小麦的代谢途径(小麦)蛋白质组学显示胚乳淀粉体

背景

根据定义，淀粉体是专门生产淀粉的质体。然而，从小麦中分离的淀粉体的蛋白质组学研究(小麦开花后10天的胚乳(DPA)检测出多种代谢和生物合成途径的酶。为了更好地理解淀粉体在食品生产中的作用，对该研究的数据进行了详细评估，并概述了淀粉体代谢图。

结果

对淀粉体制剂中检测到的288种蛋白质进行分析，预测其中178种是淀粉体蛋白质。标准包括与已知质体蛋白的同源性，预测小麦基因产物的质体转运肽或接近同源物，已知途径的质体位置，以及预测同一途径其他成员的质体位置。其中135种酶被分为18个途径，用于碳水化合物、脂类、氨基酸、核酸和其他对谷物灌浆至关重要的生物合成过程。本文还讨论了其他蛋白质的功能。

结论

本文概述的途径表明淀粉体在胚乳代谢中起着核心作用。遗传和环境对淀粉和蛋白质生产的相互作用可能部分由该细胞器内的调节机制介导。

麦粒是人类食物的主要来源。面包小麦理想的灌浆性状包括高淀粉产量和高蛋白质含量。然而，在产量和蛋白质含量之间存在一种不受欢迎的平衡，这是由遗传和环境决定的[1- - - - - -5］．更好地理解淀粉体在胚乳代谢中的作用可能有助于理解和改善这种权衡[6］．

谷物中淀粉和蛋白质积累调控的某些方面已经了解。在灌浆期之前，通过遗传、施肥和供水增加分蘖、穗和粒的数量来提高产量。灌浆期间，产量主要由淀粉积累决定。淀粉的积累似乎主要受库的限制，而蛋白质的积累则受来源的限制[7- - - - - -9］．调控蔗糖对籽粒淀粉积累的影响不大₂固定显然足以维持良好的灌浆率。相反，氮的供应对蛋白质的积累有很大的影响，籽粒在氮的量和积累的蛋白质的量和类型上是灵活的[9- - - - - -11］．提高粮食产量的育种倾向于增加淀粉而不是蛋白质，导致面粉的蛋白质百分比较低，高产品种的最大籽粒蛋白质含量似乎有限制[3.- - - - - -5，12]尽管也有例外[7］．当小麦在凉爽、水分充足的条件下生长时，通过在开花后补充氮，可以获得高产和高蛋白浓度[10，13，14］．但施氮改变了籽粒氨基酸含量，蛋白质浓度与必需氨基酸如赖氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的浓度呈负相关[12］．

在干旱和/或高温条件下，籽粒产量和蛋白质含量之间也存在一种权衡关系，在干旱和/或高温条件下，淀粉的积累比蛋白质更少[10，15］．这部分是因为高温会降低转录水平和淀粉合酶的活性[15，16］．据报道，在高温条件下生产的高蛋白面粉中富含谷氨酰胺和脯氨酸的蛋白质比例增加，而富含半胱氨酸和蛋氨酸的蛋白质比例减少[11］．了解调节淀粉和蛋白质合成平衡的分子机制，有助于解开淀粉和蛋白质合成之间的反向关系，以及理想的氨基酸组成与高蛋白质含量之间的反向关系。

灌浆依赖于从叶和茎中输入糖和氨基酸。营养物质从韧皮部排泄到胚乳腔中，并被折痕区域的胚乳细胞吸收。17］．谷物的碳水化合物主要以蔗糖的形式供应[18］．氨基酸供应主要有谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸[19，20.]而硫则以硫酸盐、谷胱甘肽及s -甲硫氨酸的形式进口[21- - - - - -23］．在胚乳内，这些分子被转化为细胞发育所需的其他糖、复杂碳水化合物、氨基酸、核酸、酶和结构蛋白、脂质和膜，以及丰富的淀粉和储存蛋白质，这些蛋白质将在胚胎萌发时支持胚胎。在胚乳中合成的分子也被运送到正在生长的胚胎的胚乳中[24，25］．

合成氨基酸、类异戊二烯、脂类和其他产物的许多代谢途径都位于质体内[26，27]，所以这些基本分子在淀粉体内合成是合乎逻辑的。在10 ~ 12 DPA时，淀粉体为大型无定形细胞器。内外包膜包围着一个广泛的基质，淀粉颗粒在基质中逐渐增大[28，29］．蛋白质组学研究提供了在这些淀粉体中高度富集的部分中发现的蛋白质列表，但没有明确区分真正的淀粉体蛋白质和来自细胞质和其他细胞器的污染物[6，30.，31］．然而，其中两项研究[6，31]表明淀粉体除了产生淀粉外，还参与许多代谢功能。本文减少了[中假定的淀粉体蛋白的数量。6从检测到的90%到62%，然后将它们组织成拟议的代谢和生物合成途径。酶被排列成地图，在一个视图中包括酶和化合物的名称。本文总结了每种途径的证据及其在籽粒发育中的作用。提供原始MS/MS数据的链接。该分析将有助于最终以AraCyc[]的方式绘制小麦代谢酶的在线图谱。32]或RiceCyc [33］．与AraCyc或RiceCyc不同，它从单个细胞器的角度总结了途径证据。

