葡萄果实及物候相关性状(葡萄L.):从数量性状位点到基础基因

背景

葡萄成熟起始时间、成熟期长度、果实大小和种子含量是葡萄栽培的目标性状。早熟和晚熟品种的可用性对于在生长季节惊人的收获是可取的，将产量扩大到水果在市场上获得更高价值的时期，并确保植物对气候和地理条件的最佳适应。浆果大小决定葡萄产量;鲜食葡萄市场对无核葡萄的需求尤其大，且与果实大小呈负相关。这些特征是遗传、生理和环境因素改变的复杂发育过程的结果。为了阐明他们的遗传决定论，我们对163个个体进行了定量分析₁两个鲜食葡萄品种杂交获得的分离子代。

结果

分子连锁图覆盖大部分基因组(2n = 38为葡萄)为每个亲本生成。将18对同源类群整合成一幅全长1426 cM的共识图谱，共有341个标记(主要是微卫星标记、AFLP标记和est衍生标记)，位点间平均图谱距离4.2 cM。通过记录开花、变型和成熟日期以及测量浆果大小、种子数和重量来评价三个生长季节的分离性状。采用单标记和区间作图方法进行QTL (Quantitative Trait Loci)分析。除了一个研究性状外，所有性状都确定了qtl，其中许多性状稳定地持续了一年多。不同性状的qtl聚集在一起，表明基因座的连锁或多效性效应，以及影响特定性状的区域。通过对潜在黑比诺基因组序列的生物信息学分析，在基因水平上研究了最有趣的qtl。

结论

我们的结果揭示了有关葡萄特征的遗传控制的新见解。它们为进行标记辅助选择和测试特定基因在性状变异中的作用提供了基础。

对主要物候事件、浆果大小和芳香成分的控制是葡萄栽培者和酿酒师的目标性状。此外，在鲜食葡萄市场，对无籽品种的需求也在不断增加。

与其他作物一样，物候学是葡萄适应生长环境和气候变化的最重要属性[1，2］．这是一个复杂的性状，是开花、变型和果实成熟等多种发育数量性状相互作用的结果。

开花的遗传控制在模式植物中得到了广泛的研究拟南芥［3.，4］．另一方面，像葡萄藤这样的木本物种的研究由于种子生长植物的幼期或未花期长、成树的体积大以及每年开花而变得困难。尽管植物之间有几种开花途径是守恒的，但长昼生植物的花诱导机制可能存在重大差异拟南芥与大多数短日植物和木本多年生植物相比。可能涉及类似的基因，但极有可能它们以不同的方式受到调控，或具有不同的下游效应拟南芥．开花的葡萄与的有很大的不同拟南芥在发育过程中有不同的少年期和成年期;在成年葡萄植株中，这一过程需要2年时间，并由卷须和花序起源处的一种特殊的分生结构(未交原基)介导[5］．环境和内源对葡萄开花的影响不同于外界对葡萄开花的作用拟南芥．在拟南芥在美国，赤霉素(GAs)、长日照和春化会刺激开花。在葡萄中，促进开花的变量是光照强度、高温和GA抑制剂，而春化和长日照没有显著影响。为了预测产量和增加或减少产量，人们对葡萄开花的生理学进行了大量研究，但对其潜在的分子机制却知之甚少。在过去的几年里，一些小道消息拟南芥开花基因已克隆并鉴定:VvMADS1,一个无性生殖的/防碎的同系物(6];VvMADS2而且VvMADS4，与SEPELLATA的基因,VvMADS3，对应于AGAMOUS-LIKE6而且13,VvMADS5，对应于AGAMOUS-LIKE11［7，8];VFL的同系词多叶的［8，9];VAP1而且VFUL-L，分别同源于APETALA1而且FRUITFULL式(8，10];VvTFL1的同系词终端FLOWER1［8，11，12];VvFT而且VvMADS8，分别同源于开花的时间而且constans1过表达抑制因子［12，13];VvMFT的同系词ft和tfl1之母［12］．

葡萄果实发育过程也具有独特的特征。果实成熟是一个高度程序化的过程，依赖于众多基因的协调激活，这些基因主要控制细胞壁组成、糖和水的输入、有机酸代谢和储存、花青素合成以及对生物或非生物胁迫的响应[14，15］．

葡萄藤有两种无核16]:单精子性(科林斯品种)和单精子性(汤普森品种)。单性果实是无核的，因为在授粉的刺激下，子房可以在没有胚珠受精的情况下发育。孤雌葡萄的浆果体积小，只适合生产葡萄干。在窄精品种中，授粉和受精正常进行，但胚胎和/或胚乳在受精后2 ~ 4周流产;结果，种子发育停止(只留下部分形成的种子或种子痕迹)，而子房壁果皮继续生长并产生浆果，这些浆果的大小仍然符合新鲜水果消费的商业要求。对于无核的遗传控制，人们提出了不同的假说[17]，这一显性基因暗示了由一个显性基因调控的三个独立而互补的隐性基因的参与，后来被命名为显性基因SdI（种子发育抑制剂) [18]，抑制种子发育。最近，在有籽和无籽Thompson系之间的差异表达分析中发现了一个编码叶绿体伴侣蛋白21 (ch-Cpn21)的基因，该基因在烟草和番茄果实中的沉默导致种子败育[19］．作者得出结论，ch-Cpn21蛋白对葡萄种子的发育至关重要。

