拟南芥肌球蛋白VIII的亚细胞定位与功能

背景

肌凝蛋白是肌动蛋白激活的atp酶，它利用能量产生力并沿着肌动蛋白丝移动，用尾巴拖拽不同的货物。植物肌球蛋白属于非常规肌球蛋白，拟南芥肌球蛋白VIII基因家族包含4个成员:ATM1、ATM2、myosin viia和myosin VIIIB。

结果

在表达GFP与ATM1 (IQ-tail截断，缺乏头部结构域)融合的转基因植物中，荧光呈差异分布:而在根冠的表皮细胞中，GFP-ATM1均匀分布在整个细胞中，在该区域上方的表皮细胞中，荧光呈点状累积。再向上，在伸长区细胞中，GFP-ATM1优先位于横向细胞壁的两侧。有趣的是，点状模式对brefeldin A (BFA)不敏感，而在一些靠近根冠的细胞中，BFA体中发现了ATM1。用不同的标记和瞬态表达烟草benthamiana结果表明，肌球蛋白VIII与胞间连丝和内化FM4-64共定位，并与内体标记物ARA6部分重叠，很少与ARA7和FYVE重叠。当ATM1被截断时，ARA6标记的细胞器的运动受到抑制，而当ATM1大量过剩时，FYVE标记的细胞器的运动受到抑制。此外，GFP-ATM1和RFP-ATM2 (IQ-tail domain)共定位于质膜上的相同位点，表明这些位点上有特定的肌球蛋白结合成分。

结论

综上所述，我们的数据表明，肌球蛋白VIII在不同根细胞中的功能不同，可能参与内吞作用的不同步骤、bfa敏感和不敏感途径、内质网系结和胞间连丝活性。

拟南芥肌球蛋白基因家族包含17个成员。1，2]，包括13个成员，而与非常规肌凝蛋白V相关的肌凝蛋白VIII组[2]还包括肌凝蛋白VI [1]，包括四名成员。3.]。通常，拟南芥肌球蛋白包含一个保守的运动结构域，一些用于轻链结合的IQ结构域，一个预计有助于二聚化的卷曲结构域和一个特定的尾部来结合货物[3.]。植物肌球蛋白通常与细胞质流动有关[4]，细胞器运动[5- - - - - -7]，胞质分裂[8- - - - - -10]，胞间连丝功能[10，11]和内吞作用[10，12，13]。

肌球蛋白VIII (Myosin VIII, ATM1)是第一个被鉴定和测序的植物肌球蛋白[14]。在免疫荧光和电镜研究中，针对其独特尾部对应的肽产生的特异性抗体显示，ATM1定位于植物特异性结构，如玉米和拟南芥根细胞中新形成的细胞壁的胞间连丝和质膜[11，15]。在玉米根尖内皮层细胞的坑田中也发现了ATM1，预计它参与了液相内吞作用[12]。在最近的一项研究中，同样的抗体被用来证明，在玉米根冠细胞中，ATM1分别在渗透刺激5分钟和90分钟后定位在细胞核周围，但重新定位到淀粉体和间连丝上[16]。后者表明肌动蛋白参与根渗透感应[16]。当ATM1与GFP融合时，其荧光在BY2细胞中主要集中在发育中的细胞板上[17]。肌凝蛋白VIII的四个成员是ATM1、ATM2、肌凝蛋白VIII和肌凝蛋白VIII。虽然ATM1与viia更相似，但ATM2在序列和表达模式上都与VIIIB相关。

在这项工作中，我们使用GFP融合物跟踪myosin VIII。我们发现，在表达GFP-ATM1(IQ-tail)荧光的转基因植物中，不同根细胞的定位存在差异。根细胞对BFA的敏感性也存在差异。当短暂地表达在n benthamianaGFP-ATM1(IQ-tail)在坑田中积累胼胝质，并与内质网共定位。ATM1也与内化FM4-64共定位，部分与内体标记物ARA6共定位，很少与ARA7和FYVE共定位。此外，截断的ATM1抑制了相关的ARA6标记细胞器的运动，但可以在运动的FYVE标记细胞器上发现。只有与FYVE标记的细胞器相关的大量过量的ATM1阻止了它们的运动。综上所述，我们的数据表明，肌球蛋白VIII在不同的细胞中具有不同的功能，可以参与内吞作用的不同步骤、BFA敏感和不敏感途径、内质网系结和胞间连丝活性。