淀粉体制备中蛋白质的分类

淀粉体部分中检测到的288种蛋白质分析[6表明177个起源于淀粉体(62%)(表1，2，3.，4)．另请参阅附加文件1．另外3个功能未知的蛋白质同样可能来自质体或线粒体，10个功能或位置未知。经鉴定，剩下的蛋白质很可能不是淀粉体蛋白质。附加文件中的表格1给出了最适合串联质谱/质谱数据的每个蛋白质的胰蛋白酶肽序列。288种蛋白质中，只有33种与NCBI非冗余数据库中的蛋白质最匹配[34]，而255是来自小麦EST数据库的contigs [35- - - - - -37］．虽然这表明小麦序列在当前EST数据库中的覆盖率很高，但使用这些序列来预测质体转运肽是有问题的。许多小麦contigs是局部的，由多个品种的ESTs组成，缺乏n端蛋白序列的编码区，或存在其他潜在的问题。如Altenbach等人对omega -麦胶蛋白和脂质转移蛋白的研究所示，需要大量的分析来组装最适合单个蛋白质的可靠contig。[38，39］．因此，我们决定将预测的肽用于BLAST [40]在NCBI非冗余数据库中寻找最密切相关的同源物，从而可以推导出完整的蛋白质序列。对于180种可能的淀粉体蛋白，非冗余数据库中21%最接近的同源蛋白是小麦的预测产物(小麦)基因或小麦cDNA克隆，68%为水稻的预测产物(栽培稻)基因。利用Target P预测细胞器转运肽对这些进行分析[41］．这项分析并没有证明实际的小麦蛋白质是否有转运肽，但表明了已知的最接近的同源物是否有。

预测的淀粉体蛋白按功能分组，112种酶被安排到拟议的代谢和生物合成途径的图谱中。蛋白质数量参见表格1，2，3.，4和图1．详细信息在附加文件2，图2-17。另请参阅附加文件3.．

在之前的研究中[42用氯化钾萃取法从贮藏蛋白中分离出盐溶性胚乳蛋白，用甲醇和乙酸铵沉淀法从主要白蛋白贮藏蛋白中分离出盐溶性胚乳蛋白。与氯化钾提取物中的蛋白质相比，淀粉体蛋白的丰度似乎较低，而氯化钾提取物可能富含丰富的细胞质酶[6］．为了与其他研究进行比较，那些被确定为硫氧还蛋白靶标的研究[31]或在氯化钾提取物中发现[42]表示(参见附加文件1，2，3.)．

碳水化合物代谢(蛋白质# 1-32)

虽然已知淀粉体主要用于生产淀粉，但这组32种酶只代表了检测到的淀粉体蛋白质的18%(表2)1)．蔗糖经蔗糖合酶在细胞质中转化为果糖和udp -葡萄糖，然后转化为葡萄糖1-P和葡萄糖6-P，再被吸收到质体中[17，26，43，44］．质体还以磷酸三糖、葡萄糖、磷酸戊糖、其他磷酸己糖和adp -葡萄糖的形式吸收碳水化合物前体[27］．葡萄糖-6- p和adp -葡萄糖是小麦淀粉体碳水化合物的主要来源，然而，与其他类型的质体相比，谷物淀粉体对磷酸三糖的吸收不那么重要[27，44］．除淀粉生物合成所需的酶外，检测到大部分糖代谢、糖酵解和磷酸戊糖途径的酶以及2种1-C代谢的酶。

葡萄糖代谢(蛋白质1-2)

蛋白质#1和#2是葡萄糖代谢所必需的酶。己糖激酶(#2)是葡萄糖进入糖和淀粉代谢的入口点。据报道，在叶绿体外包膜中有一种异构体[45]，但其在葡萄糖-6-磷酸进出口中的作用尚不确定。与小麦蛋白相关的同源物在质体上的Target P得分较低，为0.39。葡萄糖-6-磷酸异构酶(#1)位于淀粉生产、糖酵解和磷酸戊糖途径之间的分支点。检测到一种塑性异构体。没有检测到两种将果糖6-磷酸转化为果糖1,6-磷酸的酶。6-磷酸果糖激酶[2.7.1.105]和果糖双磷酸酶[3.1.3.11]均具有质体和胞浆亚型[43，46］．据报道，胚乳淀粉体中缺失果糖二磷酸酶，这与磷酸三糖缺乏进口相一致[46］．另一种，6-磷酸果糖激酶，先前在kcl提取物中被鉴定，可能是丰富的细胞质形式。要么果糖6-磷酸转化为1,6-磷酸发生在细胞质中，要么淀粉体酶存在但未检测到。

糖酵解(蛋白质# 3-10)

检测到糖酵解的七种酶，以及磷酸化磷酸烯醇丙酮酸的酶。7个都被预测为质体定位。当淀粉在胚乳中积累时，O₂水平降低。因此，这表明糖酵解是玉米胚乳中比线粒体氧化和TCA循环更重要的能量来源₂［47］．糖酵解在小麦胚乳中可能特别重要，胚乳中密集地填充着蛋白质和淀粉。果糖-二磷酸醛缩酶(#3)是生成三糖所必需的。磷酸甘油酸脱氢酶(#6)和磷酸甘油酸激酶(#7)是ATP和NADH产生的关键。虽然检测到磷酸甘油酸突变酶(#184)，但基于对最密切相关的水稻基因的Target-P预测，该蛋白似乎是细胞质亚型。在其他植物中被鉴定为质体酶或细胞质酶。如果小麦蛋白184号实际上是可塑的，那么从果糖1,6-磷酸到丙酮酸的所有蛋白质都被检测出来了。乳酰谷胱甘肽裂解酶(#185)也被检测到，但预计是细胞质来源。Mechin等人。[47]强调了玉米胚乳中细胞质丙酮酸正磷酸二激酶[EC 2.7.9.1]的重要性。在淀粉体部分中没有发现这种酶，但在kcl提取物中检测到。磷酸烯醇丙酮酸突变酶(#5)是一种涉及抗除草剂的酶。

丙酮酸代谢(蛋白质# 11-14)

丙酮酸是合成丙氨酸和天冬氨酸、支链氨基酸、类异戊二烯、类胡萝卜素和其他维生素以及脂肪酸的起点。蛋白质# 11-14是丙酮酸脱氢酶的组成部分，丙酮酸脱氢酶是脂肪酸生物合成中产生乙酰辅酶a的入口途径[48］．二氢脂酰赖氨酸残基乙酰转移酶(#11)，脂酰胺脱氢酶(#12)和丙酮酸脱氢酶E1 α(#13)和E1 β(#14)亚基在植物中都具有可塑性和线粒体异构体。对4个水稻同源基因中3个蛋白产物的target - p预测显示为质体目标序列，但对丙酮酸脱氢酶E1 β亚基的预测为“其他”。

