2和PR-5蛋白一起分泌到细胞外空间，已从拟南芥胚体中分离出来。基于这些发现，我们建议AtPNP-A可归类为一种新发现的PR蛋白。

已在哺乳动物、鱼类、两栖动物、鸟类和爬行动物中发现了利钠肽系统。NPs及其受体通常与参与心脏和渗透调节稳态的器官相关。在两栖动物、鸟类和鱼类中，NPs已被证明在调节血液液体量和组成方面发挥关键作用[1］．

NPs在植物中的功能的第一个迹象来自于对佛罗里达美女植物组织提取物的放射免疫分析[2]结果表明，外源施用合成人心房NP (ANP)后，香石竹和菊花的蒸腾速率、溶质流动速率和溶质吸收速率均迅速显著提高[3.］．随后研究表明，大鼠ANP能以浓度依赖的方式诱导气孔开放[4]并且这种作用似乎依赖于细胞内的第二信使cGMP(鸟苷3'，5'-环单磷酸)，因为它被鸟苷酸环化酶抑制剂LY 83583抑制，但可以被合成的细胞permeant cGMP类似物8-Br-cGMP诱导[5- - - - - -7］．ANP与离体叶膜的结合实验为特异性受体配体相互作用提供了证据[8］．

植物NP (PNP)答:芥(AtPNP-A)和几个在不同物种中密切相关的序列已被鉴定出来[9，10］．AtPNP-A与其最密切相关的序列AtPNP-B，以及其他高等植物物种中的同源分子，与细胞壁松动扩张蛋白共享一个家族-45葡萄糖苷酶结构域[11]并在此结构同源的基础上与膨胀素相关[9，12］．AtPNP-A (At2g18660)是一种长度为126个氨基酸的小蛋白(MW: 14016 kD;pI: 9.22)，由单个内含子为100 bp的基因编码。来自不同植物物种的PNPs之间最保守的区域也已被证明是其生理活性的关键[13］．PNPs系统流动性的证据来自分子的结构和加工[9］．该蛋白含有一个n端24氨基酸信号肽(MW: 2249)，可将分子引导到细胞外空间，被抗人心钠肽兔血清识别的PNPs已被定位原位在导电组织中[14]，从木质部的汁液中分离得到[15]，蛋白质组学研究发现AtPNP-A蛋白存在于答:芥［16］．

许多生理和生化研究表明，AtPNP-A在调节离子和溶质稳态中起着重要作用。免疫反应性PNP (irPNP)提取物和重组AtPNP-A已被证明可诱导叶片叶肉原生质体肿胀[17]和从原生质体中分离出来的拟南芥细胞悬浮培养分别[15］．此外，irPNP快速特异性地诱导玉米根传导中柱组织中cGMP水平的短暂升高[6]和气孔保护细胞原生质体[7]最近，重组AtPNP-A被证明以cGMP依赖的方式刺激原生质体膨胀[18］．IrPNPs还可调节植物膜间的离子通量[19]和重组AtPNP-A诱导的空间依赖性H⁺K⁺和钠⁺通量的答:芥根(20.］．irPNP的内源水平在NaCl胁迫下升高拟南芥悬浮培养细胞暴露于高盐或高渗透[15］．总的来说，这些研究表明，pnp样分子可能作为细胞外信号分子，直接影响水和溶质在应激下的转运。基于生物化学和生理数据，我们提出了AtPNP-A在细胞水平上的作用机制，如图所示1(改编自[21])。

尽管越来越多的生理和生化数据[21]，这种系统可移动肽的生物学作用仍然难以捉摸。为了推断AtPNP-A的生物学作用，我们利用了大量的AtPNP-A基因库答:芥微阵列数据研究表达谱AtPNP-A在不同的处理和突变体中，25个表达相关性最高的基因。我们进一步分析了这些已知调控基序的基因启动子。我们的研究结果预测了AtPNP-A在植物非生物和生物胁迫响应中的作用，特别是在系统获得性抗性(SAR)中。此外，我们还展示了如何通过计算分析将启动子元件编码的调控潜能与表达数据联系起来，从而为特定基因以及基因组的功能提供新的见解。

表达相关性和GO分析

在分析的第一步中，我们提取并排列了25个表达最密切相关的基因AtPNP-A(表1)．中度相关(r)所列基因的值(最大r= 0.73)可以反映的表达式AtPNP-A通过多个启动子基序进行复杂的组合控制，这些启动子基序具有来自多个潜在拮抗信号通路的复杂输入。