表达GFP-ATM1(IQ-tail)的转基因植物

获得了表达GFP-ATM1(IQ-tail)的转基因拟南芥植株。在对卡那霉素产生抗性的数十株幼苗中，只有一株幼苗表达了可检测水平的GFP-ATM1(IQ-tail)，这表明突变分子具有一定的细胞毒性。GFP-ATM1(IQ-tail)被表达并传递给后代，但与野生型(wt)植物相比，没有观察到显著的表型或细胞形态变化。有趣的是，GFP-ATM1 (IQ-tail)的荧光在根中可见，但在芽和叶中几乎检测不到。

为了验证嵌合体的正确表达，我们对转基因植物和wt植物作为对照制备的DNA进行了PCR，并与用于产生转基因植物的嵌合体编码质粒的DNA进行了PCR比较。数字1结果表明，利用与质粒DNA相似的转基因植物DNA，在PCR中检测到预期片段的全长(1734 bp)。对照植株呈阴性。Western blot分析证实了全长嵌合体的表达(~57 kDa)，并显示GFP- atm1嵌合体在转基因植物中的表达水平与对照植物中单独GFP的表达水平相比非常低(图5)1 b)。由于我们手头缺乏良好的抗ATM1抗体，没有与内源性蛋白的表达水平进行比较。转基因植株根的共聚焦显微镜图像显示，嵌合体GFP-ATM1(IQ-tail)在不同细胞中的定位存在差异。在根冠的表皮细胞中，荧光均匀分布在整个细胞中，而在根冠上方的表皮细胞中，荧光以850±150 nm直径的点或聚集体积累。再往上看，在伸长区细胞中，GFP-ATM1(IQ-tail)优先位于横向细胞壁(图2)2 a, B和2摄氏度)。这种GFP-ATM1(IQ-tail)亚细胞分布模式在5天大的根中发现(图2)2)和20日龄(图2 b和2摄氏度)幼苗，包括侧根(图2 b)。当一个三维图像的图形2 b构建并绕其轴旋转，可以看出这些点分散在细胞周围，难以区分膜和细胞质的特异性定位(附加文件1)。在根毛中，GFP-ATM1(IQ-tail)也形成了点状图案(图2)二维)。

ATM1对BFA在不同根细胞中的敏感性差异

不像其他一些物种，BFA处理导致高尔基蛋白重新分配到内质网[18]，在拟南芥根细胞中，BFA导致BFA小体的形成，BFA小体来源于内体膜并积累内吞标记物[19- - - - - -22]。因此，研究表明拟南芥中bfa敏感的过程是内体运输[19，20.，22- - - - - -24]。由于肌球蛋白VIII与内吞作用有关[10，12，13我们解决了BFA处理是否会影响不同根细胞中GFP-ATM1(IQ-tail)的特定亚细胞组织以及ATM1是否会在BFA体中发现的问题。数字3 a, B和3 cBFA处理没有破坏ATM1的点状模式，在这些特定细胞中形成的BFA小体中没有发现ATM1;这表明ATM1的功能与bfa无关。相比之下，在BFA处理前靠近根冠的细胞中，ATM1均匀分布在整个细胞中，而在BFA处理后，在BFA体中发现了ATM1(图2)3 d, E和3 f)。这表明，在这些细胞中，ATM1对bfa敏感，可能参与特定发育阶段的内体运输。分别用BFA和FM4-64处理单纯表达GFP的转基因幼苗作为对照。在这些植物中，GFP遍布于检测到BFA体的根细胞的细胞质中(另附文件)2)。为了检查ATM1是否参与了内吞作用的不同步骤，我们使用了各种不同的内体标记物。