柠檬酸盐和苹果酸盐(蛋白质# 15-16)

两种蛋白质参与了柠檬酸盐和苹果酸盐的代谢。植物细胞质、线粒体和质体中都有苹果酶的同型[49］．检测到的苹果酶(#16)与水稻基因产物相似，被标记为质体蛋白，并预测具有质体转运肽。苹果酶(#16)为脂质生物合成提供NADPH和丙酮酸。柠檬酸循环主要存在于线粒体中，但乌索酸水合酶或相关蛋白(#15)具有预测的质体转运肽。

淀粉生物合成(蛋白质# 17-24)

检测到淀粉生物合成所需的五种酶。淀粉形成的基本底物是adp -葡萄糖，由谷物胚乳细胞的细胞质和质体中的葡萄糖1-磷酸和ATP产生。小麦胚乳含有葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶的细胞质和淀粉体形式[17，50］．检测到大亚基(#19)和小亚基(# 20-21)的淀粉体形式。在籽粒发育过程中，细胞质合成adp -葡萄糖的能力可能增加[26］．检测到假定的adp -葡萄糖转运体的亚单位(#134)(见下文)，表明即使在10 DPA时，淀粉体也从细胞质中输入adp -葡萄糖。基于Target P对“other”的预测，将6-磷酸葡萄糖转化为1-磷酸葡萄糖的磷酸葡萄糖变酶(#183)似乎是细胞质异构体。用于淀粉生物合成的酶包括ndp -葡萄糖-淀粉葡萄糖基转移酶(颗粒结合淀粉合成酶)(#22)，1,4- α -葡聚糖分支酶2(#23)，淀粉合成酶II(#24)和4- α -葡聚糖转移酶(歧化酶)(#17)。基本上，上述酶通过一系列步骤将葡萄糖残基从adp -葡萄糖转移到直链淀粉和支链淀粉的简单和支链葡萄糖链上，包括修剪链，使支链淀粉层与直链淀粉点缀沉积在生长的淀粉颗粒上(综述于[51])。α 1,4-葡聚糖磷酸化酶(#18)的作用尚不确定。在膜组分中检测到淀粉生物合成酶，其中包括淀粉颗粒[6］．然而，并不是所有的淀粉生物合成酶都被检测到，包括淀粉合酶I, III或IV，淀粉分支酶1，去分支酶，以及淀粉降解所需的α -和β -淀粉酶。

磷酸戊糖途径(蛋白质# 25-30)

在磷酸戊糖途径中检测到六种蛋白质，它们将葡萄糖6-磷酸转化为核酮糖5-磷酸，然后转化为其他三碳、五碳和七碳糖。磷酸戊糖途径的非氧化反应仅限于质体，质体是核酸合成中核糖5-磷酸的唯一来源[26］．然而，在细胞质和质体中发现了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的异构体。检测到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(#25)的塑性形式，但6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(#186)被预测为细胞质形式。其他的酶被预测是可塑的。尽管核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(#28)主要与CO相关₂在叶绿体中固定，有迹象表明它在非光合组织中也起作用[52，53］．另外两种磷酸戊糖途径的酶，葡萄糖内酯酶[EC 3.1.1.17]和核酮糖5-磷酸3-外泌酶[EC 5.1.3.1]未检测到。

叶酸1碳(1C)代谢(蛋白质# 31-32)

发现了两种对1C代谢至关重要的酶。在植物中，质体、线粒体和细胞质中都存在1C通路。检测到的1甲酸-四氢叶酸连接酶(#31)和甘氨酸羟甲基转移酶(#32)蛋白被预测为质体异构体。这些酶的甲基转移对于甘氨酸和丝氨酸的相互转化和嘌呤核苷酸的合成至关重要[54］．该通路的其他成员未被检测到。植物中四氢叶酸的合成需要线粒体酶和细胞质酶[55因此，四氢叶酸本身很可能被输入到质体中，并可能从叶片输入到籽粒中，尽管对这种化合物的来源/汇关系知之甚少。

氨基酸合成(蛋白质# 33-74)

参与氨基酸合成的42种蛋白质占确定为淀粉体成分的蛋白质的24%2)．氨基酸生物合成的几乎所有步骤都发生在质体内[27]主要的例外是蛋氨酸的合成以及半胱氨酸和脯氨酸的一些合成步骤。氨基酸生物合成对能量和还原能力的高需求是通过碳水化合物氧化来满足的，包括氧化磷酸五糖途径。除脯氨酸或天冬酰胺代谢中未检测到酶外，氨基酸生物合成的每个塑性途径均存在酶。

虽然氨基酸是从叶片中输入的，但籽粒韧皮部筛管液和胚乳腔的组成与胚乳有显著差异，这表明许多氨基酸的合成是在胚乳内进行的。筛管液中谷氨酰胺(64%)和丝氨酸的含量高于其他氨基酸[19］．胚乳腔中含量最高的氨基酸为谷氨酰胺(~43%)、丙氨酸(~20%)和丝氨酸(~13%)[19- - - - - -21］．天冬酰胺(20.]和glycine [21]据报道也非常丰富。筛管液中几乎不含半胱氨酸和蛋氨酸，脯氨酸和芳香族氨基酸的浓度较低。脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的合成主要发生在胚乳内。据报道，胚乳中脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的净合成率最高，估计为170、89、42、48、44和44 n摩尔天-1，顺序为[20.］．

芳香族氨基酸(蛋白质# 33-39)