在葡萄中，无核与浆果大小之间存在一种不希望出现的负相关[20.]，因为种子组织为果实发育提供重要的激素[21，22］．然而，调节浆果大小可能涉及其他机制。的单基因消瘦的浆果（flb)突变葡萄L. cv Ugni Blanc在受精后早期破坏了形成果肉的内中果皮中大部分液泡细胞的分化和分裂，导致果实重量减少了10倍[23］．这一缺陷并不仅仅是植物生长调节剂水平的不足，也没有显示出与育性、种子大小或数量有任何明显的关系。

以上所有特征都是在荷尔蒙的严格控制下形成的。有人认为，葡萄开花是由赤霉素:细胞分裂素平衡调节的。赤霉素抑制花序生长，促进卷须发育[24]，而细胞分裂素可导致卷须分生组织产生花序[25］．此外，水果的成熟可能是由一些荷尔蒙因素引发的。尽管葡萄已被归类为非变型水果，但有证据表明，在变异前内源乙烯水平的短暂增加表明，乙烯感知至少对果实直径的增加、浆果酸度的降低和成熟浆果中花青素的积累是必要的。26］．其他植物激素，如生长素和脱落酸，已被提出控制葡萄成熟。葡萄果实的成熟可能是由生长素水平的下降和脱落酸水平的增加共同引起的[27，28］．此外，Symons等人。29]表明它还与内源性油菜素类固醇激素的升高有关。最后，赤霉素可能在无籽过程中起重要作用[17，30.，31]，可能与其他生长物质如生长素有关[32，33]，或乙烯[34］．赤霉素除能延缓成熟外，还能有效促进有籽葡萄的无核，抑制正常无籽葡萄的残留种子发育，增加浆果和籽粒大小，降低籽粒密实度[35，36］．

本研究的目的是研究葡萄开花和果实成熟时间、浆果大小和种子含量的遗传决定性。利用微卫星标记、AFLP标记和est标记建立了一种鲜食葡萄F₁并用于进行定量分析结合表型数据收集超过三年。利用最近发表的黑比诺基因组序列进一步分析了最显著的qtl [37，38］．

标记

用于生成意大利和大贝隆地图的标记的数量和隔离类型见表1．112个微卫星共产生114个标记，其中2例(VVIQ22b和VMC2B5)分离模式与Italia (axab)中存在的一个空等位基因一致，并采用了重新编码。20个MseI/EcoRI组合总共提供了1380个AFLP标记(每个引物组合最少42个，最多106个)。其中275个为多态性，多态性百分比在13 ~ 32之间(平均值为20)。由于JoinMap选择的相位不一致，14个AFLP标记被删除，在最终的映射数据集中总共留下261个位点。SCAR标记SCC8、果色和无核在子代中的分离比例为1:1。经SSCP和小序列分析，获得35个ESTs标记[39］．

基因地图

98个ssr位点、154个aflp位点、23个est基标记和1个SCAR标记(SCC8)被组装成19个连锁群，图谱距离1353 cM，平均间隔4.9 cM;在80个ssr、107个aflp、21个est标记和2个形态标记(颜色和无核、SdI)，分布在19个连锁群上，共覆盖1130 cM，平均间隔长度为5.4 cM(图1和表2)．

另有12个和10个标记分别归因于Italia和Big Perlon连锁群，但没有确定的线性顺序。有些位点无法分配到任何链接组;一种可能的解释是，它们位于目前图谱尚未覆盖的基因组区域。在意大利图谱中，连锁群的平均大小为71 cM，从26 ~ 125 cM不等;大贝隆地图的平均尺寸为60厘米，从11厘米到99厘米不等。对于意大利，每个连锁组的定位标记总数在7 (lg6)到22 (lg7和8)之间，而对于大贝隆，定位标记总数在3 (lg11)到21 (lg14)之间。在11个Italia连锁群和5个Big Perlon连锁群中发现了长度大于20 cM的无标记区(表2)2)．共识图谱由18个连锁群上的341个标记组成(lg11除外)，覆盖面积1426 cM，平均间隔长度4.2 cM。连锁群平均大小为79 cM，范围为40 ~ 126 cM;每个连锁群的定位标记总数在13个(lg6、9、15)和29个(lg19)之间;在8个连锁群中发现了长度大于20cm的无标记区域(图1和表2)．在Moscato bianco和大Perlon杂交的一个群体中分析了意大利×大Perlon后代中单胚性的5个est基标记葡萄属锐利然后映射为synteny(图1)，如文献所述[41］．

果实颜色和无核的主要基因分别作为孟德尔标记定位在lg2和lg18上(图1)，与[42- - - - - -44］．

任何标记类型的明显聚类在亲本图谱中都不明显。通过计算连锁群中AFLP标记数量与连锁群大小之间的Pearson相关系数来分析AFLP标记的分布[45］．相关性显著(Italia在0.01水平，Big Perlon在0.05水平)，说明AFLP标记是随机分布的。卡方分析显示，意大利17.4%的多态标记和Big Perlon 16.9%的多态标记存在畸变分离率(P≤0.05)。这种扭曲程度与已经报道的小道消息的百分比相当(总体上略高)[40，42，43，46- - - - - -51］．