瞬时表达的ATM1的亚细胞定位n benthamiana

当ATM1(IQ-tail)的荧光嵌合体(GFP或RFP)在n benthamiana经农杆菌浸润的叶片，荧光在叶背面表皮细胞的质膜上以点(或点的聚集体)的形式积累(图2)4)。为了验证这是否是肌凝蛋白VIII成员的一般定位模式，我们检查了ATM2、肌凝蛋白viia和肌凝蛋白viib。ATM2和ATM1形成的圆点相似(直径590±180 nm)，而myosin viii形成的圆点较小(直径330±50 nm)(图2)4 b和4摄氏度)。Myosin VIIIB与Myosin VIIIA非常相似(未显示)。绝大多数ATM1荧光点是静止的，但很少，不到1%的点是移动的(附加文件)3.)。研究者分析显示，肌球蛋白VIII家族成员表现出不同的表达模式(附加文件)4) [25]。虽然ATM1和肌球蛋白VIIIA在大多数器官中表达相似，但ATM2和肌球蛋白VIIIB在花粉中表达更高，在雄蕊和根毛中的表达程度较低(附加文件)4)。因此，确定ATM1和ATM2形成的点是否重叠是很有趣的n benthamiana叶子。因此，GFP-ATM1和RFP-ATM2在这些叶片中共表达，并且都定位于质膜上相同的特定点(图2)4 d-f)。这表明在质膜上存在能够结合两种肌球蛋白的特异性灶。有趣的是，当ATM1荧光嵌合体与ER标记ERD2-GFP共表达时[26]， ATM1的点状标记模式与ER相关(图2)4胃肠道)。用ATM2观察到相同的图像(未显示)。苯胺蓝染色胼胝质[27]， ATM1在富含胞间连丝的坑区中聚集(图2)4 j-l)。为了扩大我们对ATM1可能参与内吞作用的看法，我们使用膜染料FM4-64来跟踪膜内化。ATM1不仅存在于质膜上，还存在于细胞质中，与内化的FM4-64共定位(图2)5 a - c)。此外，ATM1荧光嵌合体与拟南芥内体标记物ARA6-GFP和GFP-ARA7、Rab5同源物共表达[28和red - fyve。FYVE结构域是一个保守的蛋白质基序，其特点是能够以高亲和力和特异性结合磷脂酰肌醇3-磷酸(Pi(3)P)，这是一种在早期核内体中高度富集的磷酸肌醇[29]并已被证明与植物中的ARA7和内化的FM4-64共定位[30.]。结果发现，虽然FYVE和ARA7标记的细胞器位于细胞质中，但在不到1%的标记细胞器中观察到与ATM1共定位(图1)5 d-f,胃肠道)。通常，FYVE和ARA7标记细胞器的运动不受同一细胞中截断的ATM1存在的影响，可能是因为它们大多数没有共定位(附加文件)5)。然而，偶尔这两个运动细胞器同时标记FYVE和ATM1(附加文件)6)，并且可以检测到被过量GFP-ATM1包围的静止的FYVE标记体(附加文件7)。约80-90%的ARA6标记细胞器与ATM1在质膜处或靠近质膜处共定位(图2)5 j-l)。重要的是，在没有GFP-ATM1的情况下，ARA6标记的细胞器具有高度的运动性8)，在ATM1的存在下，所有共标记的细胞器都变得不动，只有那些没有ATM1的细胞器保持运动(附加文件)9)。以上表明ATM1在ARA6标记的核内体的功能中起主要作用，而在ARA7/FYVE标记的核内体的功能中起次要作用[31]。

在这里，我们研究了表达GFP嵌合体的转基因植物，该嵌合体融合了截断的肌球蛋白VIII - ATM1的iq尾结构域。这种突变分子缺乏与肌动蛋白结合的头部运动结构域，但含有颈部和尾部结构域，预计将与细胞靶标结合，并通过阻断肌球蛋白结合而发挥显性阴性作用。事实上，在许多表达抗生素抗性基因的幼苗中，只有一个被发现表达肌球蛋白的荧光嵌合体，水平非常低。这可能是突变体细胞毒性作用的结果。在表达突变肌球蛋白的植物中没有观察到可检测的表型，这一事实令人惊讶，但可能是低水平表达的原因。在这方面，应该提到的是，当其他截断的肌球蛋白在植物细胞中表达时，没有观察到对细胞器运动的明显抑制[32表明肌凝蛋白的功能存在冗余。在转基因植物中，我们发现了ATM1在根细胞中的不同定位和功能。在抗肌球蛋白VIII抗体染色的玉米根系中，肌球蛋白VIII也表现出类似的差异定位，在根冠细胞中弥散分布，但在根尖分生组织远端、内皮层细胞和伸长区远端出现细小斑点[11]。

