snf1型丝氨酸苏氨酸蛋白激酶SAPK4调控水稻胁迫响应基因表达

背景

植物通过激活复杂的细胞内信号级联反应细胞外感知的非生物胁迫，如低温、干旱和盐度，调节驯化生化和生理变化。蛋白激酶是真核生物适应环境变化的主要信号转导因子。在本研究中，我们鉴定了蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2 (SnRK2)的功能。SAPK4水稻在盐胁迫下的反应。

结果

平移融合SAPK4与绿色荧光蛋白(GFP)相比，在细胞质和细胞核中均有亚细胞定位。检查…的作用SAPK4在耐盐方面，我们培育了水稻过表达的转基因水稻植株SAPK4由CaMV-35S启动子控制。诱导表达SAPK4对幼苗和成熟植株在盐胁迫下的萌发、生长发育均有促进作用。对盐胁迫的反应SAPK4过表达水稻积累的钠较少⁺和Cl^-光合作用得到了改善。SAPK4发现了在离子稳态和氧化应激反应中起调节作用的基因:液泡H⁺- atp酶，Na⁺/小时⁺逆向转运NHX1Cl^-通道OsCLC1还有过氧化氢酶。

结论

我们的结果表明SAPK4在盐度作用下调节离子稳态和生长发育SAPK4作为植物盐胁迫驯化的调节因子。植物胁迫适应信号元件的鉴定提供了一种强有力的方法来鉴定适应环境变化机制的转录激活因子，有可能提高作物植物的耐受性。

植物对寒冷、干旱和盐度等非生物胁迫的反应是通过激活复杂的细胞内信号级联来调节生化和生理适应。在真核生物中，蛋白激酶是参与代谢、生物和非生物胁迫(包括主要环境因子盐度)信号转导的关键元素。缺乏蔗糖非发酵1 (SNF1)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(与哺乳动物amp活化蛋白激酶有关)的酵母突变体的生长被NaCl严重抑制，这表明该激酶在调节盐胁迫适应机制方面的主要功能[1，2］．在植物中，盐诱导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)已经被鉴定出来，例如，从具有SIMK的紫花苜蓿中，它被MAPK激酶SIMKK激活，MAPKs参与渗透胁迫信号传导已在烟草和烟草中得到证实答:芥［3.- - - - - -5］．植物丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族中的应激诱导成员已在钙依赖蛋白激酶(CDPKs)、cdpk相关激酶(CRKs)、钙调素依赖蛋白激酶(CaMKs)以及与酵母SNF1相关的SnRKs中被鉴定出来。SnRK1亚群成员在环境胁迫下的代谢调节中发挥作用，并在植物发育中发挥作用[6- - - - - -8］．SnRK2和SnRK3类型的蛋白激酶对植物是特异性的，在这些群体的几个成员中显示了ABA信号的含义[6，9- - - - - -11］．答:芥SnRK3激酶在糖和ABA信号通路及盐胁迫应答中的作用[12- - - - - -14］．SnRK3 SOS2与Ca相互作用^{2 +}传感器SOS3和质膜Na⁺/小时⁺反转运体SOS1参与细胞内钠的调节⁺内稳态通过SOS通路被激活[15］．

有关胁迫诱导信号通路的重要知识主要来源于对胁迫敏感模型植物的研究答:芥而水稻的调控信号元件很少在自然耐旱物种中被发现。

本研究的实验对蛋白激酶进行了表征SAPK4这是在兼性耐盐草的盐胁迫调节基因筛选中发现的羊茅属rubrassp。litoralis(红色羊茅)。在盐敏感稻系IR29上的表达分析显示，盐敏感稻系IR29的盐敏感性降低SAPK4成绩单。大米的过度表达SAPK4水稻在苗期和成熟期对盐胁迫的耐受性增强。在转基因水稻中，Na⁺和Cl^-堆积减少表明受累SAPK4离子稳态的调节。本研究的结果表明SAPK4是植物盐胁迫适应的决定因素。识别在自然耐胁迫植物的胁迫适应中起作用的信号转导元件，为识别对环境变化的适应性机制的转录调节因子提供了有力的工具，这些调节因子有可能提高作物植物的耐受性。