在母系中，畸变等位基因的频率略高:在Italia和Big Perlon中，分别有18.7%和18.5%的标记出现了分离畸变;在双亲中均可分离分离畸变的基因座中，分离1:1.1:1的4个基因座(VMC7A4、VMCNG1E1、VVMD7和VVMD31)仅在Italia中分离畸变，分离1:1.1 .1的2个基因座(VMC1E12和VMCNG1B9)在双亲中分离畸变。正如其他作者已经报道的那样[42，43，47，49- - - - - -51]，大多数畸变标记聚集在一些连锁基团上(在我们的例子中，lgs7、14和18)。有趣的是，Chardonnay × Bianca [49，52]和Ramsey × Riparia Gloire [51]和LG18的秋无籽地图[43］．只有LG7为单向偏倚(所有标记均显示女性等位基因过量)，而lg14和lg18为双向偏倚。

亲本同源体和共识同源体的标记顺序基本一致，表明Italia和Big Perlon之间的重组频率没有太大差异;在几个连锁基团上出现的倒转大多发生在紧密相连的标记之间。扭曲标记和重排之间的简单相关性似乎不存在，因为只有少数小的反转可能是由分离扭曲造成的，而一些连锁群(例如lg7和lg18)有许多扭曲标记而没有重排。

当我们将我们的地图与其他5张有大量ssr的地图进行比较时[40，43，48，50，51]以及第一张葡萄树综合地图[49]时，各链接组之间存在完全一致，标记顺序相似但不一致。在我们的共识地图和[40](84个共享ssr)，用于链接组2,4,8,18和19，[43](64个共享ssr)，用于链接组8、10和19，[48](81个共享ssr)，用于3、4、5、6、7、12和18链接组，[50](85个共享ssr)为3,8,18链接组，最后[51](55个共享ssr)，用于连接组7、10、18和19。这些不一致反映了地图所基于的小种群规模所固有的局限性(从96到188种植物，分别在[40]和[51])和用于进行连锁分析的统计方法。我们的地图与[]中报道的合成地图共享109个微卫星。49]并显示了3、4、6、9、10、13、18和19组的标记顺序差异。在大多数情况下，它们是在[LOD 2.0局部顺序不确定的位点组被映射的区域中的小反转。49］．

亲代减数分裂重组率的比较

在常见标记之间以71个间隔比较亲本重组率，覆盖19个连锁组中的12个。重组在意大利略高(0.1978 vs 0.1944)，尽管基于Z检验(1.9600)在0.05水平上没有统计学意义。这一观察结果与迄今为止关于性别对葡萄重组率影响的报道一致[42，46，48，51，53］．比较亲本重组率的71对连锁标记中，有12对差异有统计学意义(P≤0.05)。

5对(VVIP04-VMC2F12、VMC2F12-VMC7H2、VMC2F12-VVS4(组8)、VMC8G6-VMC2H4(组12)、VMC6C10-VVIS70(组14))母本重组水平较高，7对(组3)父本重组水平较高(VMC8F10-VVIN54、VMC8F10-VVMD36、VMC2E7-VVIN54、VMC2E7-VVMD36、VMC2H4-VMC4F3.1、VMC6C10-VMCNG1E1、VMCNG1E1-VMC1E12)。在扭曲标记数最多的三个连锁组(lgs7、14和18)中，只有LG14在亲本重组率上表现出统计学上的显著差异，这似乎表明在某些情况下重组率的差异可能是导致分离扭曲的原因。

综上所述，相对于Big Perlon, Italia图谱的长度更大可能是由于标记的数量更多，而不是亲本之间重组率的差异。

基因组长度

基因组长度估计在父系和母系数据集之间存在差异(表2)3.)．与排除所有aflp (1908 cM)相比，考虑所有映射标记(1693 cM)时，它们的平均值更小，与[42］．然而，像在[42]，排除aflp后，置信区间更大。所有标记的平均观察基因组覆盖率为73.2%，而预期覆盖率为92.6%，根据[54]及89.6%，根据[55]，而在没有aflp的情况下，观察到的平均基因组覆盖率为42.7%，而根据[54和75.6%，根据[55］．

Italia (1791 cM)和Big Perlon (1595 cM)的估计基因组大小略大于[43，51]，与[40，42，44]，比[48］．最后一个差异可能是由于最大标记间隙的大小，因为基于Hulbert方程的基因组大小估计随着更高的最大观测图距离(X)而膨胀。[48]报告的标记之间的最大距离为49.0和44.7 cM，而意大利和大Perlon地图的X值分别为20.6和19.4。观察到的意大利和大贝隆图谱的基因组覆盖率是葡萄中最高的。

表型数据

表型数据分布，如图所示22003年，这3年非常相似。数量性状呈连续变异，所有性状均有海侵分离现象。Kolmogorov-Smirnov检验表明，开花开始、开花结束、花期、变型开始、变型结束、变型成熟间隔和种子干物质百分比均偏离正常(至少2年P < 0.05)。