鉴于ATM1在不同根细胞中对BFA的不同敏感性以及它与不同内体标记物的共定位，我们认为ATM1参与了内体生物发生和功能的各个阶段。我们证实了先前的数据，即肌球蛋白VIII存在于质膜上，并在胞间连丝中富集[11，12，15，33]。此外，我们证实了先前的结论，即肌球蛋白VIII参与内吞作用[13]并参与将内质网的皮质成分系在质膜上[10]。

ATM1位于质膜和核内体

根据他们的发现，Dieter Volkmann及其同事得出结论，肌凝蛋白VIII可能对细胞内运动不太重要，而更多地参与细胞周围肌动蛋白丝的锚定[15]。他们预测了肌球蛋白VIII的另一种可能作用，即在质膜下形成皮质内质网元件的结构支持，包括胞间连丝的内外[10]。他们还认为肌球蛋白VIII可能在液相内吞过程中引起质膜内陷[12]。

虽然ATM1在所有植物器官中的表达基本相同，但ATM2对男性生殖器官具有特异性(附加图2)。细胞骨架蛋白的其他基因家族在营养组织和生殖组织中表现出差异表达，如肌动蛋白[34]， profilin [35，3625])。我们提供的证据表明，ATM1和ATM2在质膜上瞬时表达时，会在细胞膜上的特定位点共定位n benthamiana叶子。这是第一次发现两种植物肌球蛋白在质膜上的相同位置共定位，这表明在这些位置的质膜具有独特的组成。质膜上的肌球蛋白viii标记点可能是皮质肌动蛋白纤维与质膜连接的位置，如“局灶接触”[10，37，38]，内吞作用部位[31]，富含固醇的复合物[24或其他我们还不知道的东西。由于我们的肌凝蛋白结构不包含头结构域，即肌动蛋白结合结构域，我们不能用它们来解决肌动蛋白与质膜结合的问题。

此外，我们还展示了ATM1的共定位(图1)5胃肠道)，急诊室也在n benthamiana叶子。BDM(2,3-丁二酮2-单肟)是真核细胞肌球蛋白atp酶的一般抑制剂，当BDM(2,3-丁二酮2-单肟)应用于玉米根系生长时，观察到与胞间连丝和坑场相关的肌球蛋白VIII、肌动蛋白丝和皮质内质网元件的典型分布模式发生了变化[39]。然而，如图所示，表达的GFP-ATM1是一个缺乏头部肌动蛋白结合域的突变分子，没有破坏内质网。这表明肌球蛋白VIII对于将皮质内质网锚定在质膜上是必要的，但不是必需的[40以及其他有重叠功能的蛋白质。因为ER跨越胞间连丝[41它进一步表明了ATM1和急诊室之间的密切关系。胞间连丝肌球蛋白VIII被认为通过其产生的力来控制细胞间小管和质膜之间的间距，从而参与调节电导率[11]。我们的数据表明内质网和肌球蛋白VIII之间的串扰并不局限于间连丝，因为在表皮细胞的外膜上也观察到共定位。关于肌凝蛋白V在酵母和动物细胞内质网定位和运动中的作用，提出了两种模型;a型肌凝蛋白V主动转运内质网小管，而b型肌凝蛋白V则在细胞表面粘附内质网[42]。

在根毛中(图11 d) GFP-ATM1沿细胞呈点状分布。根毛尖端的清晰区富含膜再循环活性和由内体标记FYVE标记的细胞器[30.]。43]。应仔细分析ATM1在根毛伸长区是否存在。