为了确定功能的作用AtPNP-A，在FatiGO+[中分析相关基因。22- - - - - -24的其余部分相比，识别相关列表(列表1)中GO函数注释术语中的任何偏差答:芥基因组[见附加文件1］．在生物过程的GO搜索类别中，在许多水平上参与生物防御反应的基因中存在显著的(家庭智能错误率- FWER)调整p值富集。最显著的偏倚是在8级时，SAR相关基因显著富集(调整后p值为0.0000038)(表2)1)．SAR是一种可诱导的植物对局部病原体感染的防御反应，对广泛的毒性病原体产生系统性的持久抗性[25］．SAR反应的特征是内源性水杨酸(SA)在感染组织中积聚，随后在远端未感染组织中积聚，随后诱导一组病原相关基因(PR基因)[26］．

在我们的列表中，SAR注释基因的富集特别引人注目，考虑到在FatiGO中整个答:芥基因组只包含21个注释的SAR基因，其中4个存在于我们的相关基因列表中。四个相关的SAR基因包括NIMIN1(At1g02450;r= 0.61)，参与PR基因的转录调控[26),PR-1(At2g14610;r= 0.63);PR-2(At3g57260;r= 0.73)和PR-5(At1g75040;0.61)，其表达常被用作SA依赖性SAR响应的诊断标记[27］．一个扩展的相关分析揭示了额外的11个SAR注释基因，包括NPR1(或NIM1；At1g64280;r= 0.52)，是导致SAR反应的信号转导的关键正调控因子，与PR蛋白表达显著相关(9个阳性，2个阴性;P < 0.01;二元正态分布)，表达式为AtPNP-A[见附加文件]2］．表1中其他参与植物防御反应和生物刺激反应的相关基因包括一个含有亮氨酸丰富重复序列的抗病家族蛋白(At2g32680)，一个具有三磷酸酶活性的应激反应基因(At2g04450)和一个蛋白酶抑制剂(At5g55450)。对细胞成分和分子功能类别的GO分析显示，两个列表之间的生物学相关标签没有显著差异。

Swiss-Prot关键字搜索的结果还确定了注释为PR蛋白的基因(调整后的p值= 0.002)、参与信号传递(调整后的p值= 0.026)和与表1中的异体相关的基因(调整后的p值= 0.040)的显著富集。有人指出，随着PR-1，PR-2而且PR-5，AtPNP-A是列表1中被注释为具有信号功能的六个基因之一。

微阵列表达简介

参与防御反应的基因的过度代表，特别是SAR与观察到的一致AtPNP-A相关基因在引发防御反应的微阵列实验中表达最多。诱导上调的治疗AtPNP-A2倍以上的相关基因包括SA和其他SAR诱导条件以及一些非生物胁迫(图2)．

的强势上调AtPNP-A利用SA和合成的功能性SA类似物苯并噻二唑s -甲基酯(BTH)进行相关基因分析[28]，是这些基因参与植物防御特别是SAR的关键指标，因为SA已被证明是诱导植物的SAR反应所必需和充分的[29)(图2 b)．除了AtPNP-A，在60 μM BTH处理8 h和24 h后，25个相关基因均显著(ANOVA p-value < 0.05)上调2倍以上(补充表3 [28])进一步将这些基因与SAR防御途径联系起来。的表达AtPNP-A也与等chorisate合成酶-1显著相关(ICS-1)基因(At1g74710;r= 0.50)，对SA生物合成至关重要[29］．

生物胁迫诱导的表达增加最大AtPNP-A包括感染生物营养性病原体疫霉而且白粉菌属orontii依靠活体宿主组织生存的细胞(图2 b)．激活AtPNP-A表达和相关基因对这些病原体的反应与文献一致，即sa依赖的防御通常对抗生物营养体，而jamonic acid和乙烯依赖的反应则对抗坏死营养体[30.］．

臭氧和UV-B诱导的基因表达量大幅增加(+6.86_log2和+ 8.09_log2分别为AtPNP-A)与这些基因是SAR反应的一部分是一致的，因为这两种处理都已被证明能刺激SA的产生并诱导PR基因的表达[31- - - - - -34］．

