氧化还原敏感转录因子Rap2.4a控制2-Cys过氧化物还氧蛋白A和其他叶绿体抗氧化酶的核表达

背景

叶绿体抗氧化能力的调控依赖于细胞核基因的表达。对于2-Cys过氧化物还毒素a基因(2CPA) a独联体-调控元件最近被发现，它响应光合氧化还原信号。

结果

在酵母-一混合屏幕独联体-调节结合蛋白，分离转录因子Rap2.4a。Rap2.4a通过结合ce3样元件的CGCG核心来控制重要叶绿体抗氧化酶的转录物丰度。Rap2.4a活性受调节半胱氨酸残基的二硫醇/二硫过渡和随后的四级结构变化的调节。Rap2.4a活化的中点氧化还原电位为-269 mV (pH 7.0)。

结论

Rap2.4a的氧化还原敏感性为叶绿体抗氧化剂核基因活性的氧化还原控制建立了有效的开关机制，其中Rap2.4是氧化还原传感器和氧化还原信息的传感器。

在光合作用中，过量的激发能支持活性氧(ROS)的形成[1]会破坏代谢物、酶和结构[2］．抗氧化酶解毒ROS，消耗多余的能量和再生电子受体NADP⁺和硫氧还蛋白。作为适应不利生长条件的一部分，抗氧化酶的表达在中等胁迫条件下增加[3.］．在严重的应激条件下，基因表达减少[4］．此外，各种抗氧化酶，如抗坏血酸过氧化物酶(APx) [5]和过氧化物还毒素[6]，是未激活的。ROS的积累降低了光合活性[1]并激活细胞质防御机制[1，7，8］．

在拟南芥cuzn -超氧化物歧化酶(CuZn-superoxide dismutase, Csd)敲除系中，光氧化胁迫对叶绿体蛋白表达模式的影响最大。9］．在2-Cys过氧化物还氧蛋白(2-CP)反义系中，叶绿体氧化还原平衡的不平衡诱导叶绿体APx和单脱氢抗坏血酸还原酶的表达[j]。10］．在足底2CPA启动子调控分析[11证明了叶绿体抗氧化酶的核转录响应叶绿体信号。质体醌池的氧化还原状态[12]，低分子量抗氧化剂的氧化还原状态[13]，光系统I的受体可用性[4，11]及ROS [7]被认为是叶绿体氧化还原状态的信号。通过活性氧、氧化脂类、原叶绿素内酯、碳水化合物代谢偶联和NAD氧化还原平衡的信号转导⁺/NAD(P)H, MAPK级联和ABA已被发现[14- - - - - -16］．目前，信号转导正处于深入研究之中[16，17］．初步结果证实了Mg的信号功能^{2 +}-原卟啉和aba触发的转录因子ABI4在绿化过程中核基因表达与叶绿体发育的关系[j]。14- - - - - -16］．然而，绿色组织中以氧化还原依赖的方式调控叶绿体抗氧化酶核表达的确切分子机制尚不清楚。

筛选到核编码叶绿体2CPA (rimb-mutants)叶绿体抗氧化酶的转录调控与典型的ROS积累反应不同，如诱导脂氧合酶-2 (Lox2)、抗坏血酸过氧化物酶-2 (Apx2)、BAP1和Fer1 [18[Heiber et al.，未发表的数据]。胞质抗氧化酶的许多基因，如Apx2，逐渐被诱导到非常高的水平。表达强度与调节转录因子的可用性相关[8］．相反，大多数叶绿体抗氧化酶的表达在一定的胁迫水平下被诱导，但在严重的氧化应激条件下，如高浓度H₂O₂［4，9，19[Heiber et al.，未发表的数据]，假设有正负调节因子或相互作用的拮抗信号通路控制基因表达。

在转录调控方面，2CPA是研究最多的叶绿体抗氧化酶编码基因之一。转录在年轻的发育组织中是最强的[20.］．在发育调控之上，转录强度与光系统- i (PS-I)上的受体可用性相关[11]，定义了NADP的还原状态⁺硫氧还毒素[21］．在足底启动子分析表明光合氧化还原信号在不同的启动子区域被感知。目标基序位于314 bp核心启动子的上游，该启动子将2CPA表达与叶绿体发育相关联[11］．多种核编码叶绿体蛋白受2CPA共同调控[18］．Piippo等。[4假设PS-I的还原位点实际上是叶绿体到细胞核信号传递的主要信号起始点。