当ATM1与不同的内体标记物共表达时，发现与ARA6部分共定位，很少与ARA7和FYVE共定位。哺乳动物细胞中的核内体分为四类;早期核内体，晚期核内体，循环核内体和溶酶体[44]。在植物中没有类似的分类，内体之间的功能差异也不清楚。Rab5小gtpase通常调控早期核内体[45]和植物Rab5同源物ARA6和ARA7定位于不同且部分重叠的核内体亚群[28，46]。虽然ARA6与前液泡室(PVC)特征的SNARE蛋白共定位，但ARA7没有[46]。这表明ARA7标记了更早的内体隔室[46]。事实上，研究表明，在植物中，内吞作用和液泡运输的途径在聚氯乙烯处合并[47]。然而，当ARA7与其他PVC标记物PS1-GFP共表达时[48]或AtPEP12p:HA [49]，在聚氯乙烯中也检测到了。在我们的工作系统中，ATM1主要在质膜处以点状模式检测;然而，在细胞质中也观察到，尽管很少。胞质GFP-ATM1的点与内化FM4-64共定位，很少与标记物FYVE和ARA7共定位。ATM1与ARA6的共定位很明显，似乎在质膜上。事实上，先前的研究表明GFP-ARA6存在于质膜和内质网上[28]而Ara7和Rha1则不同[46]。通过显示ATM1对ARA6标记的内体的偏好，并通过证明每个ARA6标记的细胞器在与截断的ATM1相关时失去其运动能力，而FYVE标记的细胞器虽然与ATM1相关但仍能保持运动，并且只有大量截断的ATM1才能阻止其运动，我们为内体存在不同亚群提供了另一个证据[46]。我们的数据表明，ATM1对含有ARA6的核内体的运动更为重要，而在含有FYVE/ARA7的核内体的功能中只起很小的作用，如果有的话。重要的是，观察到ARA6-GFP部分共标记了bfa诱导的根结构[24这与我们的研究结果一致，即ATM1一方面与ARA6-GFP有关，另一方面与特定根细胞中的BFA体有关。

ATM1部分定位于以ARA6、ARA7或FYVE为标记的不同囊泡和BFA小体，表明它在不同成熟阶段的核内体运动和核内体向质膜的再循环中发挥作用[j]。19，20.，22- - - - - -24]。肌凝蛋白VI在胞吞作用中有双重作用，既在质膜上，也在内体运动中[50，51]，在系统发育上与肌球蛋白VIII接近[1]。在动物细胞中，肌凝蛋白VI参与了细胞质膜上网格蛋白包被囊泡的形成和新生的未包被囊泡从富含肌动蛋白的细胞外围向早期核内体的运动[50，51]。有趣的是，肌凝蛋白VI被发现向肌动蛋白的负端移动[52]以渐进的方式[53]。肌凝蛋白VIII的后一种功能尚不清楚。

肌球蛋白VIII在不同根细胞中可能的不同作用

植物根系是非常复杂的传感器，能够感知各种不同的环境和土壤线索，如重力、触觉、水势和渗透压。重力感应是由位于小柱根冠内的特化细胞完成的。信号被特化的细胞、静止细胞感知，这些细胞中含有特定的淀粉体、静止石，它们根据重力在这些细胞中沉积[54]。重力感知信号通过移动的生长素信号从小柱细胞传递到伸长区细胞[55]。肌动蛋白网络被认为是沉积淀粉体通过或与之相互作用以触发导致根取向的下游信号事件的细胞结构[56]。越来越多的证据表明，生长素的运输是由肌动蛋白调节的[24，57- - - - - -59]。因此，ATM1在根冠细胞和细长细胞中的不同定位可能反映了它在信号感知过程中作为肌动蛋白细胞骨架的一部分所起的不同作用。我们没有在GFP-ATM1 (IQ-tail)植株中检测到与向地性相关的特殊表型。虽然ATM1似乎在伸长区有细胞横壁的极化定位，但它在生长素转运体极化积累中的作用[19，24仍有待决定。触觉刺激而非重力刺激导致Ca的短暂性增加^{2 +}根细胞中的离子[60帽细胞中诱导的增加比分生组织或伸长区的细胞更大，寿命更长[60]。触觉诱导的钙调蛋白样蛋白2 [61[我们发现]以钙调节的方式与ATM1的IQ结构域相互作用[62]。因此，ATM1可以参与不同根细胞的不同触摸反应，由TCH2作为轻链调节。ATM1也被证明对渗透信号有反应，特别是在根冠细胞中，它被发现在刺激后被招募到质体表面[16]。在一些根细胞中看到的虚线图案是由玉米根中的抗肌球蛋白VIII抗体鉴定的[11，15]为胞间连丝富集的坑田。利用一种专门的胼胝质染色剂，我们证实了ATM1的存在n benthamiana然而，在转基因植物的叶片中，ATM1荧光点散布在细胞各处。因此，我们并不确切地知道，ATM1在这些特定细胞中发挥的不同功能是什么。同时，在GFP-ATM1呈点状分布的细胞“带”中，并非所有细胞都呈点状分布，这可能是由于它们在发育阶段缺乏同步性所致。