由磷酸烯醇丙酮酸和4-磷酸红合成芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸所需的所有酶都位于质体[56］．其中六种酶被检测出来。其中3个是在从磷酸烯醇丙酮酸和4-磷酸红酵素到海麻酸盐的莽草酸途径上(#34-36)，包括双功能3-脱氢喹酸盐脱氢酶/莽草酸盐:NADP脱氢酶(#34)和3个在从海麻酸盐到色氨酸的途径上(#33,37 - 39)。这些酶的拟南芥或水稻同源物用预测的质体转运肽编码蛋白质。虽然在灌浆期间，酪氨酸和苯丙氨酸的净合成量分别排在第三和第四位，但未检测到从chorchormal中合成苯丙氨酸和酪氨酸所需的另外四种酶[20.］．莽草酯途径也是合成其他含有芳香环的化合物的起点，其中许多化合物来自苯丙氨酸[56］．

天冬氨酸族氨基酸(蛋白质# 40-47)

检测到丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和苏氨酸生物合成途径中的8种酶。拟南芥和水稻的同源物以及二氢吡啶甲酸合成酶(#46)预测了质体转运肽，二氢吡啶甲酸合成酶是该途径中的一种蛋白质，小麦基因已被描述。在某些谷物中，天冬酰胺是输入胚乳的主要氨基酸之一，它是天门冬氨酸的来源，天门冬氨酸是合成其他氨基酸的必要中间体[57］．然而，天冬酰胺酶[EC 3.5.1.1]在本研究或[42］．天冬氨酸是苏氨酸和赖氨酸的前体，也参与转胺反应，以生产谷氨酸和谷氨酰胺[57］．从天冬氨酸到赖氨酸的7种酶中有6种被检测到(# 41-46)，从天冬氨酸到苏氨酸的途径中还有一种酶被检测到(#47)。还检测到天门冬氨酸转氨酶(#40)，它从天门冬氨酸催化谷氨酸的形成，是合成丙氨酸的必需酶。丙氨酸转氨酶[EC 2.6.1.2]未被鉴定。它存在于kcl提取物中，可能是一种细胞质酶。据报道，胚乳腔中丙氨酸的浓度高于韧皮部渗出液中的浓度，这表明当氨基酸运输到籽粒中时，会产生额外的丙氨酸[19］．

支链氨基酸家族(蛋白质# 48-55)

异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成途径中的7种酶全部存在，硫胺素是该途径的辅助因子。虽然有两种不同的途径，一种是从丙酮酸和2-羟乙基硫胺二磷酸到缬氨酸和亮氨酸，另一种是从羟乙基硫胺二磷酸和氧丁酸到异亮氨酸，但两种途径中都发现了四种酶(#48 - 50,55)。预测5个蛋白具有质体靶肽序列。另外两个，3-异丙基苹果酸脱氢酶(#51)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(#53)的大亚基，对质体或线粒体的预测是模棱两可的。

半胱氨酸，蛋氨酸和其他硫化合物(蛋白质# 56-62)

谷物进口的硫主要以谷胱甘肽、s -甲基蛋氨酸和硫酸盐的形式[21，22］．半胱氨酸和蛋氨酸的合成发生在胚乳中，可能会限制富含硫的胚乳蛋白质的合成，从而影响面粉的品质和营养价值。检测到参与半胱氨酸和其他s -化合物生物合成和代谢的7种酶。植物中合成半胱氨酸的酶位于质体、线粒体和细胞质中[58］．在淀粉体制剂中检测到两个，预测为质体定位。硫酸腺苷酰转移酶(#61)将硫酸盐添加到ATP上，生成硫酸腺苷酰，半胱氨酸合成酶(#58)是一种多酶复合物，将乙酰丝氨酸和硫化氢转化为半胱氨酸。硫酸腺苷基也是合成磺基-脂类磺基喹啉基二酰基甘油酸的硫供体。虽然5'-腺苷酰硫酸还原酶[EC 1.8.4.9]是将硫酸转化为半胱氨酸的关键酶，并且已知是一种质体酶[58]没有检测到它，也没有检测到硫酸盐还原所需的其他酶，铁氧还原蛋白依赖的亚硫酸盐还原酶[EC 1.8.7.1]。丝氨酸乙酰转移酶[EC 2.3.1.30]未检测到。它为半胱氨酸提供碳骨架，位于质体、细胞质和线粒体中，但含量不丰富，可能限制半胱氨酸的产生[58］．检测到生产谷胱甘肽所需的三种酶之一，谷氨酸-半胱氨酸连接酶(#59)。它将半胱氨酸与谷氨酸结合产生γ -谷氨酰半胱氨酸，并具有质体或线粒体的目标预测。由于硫是作为谷胱甘肽进口的，半胱氨酸生产的一个途径可能是从谷胱甘肽到谷氨酸加半胱氨酸。安德森和菲茨杰拉德[21然而，这在能量上是不利的，并且可能存在从谷胱甘肽到半胱氨酸的替代途径。

胱胱硫氨酸γ合成酶[EC 2.5.1.48]是一种位于质体位置的酶，在合成蛋氨酸的途径上负责合成胱胱硫氨酸[58，59]，但没有被探测到。然而，胱胱硫氨酸-裂解酶(#56)被检测到。它负责胱胱硫氨酸分解为丙酮酸和同型半胱氨酸，这是蛋氨酸生产的关键中间产物，只在质体中产生。检测到的其他半胱氨酸代谢酶包括将硫酸盐转化为硫氧还蛋白的磷酸腺苷酰硫酸还原酶(#60)和合成其他硫酸化化合物所需的半胱氨酸共轭β -裂解酶(#57)。硫代硫酸盐硫转移酶(#62)参与半胱氨酸分解为丙酮酸和硫酸盐。蛋氨酸合酶和s -腺苷蛋氨酸合酶主要存在于细胞质中，在kcl提取物中检测到，而在淀粉体制剂中未检测到。

甘氨酸和丝氨酸(蛋白质#6,32)