的表达式AtPNP-A相关基因也受到包括K在内的一些非生物胁迫的强烈调控⁺饥饿、渗透和NaCl胁迫以及冷驯化(图2)．非生物胁迫的一个共同因素是它们会降低水势[35］．值得注意的是，归纳AtPNP-A对离子和渗透胁迫的反应是组织特异性的，与对高钠的反应有关⁺对根组织有特异性，嫩枝变化不大，而两者均为低钾⁺而高渗透压仅在芽叶中诱导转录升高[36］．这一点很有趣，因为AtPNP-A蛋白已被证明会影响嫩枝中的水分运动[37]和原生质体[17]以及根中的离子通量[20.］．因此，人们很容易推测AtPNP-A可能在胁迫条件下维持植物水分和离子稳态方面发挥作用。

K⁺是植物大量需要的关键无机离子，而Na⁺另一方面，高浓度时是有毒的[38］．Na⁺能和K竞争吗⁺离子的摄取和结合位点，从而保持正确的钠⁺/ K⁺在植物中，比例是极其重要的。39］．K减少⁺可能会使植物吸收更多的钠⁺为了维持足够的渗透压[40］．因此，细胞质钠的增加⁺或由于K的作用而使渗透压降低⁺饥饿或两者的结合可能导致AtPNP-A归纳。

表达升高AtPNP-A和相关基因，特别是防御基因和SAR注释基因，通过非生物渗透胁迫和防御诱导处理可能很好地反映了这两种类型的挑战导致共同的稳态干扰，从而在转录上激活一组共同的反应基因。这一概念得到了几项研究的支持，这些研究认识到SA在干旱、盐度和温度等非生物胁迫中的作用[41，42]而PR蛋白的积累实际上是植物对非生物和生物胁迫的共同反应，进一步强调了生物和非生物防御机制的重叠[43］．

活性氧的产生和离子通量的变化已被确定为对非生物和生物胁迫的早期反应，包括H的流入⁺和Ca^{2 +}K的外流⁺和Cl^-［35］．AtPNP-A已被证明可以调节H⁺, Na⁺和K⁺通量(20.因此，进一步表明AtPNP-A在植物胁迫反应中，正如研究表明AtPNP-A信号通过细胞内第二信使cGMP [5，6，18]因为cGMP已被证明是病原体的重要信号分子[44]和渗透胁迫反应[45]在植物中。似乎特别相关的是，编码环核苷酸门控通道(CNGC20;At3g17700)，已被证明参与Ca的转运^{2 +}和K⁺，在某些情况下是Na⁺的值也与的值相关AtPNP-A（r= 0.60)[参见附加文件2]因为这些通道中的离子电导是由cGMP和Ca调节的^{2 +}和钙调蛋白。这些通道也涉及到调节依赖sa的生物防御反应[46］．

AtPNP-A表达也与Ca的数量相关^{2 +}传感/结合蛋白包括上述CNGC20、calreticulin 3 (At1g08450;r= 0.60)，两个钙调素结合蛋白(At1g73800;r= 0.63, At1g73805;r= 0.588)，家族成员参与植物防御反应的诱导(NCBI序列查看器，pfam07887)和Ca^{2 +}-结合EF手结构域含蛋白(At3g47480;r= 0.59)。对生物和非生物胁迫的最早反应之一是细胞质中游离钙的增加^{2 +}［47]进而在激发子处理后激活氧化爆发中发挥作用[48，49]并与sa诱导的PR基因表达有关[50］．Ca的表达^{2 +}感应分子在生物和非生物胁迫下迅速被诱导[51]和解码Ca的函数^{2 +}信号和/或传递信号到下游靶标，包括激酶，进一步放大Ca^{2 +}通过诱导下游磷酸化级联的信号[38］．存在三个激酶(At4g04490;r= 0.63, At4g23150;r= 0.63, At4g11890;r= 0.61)1)与这样的信号级联完全一致。此外，还分析了3个应激响应型有丝裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)基因的表达相关性MAPKK(At4g26070;r= 0.59),MPK 11(At1g01560;r= 0.58)和MAPKK(At4g29810;r= 0.57)到AtPNP-A也与提议的级联联系在一起[参见附加文件2］．暴露于病原体后MAPKs的激活确实有报道[52]以及一些非生物胁迫[53］．