一个216 bp的氧化还原敏感基因独联体在2CPA启动子中发现了-调控区域。它对叶绿体氧化还原信号作出反应[11］．由于序列分析没有显示出与已知氧化还原调节转录因子的相互作用，因此进行了酵母-单杂交筛选以鉴定顺式调节蛋白。本文介绍了转录因子Rap2.4a的分离和表征。Rap2.4a是氧化还原敏感的，与氧化还原敏感启动子区域的ce3样元件结合，调节2CPA的转录。对Rap2.4a-KO系的分析表明，转录因子还影响其他核编码叶绿体抗氧化酶的表达，并保护植物免受轻度胁迫，如环境光照条件波动。

Rap2.4a的分离

为了鉴定参与2CPA转录调控的顺式调控蛋白，利用216 bp氧化还原活性2CPA启动子结构域对酵母-单杂交(Y1H)进行了筛选[11]及其侧翼地区。将诱饵元件克隆到Gal1、10最小启动子和HIS3-cDNA上游的pONE-1载体上。将载体转化为酵母菌Y187。通过将Y187与一个来自于一种植物的cDNA文库共转化，获得了猎物拟南芥细胞悬浮培养[22］．与2CPA启动子DNA相互作用最强的是编码gal4激活域(AD)融合蛋白和ap2型转录因子Rap2.4a (At1g36060;b- erf类型)[23]，间隔11个氨基酸(AD-Rap2.4a)。

在添加40 mM 3-氨基-1,2,4-三唑(一种his -生物合成抑制剂)的培养基上，证实了ad - rap2.4 -a融合蛋白与诱饵的相互作用。为了排除表观遗传调控，将酵母菌株Y187重新转化为大肠杆菌-放大的猎物和诱饵结构。在40 mM 3AT上的存活证实了转录因子与靶元件之间的强相互作用。

2CPA启动子中rap2.4 a结合位点的定位

有5个重叠的dna片段(F1, F2, F3, F4和F5)覆盖在y1h诱饵上，在非还原条件下，EMSA将Rap2.4a的结合位点定位到F4和F5重叠的13 bp处(图2)。1）.Rap2.4a靶序列用合成的双链13 bp寡核苷酸确认(图2)。1 b）.异源表达Rap2.6 (At1g43160)(图2)1)，在dna结合位点上与Rap2.4a具有80%的序列一致性(图2)。1 c)和对照的裂解物大肠杆菌，用空表达载体转化(数据未显示)，没有移动任何2CPA启动子片段。利用辣根过氧化物偶联链亲和素检测生物素化pcr产物来分析诱饵元件与Rap2.4a之间的相互作用，而不是通过免疫检测his标记蛋白来监测凝胶位移(数据未显示)。由于两种方法都显示了DNA和蛋白质的相互作用，因此我们选择对蛋白质进行免疫检测作为常规方法，但事实证明，对His-tags进行免疫检测更容易、更有效。

由MatInspector进行模式分析[24]预测了耦合元件3 (CE3)样基序(CA)CGCGATTC)在13bp目标序列中。基序在ccgg -核之后的两个碱基上偏离了典型的ce3 -元件[25] (ACGCGTGTC)。用TTGT取代cgg -核可以消除Rap2.4a与双链20 bp寡核苷酸的结合(数据未显示)，就像C的单核苷酸取代一样_3.和G₄(图。1 d）.结论是C_3.和G₄对于Rap2.4a的结合至关重要。

ce3通常与ACGT-ABREs一起赋予aba反应性[25，26］．例如，TRAB1可以交替识别两个基序[25]和Rap2.4b过表达时可以接管DREBP和erf功能[27］．然而，Rap2.4a没有结合CE3的acgt变体(图D)。1 d)和ABRE预测的CE3-like元件上游282 bp(图2)。1 d)，证明了Rap2.4a对ce3样元件的特异性。