丝氨酸是一种丰富的进口物质，但也可以在淀粉体中合成。磷酸甘油酸脱氢酶(#6)，糖酵解到丝氨酸途径中的一种酶[60]，是在淀粉体制备中检测到的该途径的唯一成员。据报道，合成甘氨酸的主要途径是从丝氨酸通过甘氨酸羟甲基转移酶的作用(#32)[61]，检测到。甘氨酸在胚乳中的净合成是不必要的，然而[20.］．

谷氨酸家族(蛋白质# 63-69)

精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺生物合成途径中的9种酶中有7种存在，并且预测具有质体转运肽，尽管谷氨酰胺是输入胚乳的主要氨基酸之一[19]谷氨酰胺的摄取对玉米胚乳蛋白质的产生至关重要[62］．检测到谷氨酸、谷氨酰胺和天门冬氨酸相互转化的两种必需酶。铁氧还原蛋白依赖的谷氨酸合成酶(#68)对于谷氨酸和谷氨酰胺的相互转化至关重要，而天门冬氨酸转氨酶(#40)对于谷氨酰胺和天门冬氨酸的相互转化至关重要。尽管脯氨酸是最丰富的胚乳氨基酸之一，很少有脯氨酸是进口的，但从谷氨酸到脯氨酸的途径中的三种酶没有被检测到。从鸟氨酸到脯氨酸途径的酶也未检测到。据报道，其中一种是吡罗啉-5-羧酸还原酶[EC 1.5.1.2]，它同时存在于质体和细胞质中，但据报道，这些酶在植物中很难检测到[63］．

组氨酸(蛋白质# 70-74)

在组氨酸和嘌呤核苷酸合成的联合途径中检测到五种酶中的四种(# 70,72 - 74)，以及组氨酸合成所特有的三种酶中的一种(#71)。咪唑甘油磷酸合酶(#72)位于组氨酸和嘌呤之间的分支点。除了#74预测了质体或线粒体外，其他同源物都编码了预测质体靶肽的蛋白质。

核酸生物合成(蛋白# 75-86)

检测到核酸生物合成所需的12种酶(表3.)．在质体中合成的核酸随后可在细胞核中用于合成DNA和RNA。然而，腺嘌呤核苷酸也是能量代谢和NAD在质体中还原能量转移所必需的。尿苷用于需要UTP的细胞质过程，如糖基化。检测到嘌呤合成所需的8种酶中的5种(# 78-82)和嘧啶合成所需的6种酶中的3种(# 83-86)。关于植物中嘌呤和嘧啶合成酶的细胞位置的信息有限。核酸通过从头和打捞途径产生，酶不稳定，含量不丰富[64］．一份报告指出嘌呤合成发生在质体和线粒体中[65］．喹啉酸合成酶(#76)是合成NAD所需的四种酶之一(#76)，最近在一项研究中描述，该研究表明合成NAD的酶位于质体中，但可能并不丰富[66］．在这项研究中，对检测到的12种蛋白质中的10种进行了质体转运肽的预测，对另外两种进行了质体或线粒体转运肽的预测。这表明淀粉体是核酸合成的中心。

卟啉(蛋白质# 87-94)

从谷氨酰tRNA到胆绿素的途径中检测到10种酶中的7种(# 87,89 - 94)，以及铁蛋白(#88)，一种铁供体(表3.)．谷氨酰tRNA是胆绿素生物合成途径开始时谷氨酸最初转化为氨基乙酰丙酸的辅助因子[67］．在叶绿体中，这一途径受到光和细胞分裂素的调控[68］．胆绿素成为胆素发色团，是光敏色素的重要组成部分。对所有7种酶的质体转运肽进行了预测，同时对铁蛋白转运肽的质体或线粒体进行了预测(#88)。

类异戊二烯，类胡萝卜素和维生素E(蛋白质# 95-99,103-104)

从丙酮酸和甘油醛3-磷酸到胡萝卜素的异戊二烯类途径中的12种酶中有5种被检测到，并且对所有这5种水稻同源物的质体转运肽进行了预测(表2)3.)．质体是通往二磷酸异戊酯和二磷酸二甲基烯丙酯的非甲丙酸途径的位点[69]和该途径中7种酶中的2种(#95,96)以及互转化两种必需的类异戊二烯中间体的异戊二烯二磷酸异构酶(#97)。未检测到合成香叶酰香叶酰二磷酸的两种必需酶，但检测到从香叶酰香叶酰二磷酸到类胡萝卜素(# 98-99)和维生素E的途径上的酶(# 103-104)[70，71］．

其他维生素和辅助因子(蛋白质# 100-102)

三种酶参与维生素B代谢被检测(表3.)．5’-磷酸吡哆胺参与维生素B6的代谢，尽管“含有蛋白质的吡哆胺5-磷酸氧化酶相关结构域”(#100)的确切功能尚不清楚。两种B族维生素由核酸生物合成途径产生的代谢物产生。核黄素合成酶(#101)是合成核黄素(维生素B2)的关键酶[72］．硫胺素生物合成蛋白(#102)是合成支链氨基酸所需的硫胺素(维生素B1)的必需酶[73］．

脂肪酸生物合成(蛋白质# 105-112)

检测到脂肪酸生物合成所需的全套酶(表2)3.)．脂肪酸只在质体中合成[27]，通过连续添加2碳单位。这需要ATP和还原性等价物。质体从细胞质中吸收醋酸盐，或者使用其他碳源，这取决于植物。丙酮酸脱氢酶(# 11-14)产生乙酰- co，由乙酰辅酶a羧化酶(#105)转化为丙二酰辅酶a，并通过由编号为# 107-110和#112的酶催化的重复反应，通过脂肪酸循环纳入脂肪酸。第一个乙酰辅酶a分子附着在酰基载体蛋白质上，随后的丙二酰辅酶a分子被添加到双碳步骤中形成脂肪酸。酰基载体蛋白未检测到。随后，油酰(酰基-载体-蛋白质)水解酶(#111)催化脂肪酸从酰基-载体-蛋白质复合物中释放。检测到的另一种酶是油酰-(酰基-载体-蛋白质)去饱和酶(#106)，它对不饱和脂肪酸的形成至关重要。质体转运肽预测有两个例外。Target-P程序预测了水稻基因酰基[酰基载体蛋白]去饱和酶(#106)的线粒体转运肽，而小麦基因油酰[酰基载体蛋白]水解酶(#111)缺少n端序列。 A similar Arabidopsis gene for oleoyl-[acyl-carrier protein] hydrolase did have a predicted plastid transit peptide.