盐依赖性表达的差异SAPK4在大米和f . rubrassp。litoralis

这项研究开始于盐敏感水稻品种中盐胁迫诱导的转录反应的比较分析栽培稻(ssp。籼稻)IR29系和耐盐草f . rubrassp。litoralis．研究人员发现，这两个物种对盐度的反应不同。f . rubrassp。litoralis其特点是具有很强的耐盐性，耐500 mM NaCl，并在水培培养中在250 mM NaCl下继续生长和发育(未显示)。相比之下，稻系IR29暴露在150 mM NaCl浓度的盐中会严重受损[16，17］．丝氨酸苏氨酸蛋白激酶SAPK4在f . rubrassp。litoralis富含盐反应基因。这种实验方法允许识别est序列f . rubrassp。litoralis在核酸和氨基酸水平上有89%和93%的相同SAPK4从大米(未显示)。本研究旨在详细分析激酶在植物盐驯化中的作用。半定量RT-PCR(图;1)和northern型RNA杂交(未显示)，表达SAPK4在非胁迫对照植物中检测到f . rubra和米饭。在f . rubra， 125 mM盐胁迫降低，250 mM和500 mM NaCl胁迫提高SAPK4．在盐敏感水稻品种IR29中，125 mM NaCl处理48 h后，土壤中盐含量降低SAPK4转录丰度。由于致死性，250 mM和500 mM NaCl不用于水稻。

为了分析SAPK4蛋白的亚细胞定位，构建了SAPK4在35S-CaMV启动子的驱动下，生成融合绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的开放阅读框cDNA。在共聚焦激光扫描显微镜下，对洋葱表皮细胞进行转化，并监测GFP的荧光发射(图2)。2)．在0.5 × MS营养培养基中培养24小时的细胞，细胞核中检测到强烈的GFP信号(图2)。2 a, B)．用空载体作为阴性对照轰击的细胞显示没有荧光(图2)。二维)作为阳性对照，洋葱表皮细胞用GFP的翻译结构进行转化。在本实验中，GFP在细胞各处均有定位，信号最强的是细胞质和细胞核(图2)。2摄氏度)．从洋葱表皮细胞系统得到的结果来看，答:芥分离出叶肉原生质体，并与SAPK4-GFP转录结构相似地进行转化。转化原生质体孵育24小时后，在细胞质室中也检测到gfp衍生的荧光发射(图2)。2 e)．

表达的SAPK4在转基因水稻中

为了产生转基因水稻，用含开放阅读框水稻的载体转化了盐敏感品种IR29SAPK435S-CaMV启动子控制下转录过表达的cDNA。通过对卡那霉素抗性和卡那霉素抗性基因的存在，鉴定出三个独立的转基因水稻株系S1、S4和S5。T2代植株被用于进一步研究SAPK4在植物耐盐性方面。在非胁迫植物中，转录水平适度增加SAPK4与野生型水稻相比，转基因株系中是否能检测到SAPK4水稻中的mRNA(图;3.)．野生型和转基因株系在表型、生长速度和12周龄前的发育(未显示)方面没有显著差异。暴露在高浓度NaCl环境中的转基因植株积累更多SAPK4与野生型水稻相比(图;3)，并对其盐胁迫响应进行分析。在用空植物表达载体转化的两个独立水稻系中，转录量为SAPK4与未转化的野生型水稻相比没有变化(图;3.)，这些植物的表型也没有改变(没有显示)。这些数据表明，观察到的影响SAPK4转基因水稻的过表达是由于SAPK4而不是空的植物表达载体。

SAPK4水稻是否与耐盐胁迫有关

野生型水稻和转基因品系在对照条件下水培培养到3周龄，随后暴露在150 mM NaCl中。在盐处理第7天，转基因株系表现出更好的耐盐性。3 b, C)．盐处理的野生型水稻表现出生长抑制，并发生褪绿和坏死(图2)。3.)．相比之下，转基因株系的生长几乎不受影响，褪绿现象也不明显。3 b)．通过试验研究了耐盐性增强对NaCl浓度增加的发育依赖性SAPK4，以野生型水稻和T2 S1、S4幼苗进行发芽试验。对照和转基因植株分别在对照营养培养基和添加NaCl的培养基上萌发。结果表明，盐处理使野生型水稻的萌发率降低了约20%，而转基因品系的萌发率没有受到显著影响(图2)。4)．此外，盐胁迫抑制了野生型对照植物的叶片生长，而转基因株系幼苗的叶片大小与非胁迫对照幼苗相比没有显著变化(图2)。4 b)．