在活的有机体内C函数_3.G₄在rap2.4 a- 2CPA转录调控中

在转染2CPA的拟南芥叶肉原生质体中，通过Rap2.4a瞬时过表达(35S:Rap2.4a)检测Rap2.4a对2CPA启动子的调控功能_wt: YFP。在共转染35S:CFP上标准化，16小时Rap2.4a过表达导致YFP活性比空载体对照高约5倍(图2)。2)，证明Rap2.4a是一种激活转录因子。

为了测试在活的有机体内C函数_3.G₄在野生型启动子(2CPA)的控制下，用表达YFP的报告基因构建体转染拟南芥叶肉原生质体_wt:YFP)或诱变启动子(2CPA)_{无足轻重的人}:YFP)，其中TT代替C_3.G₄(无花果。2 b）.对共转染35S:CFP的表达归一化后，构建TT-variant (2CPA)的YFP/CFP表达比_{无足轻重的人}与2CPA相比，YFP降低了34%_wt:YFP孵育16 h后(图2)。2 b)证实了这两个核苷酸在稳定转录因子和启动子之间相互作用方面的调节功能，但它并没有完全忽略2CPA启动子的激活。

Rap2.4a在拟南芥叶肉原生质体中的定位

由于Rap2.4a缺乏强烈的核定位信号，因此已经提出了针对Ib-ERF的Rap2.4c (At2g22200) [28]，利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析了Rap2.4a- yfp融合蛋白在拟南芥原生质体中的分布(图2)。3.）.孵育12 h后，碱性螺旋-环-螺旋转录因子ABI5的YFP融合蛋白(97±2%)在细胞核中观察到大部分蛋白(92±7%)，而在细胞核中仅检测到53±5%的游离YFP(图5)。3.）.

rap2.4 a依赖性2CPA转录的氧化还原调控

与荧光蛋白相比，荧光素酶报告元件的稳定性较低，灵敏度和时间分辨率较高[29］．因此，在转基因2CPA:荧光素酶系中研究了2CPA启动子的氧化还原调控[11］．与转染35S: cfp的原生质体相比，转染35S:Rap2.4a的原生质体在孵育2 h后荧光素酶活性提高了1.8倍(见表2)。1）.快速反应表明Rap2.4a对2CPA的激活快速而强烈。

为了测试Rap2.4a在氧化还原调控2CPA表达中的功能，我们分别用1mm DTT或抗坏血酸降低细胞氧化还原平衡。抗氧化剂在90 min内使Rap2.4a过表达原生质体的荧光素酶活性分别降低63%和65%(见表2)。1）.1mm H₂O₂与对照相比，35S:Rap2.4a系的荧光素酶活性提高了54%(表2)。1）.与H₂O₂-浓度高于3mm时，报告基因活性再次下降，表明失活(数据未显示)。在控制条件下，在1mm H₂O₂用Rap2.4a cDNA转染CFP后，原生质体的荧光素酶活性分别提高了180%和203%。结论是Rap2.4a激活了报告基因。相反，报告基因活性在DTT和抗坏血酸处理的样品中降低。这一观察结果表明，Rap2.4a结合是氧化还原依赖性的。

研究了2 μg Rap2.4a和100 pmol F5在5 mM DTT或H存在下对Rap2.4a DNA结合的氧化还原调控₂O₂相对于未经治疗的对照组。琼脂糖凝胶分离后，用荧光定量PCR分析dna结合。在H₂O₂与未处理的对照组相比，处理后的样品中F5的检出率为310±90%。在dtt处理的样品中，游离F5的量是未处理样品的730±140%(表2)。2)，证明两者，H₂O₂DTT消除了DNA结合。

Rap2.4a蛋白的氧化还原调控

在SDS-PAGE上，重组Rap2.4a的表观分子质量分别为36 kDa、70 kDa和更大的聚集体，表明转录因子的单体、二聚体和低聚体形式(图2)。4）.DTT消除了低聚物，降低了二聚体的分数，增加了单体的数量(图2)。4左)。应用温和的H₂O₂浓度(无花果。4右)仅检测到高分子量条带。5 mM H处理₂O₂导致Western-Blots上Rap2.4a信号完全丢失，这表明要么形成了高分子质量复合物，不再迁移到凝胶中，要么形成了大的蛋白质聚集体，超出了Western-blotting的转移限制。为了测试是否形成聚集体以及它们是否可逆，样品在5 mM H孵育几分钟后用5 mM的还原剂β-巯基乙醇处理₂O₂。在β-巯基乙醇中，检测到大量的Rap2.4a单体₂O₂由自身形成的可逆高分子量配合物(图2)4右)。