虽然缺少头部结构域的ATM1的截断GFP融合可以在保持正常的植物中表达，但它被发现是ATM1在根细胞中的行为的有用探针。利用这些植物，在活细胞中，ATM1在根表皮细胞的发育过程中改变了它的定位。这种定位的变化伴随着对BFA敏感性的变化，表明功能上的改变。进一步，本研究通过活细胞显微镜提供了证据，表明Myosin VIII优先参与ARA6相关核内体的功能，并定位于内质网和富含胞间连丝的窝区。

植物材料

拟南芥将ecotype Col-0播种于MS (Murashige & Skoog)培养基上，4°C黑暗培养4天，然后转移到24°C光照16 h /黑暗8 h的生长室。7-10天后，将幼苗移栽到有泥炭的花盆中，在温度控制(23°C)的温室中连续光照下生长。

烟草benthamiana在25°C的受控生长室内，在最佳光照条件下，每天在泥炭中生长16小时。

质粒

为了将ATM1的IQ-tail结构域与GFP融合，我们使用了Dieter Volkmann(德国波恩大学)提供的cDNA克隆和以下引物:Fwd-GGG GTA CCC GTA CTC TCC ACG GCA TT和revd - cgg GAT CCG TGC TTG GGA ATG CTG CC，用KpnI和BamHI连接到GFP下游含有GFP的质粒ART7上，其C端有10XAla连接体。同样，ATM1连接到含有RFP樱桃的ART7 [63在C端有一个10XAla的连接体。利用RT-PCR技术从拟南芥RNA中分离出ATM2 - q -tail结构域，引物为:Fwd-GGGGTA CCA GGA AAA AGG TTC TTC AAG GC和rev - ggg GAT CCC TAG CCT CTT TTT CCC CA。使用引物分别为:Fwd-GGGGTACCCAGA ttggttcttgaagat和Rev-CGGGATCCTTAATACCTAGTA CTCCTCAA，分离出相似的myosin viia克隆。对于myosinvib, Fwd-GGGGTACCGTAATTAGCG TCCTTGAGGAA和Rev-CGGGATCCTCAATAACTTTTCTTGCACCA。按照ATM1的描述，将它们融合为GFP或RFP。

在35S启动子的调控下，将包含荧光嵌合体的整个表达带通过NotI切割转移到二元载体pART27上。编码DsRED-FYVE的质粒由波恩大学的Josef Samaj提供[30.]。编码ARA7和ARA6的GFP融合的质粒由日本理化研究所的Takashi Ueda提供[28]。编码H/KDEL受体GFP融合的质粒ERD2-GFP由英国牛津布鲁克斯大学的Chris Hawes提供[26]。

植物DNA和RNA制备

DNA的制备方法如下:将2 ~ 3片新鲜成熟的叶片在液氮中研磨成细粉，溶解在含有萃取缓冲液(350 mM山梨醇，100 mM Tris PH 7.5, 5 mM EDTA PH 7.5)，细胞核裂解缓冲液(200 mM Tris PH 7.5, 50 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB)和5% n -月桂肌氨酸(N-lauroylsarcosine)的混合物中，比例为1:1:0.4。65℃孵育15分钟后，进行氯仿/异戊醇萃取。DNA在异丙醇中沉淀，在无菌ddH2O中重新悬浮。总RNA的制备方法如下:将2.5 g植物组织在液氮中研磨成细粉，在20 ml(65°C)热CTAB缓冲液(2% PVP, 2% CTAB, 2 M NaCl, 25 mM EDTA PH8, 0.1 M Tris PH8)中培养10 min。然后进行氯仿/异戊醇萃取，在2.5 M LiCl中沉淀RNA。将微球重新溶解于SSTE缓冲液(1 mM EDTA, 10 mM Tris PH8 1 M NaCl, 0.5% SDS)中，并进行额外的氯仿/异戊醇萃取。RNA在乙醇和氢气中沉淀₄将Ac和球团溶解在无菌双蒸馏ddH中₂O. Poly-A RNA采用Qiagen公司的Oligotex试剂盒(编号7002)，按照生产商说明进行分离。RT-PCR采用Invitrogen的SuperScript逆转录酶(Cat No. 18064-022)。