红牛系统(蛋白质# 113-121)

9种酶被检测到在还原等价物的转移、通过氧化还原状态的改变调节蛋白质功能和保护自由基方面发挥作用(表4)．

铁氧还蛋白-硫氧还蛋白体系(蛋白# 113-115)

检测到硫氧还蛋白还原和氧化所需的三种蛋白质。已知这三种基因都位于质体中，并预测了质体靶序列。来自非绿色质体的铁氧还蛋白NADPH还原酶(#114)异构体利用NADPH还原铁氧还蛋白，而叶绿体异构体则从铁氧还蛋白转移电子以生成NADPH [74］．异构体在不同的氧化还原电位下起作用。与#114最接近的同源物是一种水稻蛋白质，被注释为“根同工酶”，来自玉米和拟南芥的相关蛋白质也是如此，这表明#114是在非绿色组织中发现的同工酶。在淀粉体中，NADPH由糖酵解和戊糖-磷酸途径产生。然后，还原的铁氧还蛋白将在半胱氨酸合成过程中为亚硫酸盐还原为硫化物提供还原动力，并通过铁氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶还原硫氧还蛋白(#115)。利用抗硫氧还蛋白m的抗体在淀粉体制剂中检测到硫氧还蛋白，并提出还原硫氧还蛋白可以通过转移还原物来调节许多淀粉体酶的活性[31］．硫氧还蛋白调节的候选酶在图中所示的通路中1和附加文件1．许多处于通路分支点或参与ATP生成或还原能量的酶。

自由基清除系统(蛋白质# 116-121)

六种酶参与了对自由基的保护(# 116-121)。所有6种都是已知的叶绿体蛋白，其中5种预计具有质体转运肽。超氧化物歧化酶(#117)将氧自由基转化为过氧化氢。随后，抗坏血酸过氧化物酶(#116)除去过氧化物并生成单脱氢抗坏血酸，然后由单脱氢抗坏血酸还原酶(#119)还原[75，76］．过氧还蛋白(#120,121)通过将硫氧还蛋白或戊氧还蛋白(#118)的还原等价物转移到过氧化物，催化过氧化物向水的转化[75］．尽管叶绿体戊二氧还蛋白的存在存在争议[77]，与小麦肽段序列匹配良好的拟南芥同源物被预测具有质体转运肽。

光系统I和II类囊体蛋白(蛋白质# 122-129)

8个蛋白质是和光系统I和II相关的类囊体蛋白(表4)．光系统II的氧进化复合体的三个蛋白质是在类囊体腔内发现的外源性类囊体蛋白质(# 126-128)。ATP合酶亚基(#122)和细胞色素f(#123)是本研究中仅有的三个编码在质体染色体上的蛋白质中的两个[78- - - - - -80］．六种核编码的蛋白质都被预测有质体转运肽，而质体编码的蛋白质被预测有“其他”。类囊体蛋白提示胚乳周围绿色组织的叶绿体污染。然而，淀粉体的制备是白色的，而不是绿色的，这可能是真正的淀粉体成分，表明淀粉体和叶绿体的共同起源。

信号(蛋白质# 130-131)

肌醇磷酸酶(#130)和肌醇单磷酸酶(#131)通常参与信号转导，尽管在植物中它们也可能参与其他目的的肌醇代谢。两者都预测了质体转运肽，并在叶绿体中发现(表4)．

底物转运(蛋白质# 132-135)

蛋白质通道和转运蛋白需要移动分子进出淀粉体，穿过外膜和内膜。只检测到四种，假定的adp -葡萄糖转运蛋白(#134)，两种abc型转运蛋白(#132,133)和一种氨基酸选择通道蛋白(#135)(表4)．其中两个预测了质体靶肽，另外两个预测了“其他”肽，这并不意外，因为膜蛋白将被插入包膜膜而不是通过包膜膜运输。考虑到需要运输Pi、Fe和SO等矿物质，这是少量的转运蛋白₄-、淀粉体内外的碳水化合物、叶酸、氨基酸、维生素和辅助因子[26]，随着技术的改进和序列信息的增加，很可能会发现更多的小麦淀粉体膜转运蛋白。例如，在一项拟南芥基因组的研究中，发现了16个假定的磷酸转运基因[81］．Kleffman等人[82]在拟南芥叶绿体蛋白质组学研究中鉴定出118个在转运中具有潜在作用的蛋白质。他们使用散弹枪法比使用二维凝胶法发现了更多的转运蛋白。6］．所有质体转运蛋白的蛋白质和基因可能还没有被确定，部分原因是难以测量膜蛋白的转运来验证它们的功能。因此，即使假定的adp -葡萄糖转运体也没有实际被证明可以运输adp -葡萄糖[83］．

蛋白质的合成、进口、组装和加工(蛋白质# 136-163)

28个蛋白质参与蛋白质合成、导入组装、折叠或翻转，占分配到淀粉体的蛋白质的16%(表2)4)．

核糖体蛋白(蛋白质# 136-142)

检测到七种已知与叶绿体核糖体复合物相关的蛋白质。所有这些都由核DNA编码。五种预测有质体转运肽，一种预测有质体或线粒体，一种预测有质体或“其他”。质体核糖体是合成由质体DNA编码的蛋白质所必需的[80］．在这项研究中只检测到三种这样的蛋白质(# 25,122,123)。

蛋白质导入(蛋白质143-148)