虽然转录对一些胁迫的反应，包括渗透，盐，UV-B和一些生物处理，在多个时间点上进行了测量，但这里提供的数据通常是诱导最大增加的最早时间点AtPNP-A表达式。的表达式AtPNP-A在一些病例中，诱导时间早于本研究考虑的时间点，然而，在所有病例中，表达AtPNP-A通常随着时间的推移而增加，因此高转录水平在压力持续时间内持续，例如5天大肠orontii渗透、盐和UV-B处理24小时(数据未显示)。UV-B实验与其他实验的不同之处在于，在实验过程中没有保持压力。相反，植物被辐照15分钟，然后被转移回标准的植物室条件，直到收获。的表达式AtPNP-A在30分钟时，In升高(1.84_log2；数据未显示)，在3小时达到峰值(8.09_log2， > 250折)(图2)，并维持在较高水平(6.46_log2;数据未显示)照射后24小时。这证明了AtPNP-A在压力被移除后，表达仍然非常高且持续，因此可能表明最初造成的损伤，而不是压力本身的实际存在，是维持转录激活的驱动力。

表达的增加AtPNP-A(4.49_log2)对蛋白质合成抑制剂环己亚胺(CHX)的反应意味着转录AtPNP-A可以独立于新创蛋白质合成，这与立即早期反应基因的定义一致[54]已被提议在防御反应的早期监管中发挥重要作用[55］．已知CHX通过双重机制诱导基因表达;通过阻止短期转录抑制因子的合成或激活，或通过去除特定的不稳定转录降解酶[56］．有证据表明，诱导表达的基因编码分泌蛋白，如AtPNP-A不需要新创蛋白质合成[57］．快速诱导表达的能力AtPNP-A独立于新创因此，蛋白质合成意味着该基因在响应特定激发子时具有重要的早期作用。

顺式和转录因子中的常见基序

的通用表达式概要APNP-A25个相关基因对生物和非生物胁迫的反应表明，这些基因处于共同的调控控制之下，因此可能有共同之处独联体-在它们的启动子区域。为了揭示常见的转录激活，我们分析了这些基因在预测转录起始位点(TSS)上游1 kb的启动子区域，以发现已知植物顺式元件的存在。

POBO中的分析[58]表明不变核心TTGAC W-box基序出现在25/26的相关基因中，共78次，平均为2.99拷贝/启动子，而所有相关基因的平均为2.24拷贝/启动子答:芥启动子(t-test p-value >0.00013.和[参见附加文件]3.])。《雅典娜》中的分析[59]发现22/26个基因中出现了扩展的、更严格的TTGAC(A/T) W-box motif，共54次，平均2.08个拷贝/启动子(p值= 0.0037;数据未显示)。虽然在Athena中，这个p值并不能使W-box基序按照严格的富集阈值<10富集在我们的相关基因中⁴(Bonferroni修正)，它确实表明我们的基因中有很高的比例包含严格的w盒的多个副本。这两种启动子分析方法都表明，在我们的相关基因中，W-box元件的多个拷贝存在很高的比例，与TTGAC核心基序的预期频率相比，核心TTGAC基序显著富集答:芥表明它们是这些表达相关基因的重要调控元件。

在植物中，W-box顺式元件与WRKY tf结合[60表明这些tf可能在调节相关基因的表达中起重要作用。这与我们的表达分析结果完全一致，因为WRKY家族的tf [60]在调节植物的疾病反应中起着很好的作用[61］．此外，它们也被证明可以介导非生物植物对冷冻的反应[62]，伤人[63]、氧化应激[64]、干旱、盐度、寒冷和高温[65- - - - - -67］．在我们的研究中，表达AtPNP-A是否与?的表达有中度相关WRKY 70(At3g56400;r= 0.60)和WRKY 46(At2g46400;r= 0.56)[参见附加文件2］．的表达式配置文件时WRKY 70而且WRKY 46基因，很明显，在各种处理中，导致表中相关基因的表达大幅增加1也诱发了明显的表达变化WRKY基因(图2)．的表达AtPNP-A和WRKY研究表明，WRKY 70和WRKY 46对常见生物反应具有正向调控作用AtPNP-A转录。

而转录WRKY 70而且WRKY 46通常强烈诱发SAR诱导治疗，只有WRKY 46是一致共表达的AtPNP-A对非生物(离子和渗透)胁迫的响应(图2而且2 b)．如前所述AtPNP-A和相关基因，诱导表达WRKY 46是芽对K⁺饥饿和渗透胁迫以及根系对NaCl胁迫的响应。