Western blot分析

将250 mg转基因植物幼苗在液氮中磨成细粉。粉末在200 μl的Laemmli蛋白样品缓冲液中保存[64取30 μl的提取液在SDS-PAGE上分离，印迹于硝化纤维素膜上。采用抗GFP抗体(Santa Cruz)和HRP二联抗体(Jacksom ImmunoResearch)检测GFP融合蛋白。化学发光反应使用SuperSignal试剂盒(Pierce)。

荧光显微镜及染色

使用IX81/FV500激光扫描显微镜(Olympus)观察荧光标记的细胞。使用以下滤光片组:用于观察GFP, 488nm激发，BA505-525;RFP, 543 nm激发，BA610;fm4 - 64,488或515 nm激发和BA660。所用物镜为PlanApo 60 × 1.00 WLSM 8/0.17。为了观察苯胺蓝，我们使用405 nm激发和BA430-460，物镜使用UPlanSApo 60 × 1.35油，8/0.17 FN26.5。当同一样品中检测GFP和RFP时，我们使用DM(二色镜)488/543，当添加苯胺蓝时，使用DM 405/488/543/633。在所有情况下，如果要监视一种以上的颜色，则执行顺序采集。FM4-64 (Molecular Probes)染色，终浓度为8 μM，染色5-20分钟。将叶段在0.1%苯胺蓝溶液中孵育40分钟，对胼胝质进行染色₂0和1 M甘氨酸，pH为9.5，体积比为2:3，使用前至少预混合1 d [27]。以终浓度为50 μM的BFA (Sigma)在4 μM的FM4-64存在下作用50 min。

农杆菌渗入n benthamiana叶子

采用农杆菌浸润法表达荧光嵌合体。简要:根癌土壤杆菌用质粒转化菌株GV3101，在28℃下培养48 h。从一个菌落中培养细菌，沉淀并溶解至OD₆₀₀0.5的缓冲液:50 mM MES, pH 5.6, 0.5%葡萄糖，2 mM NaPO₄100 μM乙酰丁香酮(cat。不。D13440-6, Sigma Aldrich)。3周大的叶子n benthamiana用1毫升注射器将细菌培养物浸润植株。24 h后可检测到荧光嵌合体在叶细胞中的表达，48 h时达到峰值。

转基因拟南芥植物

拟南芥植物如前所述被转化[65]。将农杆菌GV3101培养物在1升LB中28℃培养24 h。细菌在5000 rpm下沉淀15 min，溶解至OD₆₀₀在以下缓冲液中:5%蔗糖，10 mM MgCl₂0.044 μM BA(苄胺嘌呤)。加入洗涤剂Silwet L-77 (LHELE SEEDS Texas USA)至终浓度为0.03%。闭合花蕾期的植株在农杆菌溶液中浸泡5分钟，然后用塑料袋覆盖植株，转移到受控的生长条件下。48 h后取袋，1个月后采集种子。种子在1% NaClO中灭菌5分钟，用无菌H洗涤3次₂O.将种子(~5000粒)用MS、相关抗生素和500 μg/ml clforan (Aventis)在10 cm培养皿中接种，以抑制农杆菌的生长。将耐抗生素的幼苗转移到新的培养皿中，在荧光双目下扫描GFP或RFP的表达。

本研究由以色列科学基金会(ISF) 752/05研究基金资助。作者感谢Dieter Volkmann, Frantisek Baluska, Josef Samaj, Takashi Ueda和Chris Hawes的质粒和Amnon Schwartz的明智建议。

从属关系

1. 以色列火山中心植物科学研究所，以色列贝特达甘50250

   Lior Golomb, Mohamad Abu-Abied, edward Belausov和Einat Sadot

相应的作者

对应到Einat Sadot。

作者的贡献

LG进行了克隆、瞬时表达、转基因植株和显微观察，MA进行了克隆和转基因植株，EB进行了显微观察。ES协调研究并撰写稿件。

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