半胱氨酸残基是蛋白质氧化还原调控的典型靶点。Rap2.4a含有3个半胱氨酸残基，位于dna结合基序(aa 141 - 209)外的N端和c端结构域的113、286和302位置。它们在ap2转录因子家族的ib - erf亚家族中并不保守，并且对Rap2.4a具有特异性(数据未显示)。通过基于平衡的氧化还原滴定，测定了Rap2.4a单体向二聚体转变的中点氧化还原电位为-269 mV(图2)。4 b）.当氧化还原电位高于-262 mV时，低聚物的相对数量开始增加。4 b)，这与在氧化条件下发生寡聚化的观察结果一致(图2)。4）.由于难以定量地印迹聚集体(见图2)。4)，形成了大量不同的聚集体(图2)。4)，则不可能确定诱导聚合的精确氧化还原平衡。从图3所示的观测结果来看。4和4 b认为这是一个由高氧化条件促进的渐进多步骤过程。

Rap2.4a缺失对T-DNA插入系基因表达的影响

Rap2.4a在根和芽中表达(图2)。5左)。与2CPA转录量一样，施用50 mM抗坏血酸后，叶片中Rap2.4a mRNA水平下降(图2)。5中)和糖(图2)。5右)。

的在足底在T-DNA插入系中评估Rap2.4a在2CPA表达中的作用拟南芥。Rap2.4a基因在ap2型dna结合位点上游被中断(Salk_091212;Rap2.4a-KO)。因此，Rap2.4a- ko系缺乏Rap2.4a mRNA(图2)。5 b）.从回交的F2后代和索尔克系的T2后代中选择了几个独立的纯合子进行分析。

在rap2.4 a- ko系中，2CPA转录物水平降低(图2)。5 b和5度）.与此同时，编码主要叶绿体Csd (At2g28190)、基质和类囊体结合抗坏血酸过氧化物酶(sAPx: At4g08390;tAPx: At1g77490)，应激诱导的adp -葡萄糖-焦磷酸化酶(ApL3;At4g39210)， Rieske蛋白(PetC;At4g03280)和编码光收集复合物亚基的几个转录本(如Lhcb4.1 (At5g01530)， Lhca2.1 (At3g61470)和Lhca5 (At1g45474))比野生型植物少(图1)。5度）.尽管2CPA转录在野生型植物中被抗坏血酸抑制[11),(图。5 b)， Rap2.4a-KO细胞系的转录本水平升高(图2)。5 b）.

在rap2.4 -a - ko中，已知的可被ROS诱导的部分基因，如转录因子ZAT10 (At1g27730)和胞质抗坏血酸过氧化物酶Apx2 (At3g09640)的转录水平略有升高，正如质体青素(PetE: At1g20340)和乙烯诱导的drebp类似Rap2.4b (At1g78080;Lin et al.， 2007)。包括叶绿体靶向Ib-ERF Rap2.4c (At2g22200)在内的其他三种Ib-ERF转录因子的转录量[28]，叶绿体GR仅比野生型降低2 ~ 19%。

Rap2.4a断裂对环境稳定性的影响

在适应受控环境条件后，Rap2.4a-KO t - dna插入系仅表现出微妙的表型:叶绿素水平略有下降，叶片变大8%(图2)。6和6 b）.在控制条件下(连续100 μmol m 10 h)， 3组独立的20株植株进行6周的预培养²年代¹）.之后，它们被转移到温室，暴露在自然波动的光线条件下。经过两次云间变化(最大光强:80 μmol量子m)²年代¹;14 h光照)和2个晴天(最大光照强度500 μmol量子m)²年代¹;14 h光照)后，Rap2.4a-KO株系逐渐出现严重褪绿、花序发育迟缓、花序较粗且分枝较少、叶片面积增大等胁迫表型(图2)。6摄氏度）.叶绿素含量平均比野生型减少27±15% (n = 60)，叶片面积平均增加183±63% (n = 60)。总的来说，47%的Rap2.4a-KO植株的叶绿素含量至少下降了50%。在61%的植物中，最大的5片叶子的叶片面积至少是平行生长的野生型植物最大叶子的两倍(数据未显示)。