六种蛋白质形成穿过内外质体包膜的孔，并促进在细胞质核糖体上合成的蛋白质的输入。toc样蛋白(# 146-148)与外包膜有关，tic样蛋白(# 143-145)与内包膜有关[84，85］．Toc 34(#146)不需要转运肽插入外包膜。对其他5种蛋白的转运肽进行了预测。

组装，折叠，蛋白质水解和翻转(蛋白质# 149-163)

检测到蛋白质合成和加工所需的15种蛋白质。10个被预测具有质体转运肽，2个具有线粒体转运肽。其他三个预测分别是质体/线粒体，“其他”/质体和“其他”。在淀粉体制剂中检测到的伴侣和蛋白酶的功能仍在澄清中。这组蛋白质的命名可能令人困惑。质体Hsp90家族相当于其他系统中的Hsp100家族;有些相同的蛋白质也称为Clp蛋白，有些是伴侣蛋白，也是蛋白酶，反之亦然[86- - - - - -89］．ATP被ClpC复合物水解(下图)被认为为蛋白质的导入提供能量[86- - - - - -88，90］．伴侣的结合亦可能为进口提供动力[81，82］．

Clp蛋白形成伴侣复合物，帮助推动蛋白质导入质体，切割转运肽，并回收质体组分[86，89］．Clp蛋白酶复合物可能是蛋白酶体的质体等量物[88］．绿色质体的一个重要作用是叶绿素的降解和周转。在淀粉体中，它可能通过选择性降解质体酶来调节酶的活性[86］．据报道，来自绿色组织和非绿色组织的质体中的Clp蛋白酶全酶由一组相同的11个Clp蛋白组成[88]其中3种在淀粉体制剂中被鉴定(# 152-154)。水稻和拟南芥蛋白质#152和#153的同源物被标记为clpa样，但Clp-A在植物中不存在。在NCBI绿色植物数据库中对这些同源物进行BLAST搜索，表明它们可能是ClpC家族的成员。

在NCBI中只有少量的植物蛋白序列与假定的氨基肽酶C或酰基肽水解酶(#149)相匹配的记录。这是一个水稻基因和一个细菌脯氨酸寡肽酶的拟南芥同源基因。此外，关于20 kDa叶绿体伴侣蛋白(#150)的信息也很少。寡肽酶(#156)将目标肽切割成氨基酸，以便它们可以回收[90］．质体脂相关蛋白(#160)可能在绿色质体的类囊体翻转中起作用。锌金属肽酶(#163)可能参与从从细胞质导入的蛋白质中去除靶向肽[87，90］．

质体分裂(蛋白质# 164-165)

只检测到两种参与质体分裂的蛋白质(表4)．FtsZ(#164)和Arc6(#165)形成环状结构的一部分，在分裂过程中收缩质体[85，91］．这些可能对去除含有b型淀粉粒的淀粉体切片很重要，b型淀粉粒是在大a型淀粉粒之后形成的[28］．

功能未知的质体蛋白(蛋白# 166-178)

只有13个预测的淀粉体蛋白功能未知(表4)．其中，来自10个蛋白质的肽与来自水稻或拟南芥的功能未知的基因产物相匹配，但在NCBI数据库中被注释为质体蛋白，并编码了预测将蛋白质靶向于质体的转运肽。172号的预测目标序列是线粒体或质体，但拟南芥同源物注释为叶绿体。仅基于质体转运肽的预测和淀粉体部分的存在，三种蛋白质(# 174-176)被分配到这一类别。虽然其中5个未知蛋白具有一定的功能信息，但还不足以确定它们的作用。

功能未知的质体或线粒体蛋白质(蛋白质# 180-182)

来自另外三种蛋白质(# 180-182)的肽与基因产物相匹配，这些基因产物在功能或细胞位置上没有标注，但在质体和线粒体上都有良好的转运肽(表180-182)4)．

缺少蛋白质

由于生物组织中蛋白质数量的动态范围大，蛋白质组学研究主要检测那些胰蛋白酶消化产生的肽在最佳大小范围内的丰富蛋白质[92］．组织分离提高了蛋白质检测的范围，许多蛋白质在淀粉体部分中被检测到，这些蛋白质以前没有在盐溶蛋白质的一般提取物中被发现。然而，178个预测的淀粉体蛋白很可能是那些最丰富和/或适用于分析方法的蛋白质。例如，1-C代谢蛋白[54]，丝氨酸乙酰转移酶[58]和合成NAD的酶[66]并不丰富，而且很难发现。参与信号转导的蛋白质很少被检测到，可能是因为它们的含量较少。通过不同的技术可以鉴定出更多的转运蛋白[82］．

本研究中检测到的大多数途径都只位于质体中，是胚乳代谢所必需的，包括氨基酸、脂肪酸、胆绿素和维生素合成的大多数步骤。因此，这些途径所需的酶很可能存在于淀粉体中，即使它们没有被检测到。例如，用于合成苯丙氨酸和色氨酸的choris酸途径的酶似乎是必需的，因为在胚乳中存在这些氨基酸的净合成。在其他情况下，检测不到蛋白质可能表明淀粉体中不存在该蛋白质，例如，由于小麦淀粉体不利用磷酸三糖，因此不需要果糖二磷酸酶[46］．将需要大量的研究来绘制多室途径，如硫代谢或核酸的回收和重新合成。

目标预测的准确性

在许多情况下，检测到的酶来自于质体特定的途径，Target P的预测与这一知识一致。类似地，在许多情况下，Target P对非质体区室的预测与被确定为污染物的蛋白质的一般知识是一致的，如存储蛋白、内质网和分泌系统的ras相关蛋白以及细胞质核糖体蛋白(附加文件)1)．然而，在某些情况下，证据并不确凿。预测细胞器靶向的算法并不完善，详见[93］．相似的蛋白质可能靶向不同的细胞器[94]在某些情况下，单个基因编码针对多个细胞器的蛋白质[95］．此外，许多小麦蛋白质的基因组或cDNA序列无法获得，因此许多目标P预测是基于相关基因，主要来自水稻。因此，小麦蛋白可能是由质体特异性蛋白的基因编码的，但同源物被预测为非质体的，反之亦然。因此，这些任务应谨慎对待。