方差分析和Kruskal-Wallis检验表明，除开花与改型开始的时间间隔外，其他性状均存在极显著的年份效应(P < 0.01)。除开花期外(数据未显示)，其余性状年级间的Spearman秩序相关性均极显著(均在0.01水平)。开花结束日期相关性最低(r为0.315 ~ 0.489)，变异开始日期相关性最高(r为0.838 ~ 0.908)。通过Spearman秩序相关检验，发现各性状间存在若干年内相关。其中许多涉及相同性质的组成变量;然而，不同性状之间的相关性也被检测到(表4):变种时间(VB、VE、VT、F-V)与种子重量(% SDM、MSFW、MSDW)呈正相关;版本长度(VP、V-R)与平均种子数(MSN)呈正相关;平均浆果重量(MBW)与种子重量(% SDM、MSFW、MSDW)呈正相关;平均种子数(MSN)与种子干物质(% SDM)呈负相关，平均种子数(MSN)与种子鲜重(MSFW)呈正相关。

仅在一年(在大多数情况下是2004年)观察到的相关性以及不同年份(在版本时间中发现的)不一致的相关性被认为是不可靠的。

QTL分析

QTL分析分别在亲本图和共识图上进行了三年(表5)．

物候学

成熟相关qtl先前由[44]在第7、17及18号lggs上，并由[53]在lg7和lg8上。在本试验中，物候亚性状受3个主要区域控制，分别分布在lg2、lg6和lg16上。

在LG2上，我们在3个图谱和年份中重复确定了开花时间(解释总方差的7.3-16.4%)、变种时间(解释总方差的5.8-12.6%)、变种周期(解释总方差的15.8-44.2%)、开花-变种间隔(解释总方差的12.6-21.4%)和变种-成熟间隔(解释总方差的14.6-21.7%)的qtl。开花-改型区间的QTL 1-LOD置信区间与改型时间的QTL置信区间部分重叠，而改型-成熟区间的QTL 1-LOD置信区间与开花时间(2003年和2004年)和改型时间(2002年)的QTL部分重叠。这些结果反映了开花-改型间隔与改型时间之间的正相关关系，而改型-成熟间隔与开花/改型时间之间的关系不太明显4)．开花时间、变型时间和变型周期的qtl的1-LOD置信区间严格相邻而不重叠，表明存在明显的qtl。

在3份图谱的LG6上，我们检测到开花时间(占总方差的13.4 ~ 20.8%，3年)、变异时间(占总方差的9.0 ~ 9.9%，2年)、成熟日期(占总方差的10.2 ~ 17.2%，2年)、开花-变异间隔(占总方差的8.2 ~ 8.5%，2年)和开花-成熟间隔(占总方差的9.1 ~ 15.3%，2年)的qtl。同样，花期、变型时间和成熟日期的QTL置信区间相邻但不重叠，似乎表明存在不同的QTL，而基于这些性状之间的相关性观察，花-变型间隔的QTL与变型时间的QTL重合，花-成熟间隔的QTL与成熟日期的QTL共定位也不足为奇。

结果表明，LG16只参与了版本控制，在三份图谱和年份中存在两个一致性qtl，分别为版本时间(占总方差的21.1 ~ 45.4%)和开花-版本间隔(占总方差的15.4 ~ 37.2%)。

最后，在3份图谱中，在LG1上发现了2个花期QTL，分别解释了总表型方差的6.2 ~ 13.9%和6.3 ~ 11.7%;在3份图谱中，在LG12上发现了1个改型-成熟间隔QTL，解释了2年表型方差的9.0 ~ 16.8%。

花期未发现QTL。

浆果大小和种子含量

浆果大小和种子含量的QTL检测之前由[42- - - - - -44]和[53］．我们的结果证实了LG18上存在一个主要效应QTL，这个QTL已经被[42[浆果质量bw，种子数sn，种子总鲜重stfw，种子总干重stdw，种子平均鲜重smfw，种子平均干重smdw，种子干物质- sdm]， [43](浆果重bw18a、种子鲜重sfw18a及种子号sn18)及[44](浆果重量w25为平均浆果大小- mbs，种子数和种子痕迹- s&r，完全发育的种子数- sed，种子或种子痕迹总鲜重- tfw)。在父本图和一致性图中发现了相同的区域，并解释了平均浆果重量(27.2-43.1%)、种子干物质百分比(86.5-91.4%，仅在大贝隆)、平均种子鲜重(13.8-27.5%)和平均种子干重(49.3-75.0%)的很大比例表型方差。不出所料，它与无籽基因相吻合SdI．浆果大小和种子含量的qtl共同定位于LG18，已经通过[42，43]和[44］．与[42]和[43]，我们没有发现任何证据表明LG18上存在两个不同的qtl。除了这个QTL，我们在3年内在父系和共识图谱的lgs1上检测到两个平均浆果重量的显著区域(占总方差的4.6-17.5%)和12个(占总方差的5.1-11.8%)，而其他作者在大多数情况下在1或2年内在lgs1上发现了额外的QTL [44]， 5 [53]， 11 [42]， 13 [53]， 14 [44]， 15 [43，44］．我们在LG1上的QTL与[报道的QTL不一致44]在同一个LG上。