SAPK4调节盐胁迫水稻离子积累

Cl的积累^-在野生型水稻和转基因系中进行了检测，以测试是否SAPK4影响Cl的积累^-在盐胁迫下。水稻植株生长到3周龄后，用150 mM NaCl处理48小时。在这些胁迫条件下，株系S1和S4的Cl含量仅为60%^-野生型水稻的含量(图;5)．通过比较Na的含量来研究阳离子稳态⁺K⁺， Ca^{2 +}在野生型水稻和S4系植物中，这些水稻和S4系植物暴露在上述相同的胁迫条件下。S4系积累了60%的Na⁺80% K⁺与野生型植物相比，钙含量无显著差异^{2 +}观察到累积(图;5 b)．作为生理上的参考叶绿素一个测定了荧光动力学，计算了光合产量。在150 mM NaCl胁迫下处理48小时，野生型水稻的光合活性下降，而同一品系的S1和S4与非胁迫对照植株相比没有显著变化(图2)。5度)．

液泡atp酶，液泡Na⁺/小时⁺逆向转运NHX1，电压门控Cl^-通道和过氧化氢酶是明确的盐依赖调控靶点(图2)。6)，研究它们在盐胁迫下野生型和转基因水稻中的转录，以确定盐胁迫下可能调控的靶基因似乎很有趣SAPK4．液泡atp酶的表达水平，液泡Na的表达水平⁺/小时⁺逆向转运OsNHX1Cl^-通道OsCLC1和过氧化氢酶同工酶A在野生型和转基因水稻中进行了检测。在100 mM NaCl处理48 h后，v - atp酶亚基B和过氧化氢酶的转录量均增加OsNHX1而且OsCLC1对NaCl胁迫的响应降低(图;6 b)．此外，我们对分析质膜钠的转录也很感兴趣⁺/小时⁺逆向转运SOS1但在野生型和转基因水稻中均未检测到其表达。

干旱、寒冷和盐度等环境压力限制了水稻的产量，而水稻是最重要的作物之一。实验方法如正向和反向遗传学和转录组分析已被选择来确定调控水稻适应环境变化的分子关键因素。水稻转录因子过表达OsDREB1A在答:芥胁迫诱导基因的诱导表达和对干旱、高盐和冰冻胁迫的更高耐受性[18］．例如，通过海藻糖生物合成基因a Na的转基因表达，提高了水稻的耐盐性⁺/小时⁺反转运蛋白，一种水通道蛋白，Ca^{2 +}依赖性蛋白激酶OsCDPK7，以及丝裂原活化蛋白激酶OsMAPK5［19- - - - - -23］．将高产但对胁迫敏感的水稻品种与抗逆性增强的水稻品种进行比较表明，盐敏感水稻品种受到延迟胁迫诱导的转录反应的阻碍[24］．

本研究建立了耐盐草的减法cDNA文库f . rubrassp。litoralis筛选可能受盐胁迫调控不同的转录本f . rubrassp。litoralis耐盐水稻IR29。已鉴定的蛋白激酶SAPK4该激酶属于水稻SnRK2(蔗糖非发酵1相关蛋白激酶2)家族，并证明该激酶介导水稻盐胁迫信号通路。水稻的本构过表达SAPK4通过干扰离子稳态，维持正常光合作用和诱导氧化应激反应来增强水稻的耐盐性。我们的研究结果表明，盐敏感作物品种水稻和相关的耐盐草f . rubrassp。litoralis在盐依赖调节方面各不相同SAPK4这显然在盐胁迫信号中起着作用。在过度表达转基因水稻植株中，盐适应分子机制的激活可能得到改善SAPK4．因此，我们的结果有助于理解调节植物盐驯化的信号因子。此外，表征SAPK4识别直接或通过该激酶的次要作用调节的靶基因扩展了我们对水稻SnRK2激酶功能的认识。