之间的表达相关性AtPNP-A所讨论的WRKY基因和相关基因中w盒的过度表达促使人工分析的启动子AtPNP-A揭示了四份核心TTGAC W-box基序的存在，以及两份更严格的TTGAC(C/T)基序的出现，这些基序聚集在与预测的TSS相对近的位置(从-738和-775开始)。人工检查的结果与从Athena和POBO返回的结果一致。这些基序的相似频率在26个SAR调控基因的研究中观察到PR-1在预测的TSS上游1100 bp内，所有26个基因的启动子中平均只有4.3个核心W-box元件，2.1个更严格的W-box元件[60］．这些值代表了w -box的显著富集，因为这些作者确定了随机分布的五聚体(TTGAC)的统计期望是每1100 bp启动子2.1个拷贝，而六聚体(TTGAC(C/T))的统计期望是1.1个拷贝[60］．

综上所述，所提供的证据与转录完全一致AtPNP-A相关基因被WRKY转录因子正调控。的推动者AtPNP-A相关基因中含有丰富的核心W-box motif和表达AtPNP-A与两个WRKY基因相关，以响应各种SAR诱导以及生物和非生物胁迫。的相关性WRKY 46在对离子和渗透的反应中，非iotc胁迫是处理和组织特异性的。鉴于这些事实，我们建议的表达AtPNP-A可能受到WRKY tf的密切调控，以应对sar诱导和非生物胁迫。

AtPNP-A在突变体中的表达

AtPNP-A, SA信号与WRKY tf之间的联系也得到了表达谱的支持AtPNP-A突变体中的相关基因包括aWRKY 70过表达和各种SAR相关突变存在于genevarcheator的突变测量器中[68］．

WRKY 70是一个SAR标记的FatiGO转录因子，已被证明是诱导植物防御反应所必需的一个重要因素公关基因表达答:芥［28，69］．在微阵列研究中，的本构过表达子WRKY 70被证明可以诱导SA诱导的PR基因的本构表达，我们的5个相关基因，包括被广泛认为是SAR标记基因的PR-2和PR-5，对应于本研究中>较对照组上调2.5倍的基因[69］．虽然用于这项研究的8K Affymetrix芯片不包含AtPNP-A在一项未发表的使用24K芯片的实验中，AtPNP-A过度表达上调超过50倍WRKY 70并且在本研究中处于上调的前20个基因之列(图4；个人沟通:Gunter Brader，赫尔辛基大学生物科学学院)。此外，在本实验中还观察到25个相关基因的强烈诱导表达，进一步证明WRKY 70可能正调控了蛋白的表达AtPNP-A和表达相关的基因。

在cpr5(发病相关基因的组成表达体)和mpk4SA水平升高并显示PR基因本构表达的突变体[70，71的表达AtPNP-A相关基因显著升高(图4)．特别有趣的是，所列的四种突变体在表达中显示出最大的增加AtPNP-A在gen调查者都是cpr5突变体,cpr5 / scv1，cpr5 / npr1，cpr5，cpr5 / npr1 / svi1(范围+7.55到+6.21_log2)(数据未列示)。

相反,nahG该突变体在SA的产生和信号传导中存在缺陷，是本研究中提出的唯一一项实验，证明了SA的表达大幅降低AtPNP-A(-4.6_log2)和相关基因(图4)．本实验是在衰老的叶子上进行的[72]以识别发育衰老过程中SA依赖的整体基因表达模式，因为SA之前已被证明是一些衰老诱导基因表达所必需的[73］．在本研究中，与ATGE发育系列有关答:芥微阵列实验[74转录水平AtPNP-A与成年绿叶相比，衰老叶片的水平升高了约2.8倍(数据未显示)，表明AtPNP-A是一种衰老增强基因。此外，由于转录水平AtPNP-A在衰老的叶子中被减少到超出检测限度nahG突变体的这种诱导似乎是sa依赖的。这一模式与其他结果完全一致，因为包括叶片黄化和坏死在内的过早衰老可由刺激SA产生的生物和非生物应激引起，包括臭氧[75]及UV-B [76]也会导致基因表达的大幅增加AtPNP-A．因此，有证据证明诱导AtPNP-A在sa介导的自然发育和应激激活过程中的表达，这两个过程都以细胞死亡为高潮，表明AtPNP-A可能参与这些过程。突变体分析进一步证实了基因的转录调控AtPNP-A相关基因主要由SA控制。