在种子数方面，两年内在3张图的LG2上发现1个QTL，解释了19.6 ~ 22.9%的总表型方差。先前的工作报道，除了LG18上的主要QTL外，LGs上也有该性状的QTL 4 [43]， 8 [42]， 14 [43，44]、15及16 [44]，在不超过两个季节就能检测到。

对于平均种子鲜重，除LG18上的主要QTL外，我们还在lg6(占总方差的3.5 ~ 21.4%)、LG10(占总方差的7.7 ~ 36.3%)、LG13(占总方差的7.2 ~ 15.7%)和LG15(占总方差的6.7 ~ 13.0%)上鉴定了QTL。其他作者在LGs 1,3,10,14上发现了该性状的qtl [43]、15及16 [44］．有趣的是，我们在LG10上的平均种子鲜重QTL与在Dominga × Autumn无籽图的LG10上检测到的同一性状的QTL共定位[43]， LG15种子平均鲜重和干重的QTL可能与[在同一LG上鉴定的QTL一致。44]表示发育完全的种子数目和种子的总鲜重或种子痕迹。

在平均种子干重方面，除了LG18上的主要QTL外，我们还发现了两个额外的QTL:第一个在LG2上与平均花期/变熟间隔/平均种子数的QTL共定位，解释了总表型方差的3.7 ~ 10.8%，第二个在LG15上与平均种子鲜重的QTL共定位，解释了总表型方差的3.1 ~ 10.8%。

在这项工作中，我们开发了覆盖大部分基因组的遗传图谱葡萄两个鲜食葡萄品种的杂交。这些图谱用于成熟时间、浆果大小和种子含量的QTL检测。

QTL分析可靠性

在进行区间映射时，我们验证了qtl在多个生长季节的LOD值高于连锁群阈值。在多区间映射中使用辅助因子可以相对于简单区间映射找到更多的qtl。这在无籽相关性状中尤其明显，其中大部分表型变异是由LG18上的主要QTL解释的。尽管MQM预计会更强大，但我们也使用了非参数Kruskal-Wallis方法，以确认区间映射检测到的qtl不是由于大间隙、分离扭曲或性状的非正态分布而造成的人工效应。

正如已报道的[42，43]和[44]，果实大小和种子含量的qtl共定位于LG18。其他性状的qtl也发现了共定位。在大多数情况下，它反映了观察到的同一性状的子组分之间的相关性(即LG2上的FT和V-R, VT和F-V;LG6的VT、F-V、R、F-R;LG15上的MSFW和MSDW;LG16的VT和F-V;% SDM, MSFW和LG18上的MSDW)。然而，我们也注意到不同性状的qtl共定位，即在LG2上对花期、平均种子数和平均种子干重进行定位，在LG18上对平均浆果重和平均种子重进行定位。基于已知的种子产生的赤霉素与浆果生长之间的关系，已经有人提出，在表型和遗传水平上观察到的浆果重量和无核亚性状之间的相关性可能是由于多效性而不是紧密的连锁关系。有趣的是，两个qtl(在LG1和我们的子代中的12个)已被证明可以调节浆果重量而不影响无核，正如其他作者在LG1上已经报道的那样[44]， lg11 [42]及LG15 [43］．这些qtl，以及在lg2、6、10、13和15上鉴定到的种子含量特异性qtl，可能允许在育种计划中分离浆果大小和无籽之间的不利相关性。同样，我们在LG2的遗传水平上观察到的开花时间和无核性状之间的相关性可能是由于已知的赤霉素对开花的影响。相反，在LG18上观察到的变异时间与无核性状之间的表型相关性在分子水平上并没有得到[44］．这可能表明控制这两个性状的基因是相互独立的，但还需要进一步的证实。

1)在其他分离群体中发现的类似结果(即LG18的浆果重量和无籽亚性状的QTL [42- - - - - -44]和lg10籽粒平均鲜重的qtl [43]及LG15 [44])， 2) Kruskal-Wallis分析，揭示了单标记基因型与原始表型数据之间的显著相关性，3)尽管存在较大的年份效应，但3年QTL稳定性。在某些情况下，仅在一年内检测到较小的qtl。这可能是由于年份效应和/或基因型×年份相互作用，或者由于中等群体规模与至少一个主要QTL的组合导致大部分表型方差，因此检测能力有限。

标记辅助选择

在Kruskal-Wallis分析中，部分SSR标记与qtl共定位，并与相应性状显著相关(表5VMC1E11(改版时间、开花-改版间隔)、VMC7F2(平均浆果和种子重)、VMC7G3(改版时间)和VVIB23(开花时间、改版-成熟间隔和平均种子数)。它们在标记辅助选择中的有用性值得检验，正如已经由[43]和[44]用于标记VMC7F2和VMC7G3。