与酵母snf1型激酶同源的植物snf1相关激酶(SnRK)根据结构域结构被分为SnRK1、SnRK2和SnRK3三个亚群[6，7，25］．据报道，snrk1型蛋白质在植物发育和碳代谢中起作用，如小麦的花粉发育和酶的调节，如小麦胚胎中的α -淀粉酶和马铃薯块茎中的adp -葡萄糖焦磷酸化酶[26- - - - - -28］．小麦snrk2亚群蛋白PKABA1因脱水、寒冷和渗透胁迫而上调，并参与脱落酸和赤霉素信号传导已被证明为大麦同源物[29- - - - - -32］．Kobayashi等人[32的转录分析SAPK4在对照条件、ABA、NaCl和甘露醇处理下，30日龄水稻叶片、鞘和根的转录水平提高，并发现ABA和NaCl处理提高了根系和叶片的转录水平。在这项工作中，作者发现SnRK2家族成员通过磷酸化调控[32］．在其他研究中，在水稻基因组中可以识别出10个被高渗胁迫激活的snrk2，其中3个蛋白对脱落酸有反应答:芥在渗透胁迫信号传导中，10个snrk2中有9个受高渗调控，而非激酶的冷指示功能调控[33，34］．SnRK2.8的过表达提高了水稻的耐旱性答:芥但不调节气孔运动，而SnRK2.6影响aba诱导的气孔关闭[35］．委员会成员答:芥SnRK3基团与钙结合蛋白相互作用，在糖和脱落酸信号通路以及盐胁迫反应中发挥作用[14］．

为了更详细地描述大米SAPK4的亚细胞划分SAPK4蛋白通过GFP融合定位，发现蛋白激酶分布在细胞核和细胞质中。在酵母中，SNF1激酶的β亚基调节其在细胞核、液泡和细胞质中的亚细胞定位[36］．通过GFP蛋白融合，研究表明SNF1激酶β亚基以葡萄糖调节的方式将激酶导向细胞核[36］．酵母SNF1激酶和RNA聚合酶II全酶介导的信号转导途径之间的直接调控相互作用被认为可以激活葡萄糖反应基因的转录[37］．相应地，水稻的亚细胞定位SAPK4在植物细胞的细胞质和细胞核中，激酶的转录调控机制可能是相似的。

我们培育了过度表达的转基因水稻系SAPK4．我们发现转录水平增加了SAPK4然而，与非胁迫控制条件下的野生型水稻相比，盐处理下的差异更为明显。在其他转录本上也描述了类似的效果。Shi等。[46]报告质膜Na转录水平没有增加⁺/小时⁺逆向转运SOS1在SOS1-overexpressing答:芥当CaMV-35S启动子驱动过表达时。在NaCl处理下，转录水平升高，提示转录后调控SOS1．作者建议SOS1在没有盐胁迫的情况下，转录本可能不稳定，而盐胁迫导致转录本的稳定SOS1成绩单。

表达的SAPK4在NaCl浓度增加的条件下，转基因水稻幼苗期和成熟期的萌发、生长和发育均得到改善，而野生型水稻在相同条件下表现出严重的发育和生理抑制。的SAPK4过表达植株积累的钠较少⁺和Cl^-比盐胁迫野生型水稻对盐胁迫的反应要明显。K⁺/ Na⁺的比值有所增加SAPK4意义上的植物。同时，盐胁迫转基因水稻的光合作用没有受到损害。目的基因的鉴定表明SAPK4调节已知有助于离子稳态和氧化应激反应的基因的表达:液泡H⁺- atp酶，Na⁺/小时⁺逆向转运NHX1Cl^-通道OsCLC1，和过氧化氢酶。

液泡H⁺- atp酶介导植物细胞膜腔内质子的电致易位，激活细胞扩张、二次活化转运和适应环境胁迫(如盐诱导的二次活化钠)等过程⁺nhx型Na输运⁺/小时⁺液泡体的反转运体[38，39］．受刺激的转录、翻译和酶活性分别被称为盐生植物Mesembryanthemum crystallinum而且碱蓬莎莎和，例如，从v - atp酶亚基A，而不是从亚基D答:芥［38，40- - - - - -42］．空泡nhx1型Na过表达⁺/小时⁺介导液泡钠的转运蛋白⁺番茄和水稻的盐胁迫43，44］．SAPK4然而，过度表达水稻植株表明转录量减少OsNHX1钠减少⁺表明耐盐性的提高是由细胞钠引起的⁺离子的排除而不是液泡的隔离。例如，抑制Na⁺/ K⁺co-transporterHKT1减少钠⁺在小麦根系中积累，导致耐盐性提高[45]，减少Na的积累⁺是在答:芥通过过度表达Na⁺/小时⁺逆向转运SOS1调节细胞对钠的挤压⁺在质膜上[46］．压敏电阻器Cl^-在调控膜电位和细胞pH稳态方面，植物clc -型氯离子通道参与调控气孔运动已被提出[47］．在水稻中，clc型通道的表达OsCLC1分析显示盐依赖的转录调控[48］．在本工作中转基因过表达SAPK4在水稻中抑制了Cl的积累^-以及转录OsCLC1表明激酶参与盐处理水稻中阴离子稳态的调节。Cl的下调作用^-频道OsCLC1通过限制氯来维持细胞内的渗透势^-质膜上的通量被假设为[48］．