进一步的指示

为了获得更高蛋白质含量的籽粒产量，并随着温度的升高而提高产量，了解淀粉体相互关联的代谢途径是如何被调节的将是重要的。Barneix [7]表明蛋白质的积累可能受到再动员和向籽粒运输的限制，Mechin等人。[47提出了一个关键作用的细胞质蛋白，丙酮酸正磷酸二激酶。然而，当进入谷物的碳、氮和硫组成部分被转化为淀粉和蛋白质时，许多控制这些过程的基本代谢途径都在淀粉体内，并且可能在产量和蛋白质含量之间的权衡中发挥作用。硫氧还蛋白可调节若干关键酶[31以及其他监管机制。

对于胚乳淀粉体的发育、组成、代谢及调控的进一步研究，需要多种途径。蛋白质组学的研究对于预测特定基因产物的质体位置是有价值的。但本研究仅限于胚乳充足、淀粉粒小、贮藏蛋白积累少的籽粒发育10 ~ 12 DPA窗期。淀粉体的分离很难脱离广泛的内质网，而内质网用于储存蛋白质的生物合成。在15 DPA后，积累的淀粉和蛋白质使分离淀粉体变得困难。免疫化学定位或gfp融合蛋白靶向等技术将有助于研究籽粒发育的后期阶段，并提供淀粉体定位的额外证据。对通过各种途径的通量进行详细的代谢组学研究对于评估其重要性至关重要。通过使用蛋白质组学数据识别转录组学研究中要跟踪的候选基因，可以在整个灌浆过程中跟踪基因表达。胚乳的多维代谢图谱将考虑到籽粒灌浆过程中淀粉体、细胞质、线粒体和其他细胞器中调控的关键位点。

谷物胚乳是一种异养组织，高度专一于淀粉和蛋白质的积累。小麦从韧皮部进口了有限的分子组成单元。随后，进口的蔗糖、谷氨酰胺和其他一些氨基酸被转化为一系列氨基酸、脂类、核酸和碳水化合物，以维持发育中的谷物中淀粉和蛋白质的大量积累。淀粉体在这一过程中起着核心作用。直到最近，它们主要被讨论在淀粉生物合成中的作用，而它们在其他胚乳成分合成中的作用被忽略了。这项研究为至少18种基本代谢途径的淀粉体定位提供了证据。在籽粒发育早期，淀粉体是大的细胞器，内外膜包围着广泛的基质和小的淀粉粒。研究集中在与淀粉颗粒相关的酶，但我们提出，基质也是颗粒填充过程中重要代谢活动的场所。

小麦胚乳产生淀粉和蛋白质，这些淀粉和蛋白质成为面包、意大利面和许多其他食物，这些食物在人类饮食中提供了很大比例的卡路里。虽然大多数质体蛋白的基因现在都在细胞核中编码，但它们似乎起源于最初的共生有机体，成为第一个叶绿体[78，82，85］．这种蓝藻共生体是谷物食品生产所需的许多关键酶的最终来源。

蛋白质组学数据由Balmer等获得。[6］．以胚乳为原料，在10-12 DPA条件下制备淀粉体，分离成可溶性和膜组分，进行双向凝胶电泳分析。采用串联质谱技术对小麦est和contigs的3个数据库进行了分析[35- - - - - -37]以及NCBI非冗余绿色植物数据库(不包括水稻和拟南芥)[34］．通过串联质谱/质谱鉴定的肽列在Balmer等人的补充表中。[6］．完整的数据现在以两个XML文件的形式提供[96］．要查看数据，请将XML文件ftp到您自己的计算机，并在GPM网站[97]，并使用“查看保存的xml文件”功能浏览并找到xml文件，并在GPM中打开。通过使用附加文件中给出的序列标识符搜索，可以在XML文件中找到感兴趣的蛋白质1．

在本文中，通过[6]用于查询2007年版的NCBI非冗余绿色植物蛋白和翻译核苷酸数据库[34]使用pBLASTn算法，期望阈值设置为20000，字长2，矩阵Pam 30，缺口成本存在:2，扩展:1 [40］．对于每个蛋白质，最接近的同源物与完整的n端序列被识别出来。Target-P算法用于分析n端序列的前200个氨基酸，以确定是否预测到转运肽[41，98］．另外还对来自其他物种的同源体的细胞位置的数据库信息进行了评估。使用上述pBLAST算法查询NCBI EST数据库，除非从NCBI非冗余数据库中选取的基因或cDNA序列来自于，否则选择代表每个蛋白质的典型小麦EST小麦．

基于ExPASy生化途径中显示的途径，质体酶被分为代谢途径[99，One hundred.]，来自BRENDA的资料[101，102]，并在文中引用了许多参考文献。最新的EC编号和首选酶名是根据最新版本的BRENDA 2007.1中的信息分配的。蛋白质和基因数据库不断更新。为保持本文与[6附加文件1包括来自Swiss-Prot数据库的相同数字[103在[中使用]6］．然而，一些标识已经发生了变化。

分区:

开花后的几天。

资金来源于美国农业部农业研究服务CRIS项目5325-43000-026-00D。原始的蛋白质组学数据都参考了Yves Balmer, Bob Buchanan, Frances Dupont, William Hurkman和William Vensel在[6］．感谢Susan Altenbach阅读手稿并提供有用的建议。美国农业部提及特定产品名称并不构成认可，也不意味着对其他合适产品的推荐。

从属关系

1. 美国农业部西部区域研究中心，农业研究服务，布坎南街800号，奥尔巴尼，加利福尼亚州，94710K

   弗朗西斯·M·杜邦

相应的作者

对应到弗朗西斯·M·杜邦．

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