2CPA转录在强大的发育调控之上受氧化还原调控，这与叶绿体发育和绿化有关[4，11，20.，30.］．氧化还原调节是一种微调机制，使叶绿体蛋白的核表达与实际环境参数相协调[4，11，20.，30.］．在一个单一的混合屏幕独联体-与2CPA基因氧化还原敏感启动子元件结合的调节蛋白，分离到转录因子Rap2.4a (At1g36060)。Rap2.4a以氧化还原依赖的方式与ce3样元件结合(图2)。1;选项卡。2)，并在控制和轻度氧化条件下激活2CPA表达(表2)。1）.虽然2CPA启动子中的ce3样元件与ABRE仅在一个碱基上不同(ACGC vs. ACGT)，但Rap2.4a特异性地结合到ce3样元件上。

根据Nakano等人的命名法[23]，他最近将122个ap2型转录因子分为12个分支，分离的转录因子Rap2.4a是8个b类erf蛋白之一，具有保守的ap2结构域，但具有高度变异的N和c端[23］．到目前为止，有两类b- erf已被部分表征:Rap2.4b (At1g78080)在拟南芥中过表达时可与DREBP互补并阻断乙烯信号传导[27］．Rap2.4c (At2g22200)翻译后靶向叶绿体，在那里它可能接管一个特定的，迄今为止未知的功能[28］．

Rap2.4a敲除谱分析(图2)5)证明Rap2.4a与Rap2.4b不同，没有被同源和类似的转录因子完全补充。因此，Rap2.4a在植物基因调控中具有特定的功能。缺少Rap2.4a时，几个基因的表达受损(图2)。5)和无rap2.4 a (Rap2.4-KO)的植物更容易受到波动的环境条件的影响(图2)。6）.

Rap2.4a与DNA的结合受到氧化还原调控。在强还原和强氧化条件下省略。2）.从在体外分析必须预期，在这些条件下，蛋白质分别单体化或寡聚化。在两者之间，在受控和轻微氧化的条件下，转录因子处于二聚体状态(图2)。4）.由于Rap2.4a激活了这些条件下的基因表达(见表1)。1,无花果。2)，得出二聚体Rap2.4a刺激启动子活性的结论。

蛋白质的氧化还原调节通常通过巯基二硫调节来维持。在转录因子Rap2.4家族中，Rap2.4a具有明显的半胱氨酸残基特征。虽然缺失了一个在其他组成员中保守的半胱氨酸残基，但位置113、286和302的半胱氨酸残基是Rap2.4a所特有的。氧化还原依赖性寡聚化可能表明分子间二硫化物的形成和/或结构变化，从而促进异质或同质络合物的聚集并最终失活(图2)。4选项卡。2）.

在活的有机体内和在体外基因表达分析(图2)2和5;选项卡。1和2)证明Rap2.4a通过氧化还原依赖的结合和激活赋予2CPA启动子氧化还原响应性(图2)。4和选项卡。1和2）.此外，Rap2.4a可得性还影响其他参与植物适应环境变化的核编码叶绿体蛋白的表达。ros调控的ZAT10转录物水平升高[8]和应力诱导的Rap2.4b [27研究表明，Rap2.4a功能可以拮抗在较高应激阈值下激活的次级信号级联。由于在共调控基因的启动子中未发现同源Rap2.4a结合位点(数据未显示)，因此假设其他抗氧化酶通过迄今未知的机制间接共调控。通过Rap2.4a-KO系与2CPA反义系的比较，可以排除由2CPA mRNA或蛋白可用性引起的串扰。Rap2.4a更有可能触发次级转录因子，进而激活叶绿体抗氧化酶的其他核基因。

从Rap2.4a单体到二聚体的活化转变的中点氧化还原电位在pH 7.0时为-269 mV(图2)。4 b）.它比谷胱甘肽(E_hc= -230 mV)，但低于大多数硫氧还毒素(-290 ~ -300 mV) [31，32］．谷胱甘肽库的适度氧化，如由光合作用和硫氧还毒素繁殖引起的，以及NAD的氧化还原平衡(P)⁺/NADPH和谷胱甘肽系统[15]，可能足以激活rap2.4 a依赖基因的表达。更强的氧化还原失衡会通过聚集形成使Rap2.4a失活(图2)。4;选项卡。2)，从而支持ROS的积累(图2)。5，6，7）.Rap2.4a过表达在可控和轻度氧化条件下促进2CPA表达，在还原条件下不影响2CPA表达(见表2)。1）.由此得出结论，Rap2.4a仅在二聚体状态下赋予其激活电位(图2)。7）.