TGA转录因子在PR基因表达中的作用

共同监管的额外证据AtPNP-A通过观察另一种SAR标记的TF的表达，提供了SAR标记的基因TGA3bZIP TF (At1g22070)，与的相关AtPNP-A（r= 0.49)。在SAR的诱导下，NIMIN1和NPR1与细胞核中的TGA因子形成三元复合物，增强了它们与正调控as-1(激活子序列1)或as-1-like (TGACG)的结合。独联体-在防御过程中激活的几种植物基因的启动子中存在的元素，包括A. thaliana PR-1［77- - - - - -79］．手动检查AtPNP-A启动子在TSS附近发现了两个TGACG基序(从-94和+24开始)。之间表达的相关性AtPNP-A，NPR1，NIMIN1而且TGA3(表1，和[参见附加文件。2])以及TGA3的鉴定独联体的启动子中的元素AtPNP-A是否有强有力的证据表明这两个因素有助于监管AtPNP-A表达式。

AtPNP-A作为PR蛋白

基于上述结果，我们认为AtPNP-A可以被归类为PR蛋白，因为它具有定义这类蛋白的许多标准。“致病相关蛋白”这一名称是一个集合术语，包括在健康组织中几乎无法检测到的所有蛋白质，但在病原体感染后在蛋白质水平上诱导产生。这些蛋白质的分类是基于它们的病原体诱导表达，而不是在防御中定义的功能作用[43］．这一点在考虑PR-1时得到了关注，它是SAR响应的典型标记，但其生物学作用在很大程度上尚不清楚[80］．虽然AtPNP-A尚未被证明是在蛋白质水平上诱导对病原体的反应，蛋白质水平的升高已被证明是非生物胁迫的结果[15］．此外，转录AtPNP-A在控制条件下低，但在生物和非生物胁迫下强烈诱导，该蛋白已从答:芥将PR-1, PR-2和PR-5蛋白异体结合在一起[16］．AtPNP-A具有PR蛋白的其他特征，包括n端信号肽[43引导分子进入细胞外空间。进一步，归纳AtPNP-A在转录水平似乎发生独立新创分泌蛋白编码基因的蛋白质合成特征[28］．AtPNP-A的进化史表明，与相关的扩张蛋白一样，PNPs起源于祖先家族-45内切葡聚糖酶，这些酶已经失去了水解活性，并亚功能化为细胞外的、系统可移动的信号分子[9］．

未来的发展方向

以确定的生理作用AtPNP-A在答:芥可以使用SALK提供的T-DNA插入突变体。在sa诱导的非生物和生物胁迫以及发育衰老过程中对该突变体进行表型分析，将有助于表征其中的特定生理过程AtPNP-A是参与。如果这样的突变体表现出了SAR反应的减弱，这将极大地加强这一说法AtPNP-A确实参与了SAR响应途径。此外，在an中相关基因的表达将是有趣的AtPNP-A在SAR诱导条件下发生突变，因为这可能使我们能够确定其作用AtPNP-A在SAR响应路径的背景下。

AtPNP-A是一种被标记的“信号”分子，它被分泌到外质体空间，并被认为在控制植物中的离子和溶质运动中起作用(图1)．的表达式AtPNP-A在对各种生物和非生物刺激的响应和突变研究中，与参与SAR防御反应通路的基因显著相关。的表达式AtPNP-A与ICS-1参与SA生物合成的基因NPR1而且NIMIN1，它们是SAR响应的关键正调控因子，以及两个注释的SAR tfTGA 3而且WRKY 70．此外，像PR基因一样，启动子AtPNP-A包含1和W-box独联体-与tga3和WRKY tf结合位点相对应的元素。此外，过度表达WRKY 70基因的表达增加了50倍以上AtPNP-A这与这个TF是一个积极的调节因子是一致的AtPNP-A转录。诱导表达AtPNP-A其分泌到外质体的过程与PR蛋白的分泌过程相似，这强烈暗示了一种作用AtPNP-A在植物的SAR防御反应中，这可能涉及在应激反应中细胞离子和水稳态的改变。