候选基因法

QTL分析显示了基因组中导致性状变异的区域。接下来的步骤是缩小这些区域的范围，使这些影响可以归因于特定的基因。为此，我们采用了候选基因方法[56]在两个层面上。

首先，根据其假设的生物学功能选择了一些“功能候选基因”，并绘制了它们的图谱[见[39]以获取映射的详细信息。它们编码影响开花时间和种子发育的转录因子(EMF、FIE、FIS、GAI)或参与赤霉素生物合成的酶[57]，已知它们可以抑制葡萄花分生组织的产生，促进无核和增加浆果的大小。EMF(胚胎开花)蛋白的作用是防止植物发芽后立即开花[58］．FIE(受精不依赖胚乳)蛋白的功能是抑制胚乳发育直到受精发生[59］．FIS(受精独立种子)基因的产物可能在受精后的种子发育中发挥重要的调节作用[60］．最后，GAI (GA不敏感)蛋白负调控GA反应[61］．关联分析揭示了玉米之间的关系时至今日同系物(Dwarf8)多态性及开花时间[62］．

葡萄藤同源物(VvGAI1)对花朵发育也有影响[24］．我们能够将对应的标记本地化到地图上5，时至今日，赤霉素20-oxidase而且赤霉素2-oxidase．EMF，金融中间人其余参与赤霉素生物合成的基因由于公共数据库中缺乏同源葡萄序列或扩增失败而无法定位。对应的标记5而且赤霉素2-oxidase没有与任何QTL共定位，而时至今日，由Moscato bianco ×的synteny映射葡萄属锐利为了建立其与LG1开花时间qtl的关系，需要更精确地定义其子代。最后，标记对应赤霉素20-oxidaseKruskal-Wallis分析表明，该基因与上述性状无显著相关性，但与变异时间和开花-变异间隔的qtl共定位。

其次，我们使用了公开的黑比诺基因组序列[38]以识别qtl基础SSR标记附近的“位置候选基因”(附加文件1)．该方法适用于除VVIN31外的所有微卫星(与开花时间相关)，因为contig组装不一致。基因预测是基于葡萄(如表中所示)和拟南芥已知的拼接位置。当提及小基因时，观察到小基因数量较多的一般趋势拟南芥但在大多数情况下，结果是一致的。下面我们将讨论最有趣的发现。

QTL分析表明，微卫星VVIB23与开花时间、开花-改型间隔、平均种子数和平均种子干重存在相关性。该标记位于一个yabby样转录因子预测基因AM440415.1中。的主要功能淡水螯虾基因家族成员在顶端和花分生组织产生的侧器官中决定细胞的命运[63］．此外，它们已被证明通过促进细胞分裂在生长中发挥作用[64]以及通过控制花的分生组织和器官的特性来控制花的形成和发育[65- - - - - -67］．最后，基于它们的转录组学分析消瘦的浆果（flb)突变体，[68归因于VvYAB2葡萄果实早期形态发生的研究。他们观察到该基因在开花前表达量低且无差异，开花后表达量大幅增加，并在果实中达到最大值。

变异-成熟间隔QTL基础上的微卫星VMC2H4位于一个保守假设蛋白基因内的contig AM486664.1上，更有趣的是，它位于一个基因(grip31)编码一个假定的成熟相关葡萄蛋白质[戴维斯和罗宾逊，未发表]。VMC2H4与该基因的位置不重合，可以解释其在Kruskal-Wallis分析中的中等意义。

最终在距离无核基因0.8 cM处定位到微卫星VMC7F2SdI．结果表明，该基因与平均浆果重、种子干物质百分比、平均种子鲜重和平均种子干重相关，位于AM464881.2 contig上，与预测基因非常接近葡萄MADS-box蛋白5。众所周知，MADS-box家族成员在花和果的发育中起着关键作用。老板等人[7]分析了该基因和其他三种MADS-box基因在葡萄花序和浆果发育过程中的表达模式。根据其雌花心皮的特异性表达及其与已知功能基因的同源性，他们建议为VvMADS5在胚珠和种子发育中的作用。

至于在附加文件中报告的其余微型卫星1VMC1E11(变异时间和开花变异时间间隔的qtl)位于一个编码推测蛋白激酶的基因中，VMC5G7(开花变异时间间隔的qtl)位于一个编码热休克因子的预测基因中，而VMC2C10.1、VMC4G6和VMC4H5不能与任何已知功能的蛋白质相关。我们期待即将到来的葡萄基因组注释将有助于填补这一信息的不足。

在这项工作中，我们确定了一个表葡萄杂交浆果和物候相关性状的遗传决定因素。在lg2、6、16上发现了3个主要的qtl控制了几个成熟时间亚性状，而在lg1和12上发现了2个额外的区域仅影响特定的物候性状。在LG18上检测到一个主要的QTL，在lg1、12上检测到一个主要的QTL，在lg1、12上检测到一个主要的QTL，在lg1、12上检测到一个主要的QTL，在lg2、6、10、13、15上检测到一个主要的QTL。与主要观察到的qtl密切相关的分子标记的鉴定是设计标记辅助的鲜食葡萄改良程序的第一步，并鼓励测试一些位置候选基因在性状变异中的作用。