Rap2.4a影响叶绿体蛋白的核表达，从抗氧化酶到光收集蛋白(图2)。5）.质体醌池的氧化还原状态、代谢氧化还原信号和活性氧被认为是光合电子压力增加导致代谢平衡逐渐偏离的信号[12］．在Rap2.4-KO中，响应质体醌库氧化还原状态的PetE转录物水平[12]，表明系统间电子传递链的还原状态较高。ros标记基因ZAT10的转录水平略有增加，该基因编码一种强诱导的转录因子，可激活胞质Apx的表达[8]，其靶基因Apx2编码ros诱导的胞质抗氧化酶[33]，在rap2.4 - ko线中(图2)。5)表明Rap2.4a在野生型植物中拮抗ros信号，并将Rap2.4a依赖的基因表达调控与胞质抗氧化防御机制的调控区分开来。这一观察结果与……的分析一致rimb-突变体，这些突变体被筛选为2CPA启动子活性降低[18]，提示编码叶绿体抗氧化酶的基因的调控独立于胞质抗氧化剂的基因调控。对于ros信号的传递，特定的转录因子，如ZAT10 [12]，已被描述。现在，Rap2.4a的特性揭示了第一个解释叶绿体抗氧化酶核表达氧化还原调控的机制。

Piippo等。[4]最近假设光系统I的受体可用性，它调节2CPA的转录活性[11]，对核基因表达的影响比质体醌池的氧化还原状态更强。研究表明，转录因子Rap2.4a是一种具有氧化还原感觉功能的氧化还原调节剂。Rap2.4a参与触发2CPA氧化还原盒的信号通路[11]，它响应光系统I的受体可用性[11］．Rap2.4a-KO细胞系的灵敏度(图2)6)表明Rap2.4a通过控制叶绿体抗氧化和光合系统的核表达来调节对自然环境波动的耐受性(图2)。5）.Rap2.4a作为正/负调节因子(图2)。4和7选项卡。1和2）.Rap2.4a在中度氧化还原失衡时被激活，但在严重应激时失活(见表1)。1和2)，这与应用ros后编码叶绿体抗氧化剂的核基因转录物水平下降一致[4，9，34］．结论Rap2.4a控制植物风险评价。它可以在诱导驯化反应和避免分子胁迫(如ros控制的光合电子传递失活)之间转换基因表达。

植物材料和生长条件

植株生长在蛭石、珍珠岩和泥炭苔藓的1:1混合物上，光照100 μmol量子m，光照14 h²年代¹在55%相对湿度或温室自然波动光照条件下(14天长度;阴天:20 ~ 80 μmol量子m²年代¹;晴天:50 ~ 500 μmol量子m²年代¹， 20 - 25°c)。在平板上无菌生长按照[11］．

的单混合屏拟南芥互补脱氧核糖核酸库

氧化还原敏感的2CPA启动子片段[11]用引物AAAAACTCGAGCATAATAATGAA和AAAAACTCGAGGCTTCTTCACTTA进行PCR扩增，克隆到pONE1的Xho I位点[35]生成诱饵结构pONE1-2CPA。用50 Ng的an对携带pONE1-2CPA的酵母菌Y187进行转化拟南芥pAct2悬浮培养cDNA文库[22]，在SD介质上选择[36]缺乏组氨酸、色氨酸和亮氨酸，并补充1 mM的3-氨基三唑(3AT)。克隆在含有5 ~ 40 mM 3AT的SD培养基上重新筛选。根据标准方案分离质粒[11变成了大肠杆菌TOP10作进一步分析。

RNA分离和RT-PCR

总RNA的分离方法见[20.]，在扩增线性期进行cDNA合成和RT-PCR，按[11]及[18的基因特异性引物，其特异性通过扩增产物的测序来控制。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