相关基因鉴定

我们下载(01/07/2005)答:芥1877次实验的基因表达水平，来自NASCArrays数据库[81]，使用批量数据下载选项。的表达式之间的非参数相关系数(Spearman's rho)是用Perl脚本计算的AtPNP-A(At2g18660)和用于生成该数据集的Affymetrix阵列上表示的约22,000个基因中的每一个。我们根据相关系数对基因进行排序，并报告与At2g18660正相关程度最高的基因。p值采用二元正态分布计算，p表示偶然观察到相等或更大的正相关或负相关的概率。

相关基因功能分类及表达分析

为了描述相关基因，基于web的“FatiGO+”程序[22]用于搜索该列表中基因本体(GO)和生物学术语的差异分布。搜索是使用AtPNP-A(At2g18660)和表中25个正相关基因1(列表1 = 26个基因)。将该列表与包含整个剩余基因的参考基因列表进行比较答:芥基因组(表2 = 26147个基因)。使用Family Wise Error Rate (FWER)来计算调整后的p值，以确定统计学意义。

的表达式配置文件AtPNP-A正相关基因(表1)最初使用基因响应观察工具(GRV)中的Affymetrix公共微阵列数据进行检查[68])。分析使用ATH1: 22K阵列芯片类型进行，并包括所有可用的2507芯片来源。为了获得更好的时间和空间响应分辨率，我们从以下站点获得了归一化微阵列数据:NASCArrays, Ozone-26(参考ID);p . 5-123;uv - b - 144压力;钾饥饿- 105;二叔丁基对甲酚- 392。TAIR:水杨酸- me00364;E.orontii-ME00354;盐stress-ME00328;渗透stress-ME00327;冷acclimation-ME00369;Cyclohexamide-ME00361。地理(NCBI):大肠cichoracearum-GSE431。

为了进一步揭示的关系AtPNP-A与参与SAR反应的关键基因的表达，genevestikator中的突变测量器用于比较不同类型防御相关的基因表达答:芥突变体。本研究调查的基因包括AtPNP-A， 25个相关基因WRKY 70而且WRKY 46．从突变体实验中得到的归一化阵列数据为:TAIR-ME00373cpr5 / npr1突变体;NASCarray-52nahG的突变和数组表达(EBI)mpk4突变体(e - mexp - 173)。为WRKY 70数据是通过与赫尔辛基大学生物科学学院Gunter Brader的个人交流获得的。

启动子分析

基于网络的雅典娜[59]和POBO [58的启动子(预测TSS上游-1 kb)AtPNP -和25个最相关的基因。

在POBO中[58]，上传1 KB启动子序列，并进行分析答:芥背景(干净)搜索TTGAC W-box核心主题使用默认设置(挑选的序列数量= 50，生成的样本数量= 1000，序列长度= 1000 bps)。在GraphPad网站上计算双尾p值，使用生成的t值和自由度来确定输入序列和背景之间的统计差异。

在Athena中，使用可视化工具进行分析，使用26个相关基因，设置在上游1000 bp，不切断相邻基因。使用超几何概率模型计算p值，自动计算过度代表的TF结合位点的统计显著性。Athena自动使用Bonferroni校正来解释多个假设检验(多达105个不同的TF结合位点)，并确定显著富集的p值阈值< 10⁴．

NP:

-利钠肽

PNP型:

-植物利钠肽

特别行政区:

-系统性获得性耐药性

cGMP -鸟苷3':

5 '环一磷酸

TF:

-转录因子

TSS:

翻译开始网站。

该项目由南非国家研究基金会和欧内斯特·奥本海默纪念信托基金资助

从属关系

1. 西开普省大学生物技术系，私人包X17，开普敦，贝尔维尔，7535，南非

   Stuart Meier, René Bastian, Shane Murray和Chris Gehring

2. 开普敦大学分子与细胞生物学系，私人包，朗德博斯，7701，南非

   劳拉·唐纳森

3. 南非国家生物信息研究所，西开普大学，私人包X17，开普敦，贝尔维尔，7535，南非

   Stuart Meier和Vladimir Bajic

相应的作者

对应到克里斯•格林．

作者的贡献

该项目是由CG和VB设计的。StM、RB、LD和ShM对数据进行了提取和解释。手稿由StM和CG撰写。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

开放获取本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。

转载及权限