植物材料

本研究中使用的映射群体(163个个体)是F₁1995年由意大利(Bicane × Muscat of Hamburg)和大Perlon (Almeria × Cardinal) × Perlon)的食用葡萄品种杂交获得的后代。自1999年以来，它们一直在巴里大学(意大利)实验站的田间种植。这个种群根据几个重要的农业性状(物候、产量、浆果大小、种子含量和麝香香气)进行分离。

DNA提取

用CTAB法提取幼叶和茎尖的基因组DNA， [46］．

分子标记开发与分析

对112个SSRs进行了基因分型，仅部分发表[69- - - - - -78］．其中许多是在AgroGene S. a (Moissy Cramayel，法国)协调的葡萄微卫星联盟(VMC)内开发的。在分析的位点中，有72个位点属于一组共有的86个高度多态且分布良好的ssr，与13个鲜食葡萄品种的同源连锁群相匹配[79］．根据现有的多态性和地图位置信息选择额外的微卫星标记，以填补空白并加入连锁群。PCR扩增在12.5 μl反应中进行，该反应由20ng模板DNA、每个引物0.5 μM、每个dNTP 25 μM、1.25 μl 10× PCR缓冲液、0.5单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)和1.5或2 mM MgCl组成₂解决方案。扩增方案:94℃，7 min;35个周期，94℃45秒，56℃45秒，72℃1分30秒;72°C 7分钟。在不同退火温度下进一步测试56℃下扩增失败的引物。扩增产物在变性7.5%聚丙烯酰胺测序凝胶(7.5 M尿素，0.5× TBE缓冲液)上分离，在60 W下运行2-3小时，用商业试剂盒(Promega, Madison，威斯康星州)银染色显示。(美国)或在ABI PRISM 3100遗传分析仪(应用生物系统)中进行毛细管电泳。

AFLP标记在[80］．引物标记用[γ-³³ATP。在定位人群中使用20个引物组合进行选择性扩增分析。PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶(7.5 M尿素，0.5× TBE缓冲液)在80 W恒功率下分离2 h 40'。

est衍生标记是在基于预测功能和基因本体选择一些基因，并通过SSCP分析或微测序揭示分子多态性后开发的，如[39］．

对子代进行SCAR标记SCC8的基因分型，[18]以协助无籽品种的选择。

浆果色及无核(SdI)进行评分并映射为定性字符。黑色、蓝色、紫色或红色记为有色素，黄色或绿色记为无色素，详见[42］．没有粉红色的浆果。种子及种子痕迹按[17];第4类(正常发育的种子，珠被完全硬化)对应有种子，第1-3类(只有种子痕迹，珠被未硬化或部分硬化)对应无种子。完全无籽个体不存在。

地图建设

缺失数据超过10%的基因型不考虑进行连锁分析。采用JoinMap 3.0进行连锁分析[81］．JoinMap不能直接处理的唯一分离(abxa0和0xab，其中0表示空等位基因)包含在重复的形式中，如[42］．它们被视为两个独立的基因座，一个只在单带亲本中分离，另一个只在双带亲本中分离。用χ检验每个标记的分离度与期望分离度的拟合优度²测试。我们决定保留扭曲的标记，除非它们的质量很低，或者它们严重影响了周围的秩序。LOD阈值为5.0，重组率阈值为0.45;Kosambi映射函数[82]用于地图距离的估计。当进行三轮作图时，选择第二轮作图，除了少数情况下，第三轮作图中标记的顺序已被文献报道的其他作图实验确认。利用共显性标记和双杂合子显性标记将亲本图谱的同源对整合成一致图谱。女性、男性和共识地图使用MapChart软件对齐[83］．

男性和女性重组率的比较

为了比较Italia和Big Perlon之间的重组率，基于58个常见标记构建了新的亲本图。对于这些标记，准备了两组数据集:其中一组母本编码为纯合子，父本编码为杂合子，另一组数据集编码相反，如[48]和[51］．标记顺序是根据原来的父母地图固定的。共考虑71对连锁标记。JoinMap为双亲的每个标记对提供了重组和LOD评分的两个点估计值。在Excel中计算每个父项的平均重组频率及其误差值。使用两个种群均值比较的Z检验进行了全基因组测试，以检测平均母系和父系重组率的差异。采用JoinMap中的“异质性检验”函数进行识别，根据χ²测试，一对共同标记显示两个亲本之间的重组频率有显著差异。

基因组长度和图谱覆盖范围

利用矩量估计法对基因组长度进行估计_e= n (n -1) x / k [84]，其中N为标记物的数量，X为标记物对之间在阈值LOD以上的最大观测映射距离Z，本研究中为5 [85]， K为LOD值大于或等于z的位点对数目。置信区间由[计算86从方程I_α(G_e) = g_e(1±n)_αK^1/2）^－1，其中n_α= 1.96 α为5%。基因组图谱覆盖率的两种估计(C_e)的计算结果:由方程C_e= 1 - p_{1, N}和P_{1, N}= 2r /(n +1) [(1- x / 2g)]^{N + 1}- (1 - x / G)^{N + 1}] + [(1-RX / G) (1 - x / G)^N［54]，其中R为单倍体染色体数，N为标记数，X为Z = 5时的最大centiMorgan距离，由式C ._e=单电子^{通用电气xn / 1.25}［55］．最后，观察到的基因组图谱覆盖率是观察到的和估计的基因组长度之间的比率。在所有情况下都使用Kosambi地图距离。上述计算首先使用所有映射位点进行，然后排除所有aflp。