SDS-PAGE按照[20.］．对于非还原性凝胶，不向加载缓冲液中添加DTT。对于天然凝胶，运行缓冲液和上样缓冲液不加SDS，样品在上样前不加热。

重组蛋白的表达和纯化

利用引物Rap2.4-S (ATGGCGGATCTCTTCGGTG)、Rap2.4-A (TCACGATAAAATTGAAGCCC)、Rap2.6- s (ATGGTGTCTATGCTGACTAATG)和Rap2.6- a (GTTAGTTAACCAAAAGAGGAG)分别扩增Rap2.4a和Rap2.6的全长cdna，并克隆到pCR-T7/NT-TOPO (Invitrogen, CA)中。在转化BL21的1个LB培养物中，以A的光密度诱导表达₆₀₀= 0.6-0.8, 2 mM IPTG。4 h后，his标记的蛋白在Ni上亲和纯化^{2 +}-NTA琼脂糖树脂(Qiagen，德国)。

电泳迁移率转移测定(EMSA)

2.5 μg重组蛋白和20 ng DNA在6-7%天然聚丙烯酰胺凝胶上分离(rotiphoose -30 (Roth, Germany)稀释0.5倍TBE [36]，直到溴酚蓝染料沿凝胶长度迁移了约2/3。在0.5 × TBE室温下孵育20分钟后，在硝化纤维素膜(用于蛋白质检测)或Hybond-N上电泳印迹⁺(Amersham Biosciences, UK)(用于核酸检测)使用半干吸墨纸。根据供应商的协议，分别用抗his抗体(Amersham Biosciences, UK)、Light Shift Chemiluminescence EMSA Kit (Pierce, USA)和SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, USA)检测his标记的蛋白和生物素化pcr产物。

PCR扩增2CPA翻译起始位点上游-294 ~ -721启动子区，片段1为AAACCATGGCATGCATAAGAGTC和TCCGGGAAATCCAGG，片段2为aaaccatggcataagtc和gatgacggagaggatg，片段3为TCTCCGTCATCGAAC和GCAGAGTTTCTGGGT，片段4为aaaccatggagaact和GCGTGACCGGAGACATG，片段5为CTCCGGTCACGCGATTCAAC和CTCTCTTCACTTGGTTTAC。为了生成13 - 20bp的双链DNA片段，将合成的匹配单链寡核苷酸在室温下退火。

Rap2.4a的dna结合亲和力分析

为了定量结合亲和力，将2 Ng重组蛋白与100 pmol片段F5在0.5 × TBE或0.5 × TBE中添加5 mM DTT或H孵育10 min₂O₂用琼脂糖凝胶电泳0.5 × TBE分析未结合F5。按照RT-PCR产品的定量描述，在5个平行处对游离F5进行定量。使用QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen)从凝胶的120 - 200 bp区域洗脱F5片段，进行PCR扩增(10个循环)。

2CPA启动子的诱变及瞬时表达分析

寡核苷酸定向诱变按照[37]源自2CPA:LUC质粒[11]与2ppa - hindiii引物(GATCAATTAAGCTTAGAGTTG)和引物2- r (GTTGAAT)AACGTGACCGGAG)的PCR1和引物2 (CTCCGGTCACGTTatcaac)和2ppa - ncoi (AGACGCCATGGCTGCTACACAC)。用2ppa - hindiii和2ppa - nco I从PCR1和PCR2的凝胶纯化产物中扩增出1425 bp的产物。与用2ppa - hindiii和2ppa - nco I扩增出相应的野生型启动子一样，用2CPA:LUC [11]作为模板)，将其克隆到pEYFP (Clontech, CA, USA)的Hind III和Nco I位点(2CPA)_wt: YFP;2注册会计师_{无足轻重的人}: YFP)。

荧光反应测定和定位研究

Rap2.4a cDNA克隆到35scp - nost载体的Age I和Eco RI位点[38取代CFP。此外，35scp - nost载体经Age I/Eco RI消化后重新连接作为空载体对照。的分离和饱和转染拟南芥等量35S:Rap2.4a, 35S:CFP-NosT和2CPA的叶肉原生质体_wt:YFP或2CPA_{无足轻重的人}YFP质粒DNA分别按照[18］．