成熟时间、浆果重量和种子含量的表型评价

在3个生长季节对分离性状进行评价。

通过对开花(FB、FE)、变型(VB、VE)开始、结束日期、成熟(R)日期等组成性状进行评分，分析成熟时间。根据浆果颜色和稠度的变化建立了版本，当糖份含量约为16°Brix时达到成熟。为了尽量减少同一丛不同浆果之间以及不同丛浆果之间的巨大变异性，对每丛随机采集的3个浆果和每个基因型2-3个代表性浆果的糖含量值进行平均。由此计算出开花时间(FT = 50%开花期)、开花期(FP = 50%开花期到全部开花期之间的时间)、变形期(VT = 50%浆果变形期之间的时间)、变形期(VP =第一个浆果变形期到全部浆果变形期之间的时间)、开花-变形期(F-V)、开花-成熟(F-R)和变形-成熟(V-R)间隔。

对于每个基因型，从2-3个具有代表性的簇中随机选取100个浆果，并加权(浆果重量，BW);计算平均浆果重量(MBW)。提取混合物中25个浆果的所有种子和种子痕迹，计数(种子数，SN)，称重(种子总鲜重，TSFW)， 80℃干燥48小时，再次称重(种子总干重，TSDW)。由此计算出平均每浆果种子数(MSN)、种子干物质百分比(% SDM = TSDW/TSFW*100)、平均种子鲜重(MSFW = TSFW/SN)和平均种子干重(MSDW = TSDW/SN)。

采用Kolmogorov-Smirnov检验评价各性状分布的正态性。采用方差分析和Kruskal-Wallis检验检验年份效应。利用非参数斯皮尔曼相关系数测定各性状间年间和年内的表型相关性。采用SPSS 11.0进行统计分析。

QTL分析

采用MapQTL 4.0软件对每个亲本图谱进行QTL检测[87]和3个不同年份的数据。它基于两种不同的方法:非参数Kruskal-Wallis (KW)秩和检验和区间映射[88］．通过1000个排列，为每个连锁群建立0.95和0.80显著性的LOD阈值[89］．首先进行简单区间映射(SIM)分析，寻找潜在的QTL效应区域，然后将这些区域的评分标记作为多个QTL模型的辅助因子(MQM分析)。当通过这种方法发现一个新的QTL时，添加与该QTL相关的标记作为辅因子，并重复搜索，直到没有检测到新的QTL。QTL位置由最大LOD值的位置和1-LOD支持区间估计。

利用主要qtl的SSR标记的完整序列，通过比对(BLASTN)鉴定了黑皮诺无性系ENTAV115的周围基因组序列[38］．在每种情况下，contig都是根据以下标准选择的:e-value < e^-20年，排列序列长度> 100个核苷酸，同源性> 90%。利用MEGA3软件对SSR和contig核苷酸序列进行比对[90］．利用FGENESH软件[91］．在NCBI非冗余蛋白数据库中查找编码区域的蛋白同源性[92]用BLASTP。蛋白质亚细胞定位采用Predotar 1.03软件预测[93]及signalp3.0 [94］．

%长效磺胺:

种子干物质百分比

妊娠:

扩增片段长度多态性

cM:

厘摩

呃:

内质网

美国东部时间:

表达序列标签

F-R:

flowering-ripening间隔

英国《金融时报》:

开花的时间

F-V:

flowering-veraison间隔

遗传算法:

赤霉酸

格林:

连锁群

LOD:

概率对数

MBW:

平均浆果重量

统一民族运动党:

多QTL映射

MSDW:

平均种子干重

MSFW:

平均种子鲜重

MSN:

平均种子数

nt:

核苷酸

QTL:

数量性状位点

接待员:

成熟日期

疤痕:

序列特征放大区

SSCP:

单链构象多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

副总裁:

veraison时期

基本条件:

veraison-ripening间隔

VT:

veraison时间。

本研究由欧洲共同体在MASTER(标记辅助选择表葡萄)项目框架下支持，合同号为CA4-CT。作者要感谢Ramzi Chaabanne (DIBCA, Bari大学)和Francesco Emanuelli (IASMA研究中心)分别在微卫星和候选基因定位方面的贡献。

从属关系

1. IASMA研究中心遗传和分子生物学部门，Via E. Mach 1，圣米歇尔奥阿迪杰，(TN)， 38010，意大利

   劳拉·科斯坦蒂尼，尤丽·巴蒂拉娜和玛丽亚·斯特拉·格兰多

2. DIBCA，巴里大学，Via Amendola 165/A, Bari, 70100，意大利

   Flutura Lamaj & Girolamo Fanizza

相应的作者

对应到劳拉Costantini．

作者的贡献

LC进行了微卫星作图、统计和生物信息学分析，参与了表型评价并撰写了手稿。JB开发候选基因标记，参与表型评价。FL进行AFLP分析并参与表型评价。GF进行了交叉研究并协调了实地研究。MSG构思并协调了这项研究，并对手稿进行了修改。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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