对于Rap2.4a和ABI5的cdna定位研究[39]与YFP-cDNA n端融合，在CaMV35S启动子的控制下在转染原生质体中表达。YFP的分布可以通过共聚焦激光扫描显微镜或Ascent FL荧光计拍摄的2D图像进行定量。

光度反应试验

试验构建体被转染到纯合子转基因拟南芥系T19-2分离的叶肉原生质体中[11]，并在含有5毫米荧光素(Duchefa)和6毫米ATP的100毫米磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中进行3小时分析，使用Ascent FL光度计。

氧化还原滴定法

用1 μg his标记的Rap2.4a进行氧化还原滴定，按[6]在150 μl MES缓冲液(100 mM)中添加10 mM氧化和还原DTT的混合物，通过氧化还原滴定调节到各自的氧化还原电位。在各自的平衡状态下，加入50 mM的碘乙酰胺，阻断游离巯基，阻止硫-二硫交换，抑制游离半胱氨酸的裂解后氧化。Rap2.4a的四级结构通过非还原sds凝胶电泳和随后的抗his抗体Western blot分析得到[18］．使用gelscan软件包(BIOSCITEC, Marburg, Germany)对蛋白量进行定量。

T-DNA插入突变体的鉴定与分离

从NASC (Loughborough, UK)获得RAP2.4a (Salk_091212) T-DNA插入系，用引物Rap2.4-F (ATGGCGGATCTCTTCGGTG)、Rap2.4-R1 (TCACGATAAATTGAAGCCC)和T-DNA左缘salkLBm (TGGACCGCTTGCTGCAAC)进行T-DNA插入分析。

加入数据

ApL3: At4g39210;APX2: At3g09640, 2CPA: At3g11630, chlGR: At3g54660;Csd2: At2g28190;Lhca2.1: At3g61470;Lhca5: At1g45474;Lhcb2.2: At2g05070;PetC: At4g03280;皮特:At1g76100;Rap2.4a: At1g36060;Rap2.4b: At1g78080; Rap2.4c: At2g2220; Rap2.4d: At1f22190; Rap2.4e: At4g39780; sAPx: At4g08390; tAPx: At1g77490; ZAT10: At1g27730

APx型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

2 cp:

2-Cys酶类

2注册会计师:

2- cpa基因的启动子

aa:

氨基酸

阿坝:

脱落酸

沛富:

ABRE-binding蛋白质

ABRE:

ABA-response元素

AP2:

apetala-2

3:

3-amino-1 2 4-triazol

CE3:

耦合元件3

CFP:

青色荧光蛋白

样品形貌:

共聚焦激光扫描显微镜

Csd:

锌超氧化物歧化酶

DREBP:

干旱响应元件结合蛋白

EMSA:

电泳迁移率位移分析

小块土地:

乙烯反应的因素

MAPK:

有丝分裂原活化激酶

ROS:

活性氧

硫氧还蛋白:

硫氧还蛋白

Y1H:

yeast-one-hybrid

YFP:

黄色荧光蛋白。

我们感谢Czaba Koncz(科隆植物育种研究MPI)、Imre Sommssich(科隆植物育种研究MPI)和Fred Rook(哥本哈根皇家兽医和农业大学)为我们提供了cDNA文库和酵母质粒。感谢布隆迪政府的支持。

从属关系

1. 比勒费尔德大学植物生物化学与生理学院，德国比勒费尔德33501

   Jehad Shaikhali, Isabelle Heiber, Thorsten Seidel, Elke Ströher, Stefan Birkmann和Karl-Josef Dietz

2. 海因里希-海涅大学植物科学学院，德国塞尔多夫，40225

   海科·希特勒和玛格丽特·拜尔

相应的作者

对应到Margarete Baier。

作者的贡献

JS进行了酵母-单杂交分析，进行了在体外参与了CLSM分析、统计分析和手稿的起草。IH进行RT-PCR分析。TS进行了CLSM实验。ES进行了如图所示的氧化还原滴定4 bHH参与了T-DNA插入系的表型分型。SB为Rap2.4a-GFP的定位提供了构建物。KD部分参与了实验的设计和手稿的起草。MB设计并协调了项目，进行了图中所示的实验。6和选项卡。1和2并起草了手稿。

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