除了高盐度的高渗透和超低温效应外，盐胁迫植物还受到次生胁迫的影响，如过度生成活性氧(ROS)。ROS的形成是由盐处理植物的水分亏缺导致CO减少引起的₂NADP的固定和减少再生⁺在卡尔文循环中[49］．活性氧被抗氧化代谢产物如抗坏血酸、谷胱甘肽和生育酚清除，并被解毒酶如超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶清除[50- - - - - -52］．例如，过度表达谷胱甘肽s -转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶可以增加盐胁迫下转基因烟草的生长，过氧化氢酶活性降低的转基因烟草对盐的敏感性增加[53，54］．在本研究中过度表达SAPK4被证明影响过氧化氢酶在水稻中的表达。

在未来的研究中，确定该酶在水稻盐驯化中的详细功能将进一步促进对盐胁迫植物适应细胞机制的理解。

综上所述，本研究的结果表明SAPK4作为水稻盐驯化的调节器，控制离子稳态和光合活性，并允许在盐度增加的情况下继续生长和发育(图2)。7)．模型总结的实验数据如图所示。7是由的结果推导出来的SAPK4在本研究中，CaMV 35S启动子控制下的水稻过表达。未来的实验使用为例SAPK4T-DNA插入突变体将有助于进一步阐明SAPK4在植物盐适应中的功能作用。本研究在耐盐植物中鉴定盐诱导信号转导元件，并在盐敏感物种中进行转基因表达，这可能是一种有前途的方法，以提高作物物种对盐胁迫的抗性。

植物材料、生长条件和盐胁迫

大米(栽培稻L. indica) var. IR29和羊茅属rubrassp。litoralis在光照14 h (300 μE m^－2证券交易委员会^－1， 25°C)和10h黑暗(21°C)和50%的相对湿度。种子在蛭石中发芽，蛭石浸有经过改良的半强霍格兰营养液[55］．幼苗发芽后10天移栽到曝气水培箱中。对于盐胁迫，在营养培养基中添加最终浓度为125和500 mM的NaCl，无胁迫对照植株平行生长并同时收获。为了进行转录分析，野生型水稻植株生长到3周。实验f . rubrassp。litoralis在6周大的时候进行了类似的生长和发育阶段。野生型和转基因水稻株系生长至8周龄，进行生长和胁迫实验。为了进行发芽分析，野生型和转基因水稻的种子在培养皿中发芽，在无菌滤纸上浸泡一半强度的霍格兰营养液。不同发芽率采用Student's t检验，差异有统计学意义(p < 0.05)。根据植株年龄的不同，选择了不同的NaCl浓度。8周龄的水稻植株分别受到125和150 mM NaCl的胁迫，这是对水稻的严重胁迫[16］．在50 mM NaCl下监测幼苗的萌发和生长。用于基因转录调控的研究SAPK4施加100 mM NaCl中等盐应力。

RNA提取，Northern杂交，cdna阵列杂交，RT-PCR

水稻叶片总RNAF. rubra;litoralis按所述提取[55］．北方杂交以每车道20 μg总RNA进行[55］．5 μg总RNA经M-MLV RT II [H-] (Promega)和20 μl oligo- dt引物合成cDNA。以水稻叶片合成的cDNA为载体，采用基因特异性和反义寡核苷酸引物，以地高辛- dutp (Roche, Germany)为标签，采用PCR方法生成用于Northern检测的cDNA探针。对以下基因进行转录分析:SAPK4(AB125305 LOC_Os01g64970;克隆cDNA引物:5'-CACCATGGAGAAGTACGAGGCG-3'， 5'-TCATATGCGCAGTGAGCTCAT-3'，转录分析引物:5'-TGGCTACTCCAAGTCATC-3'， 5'-TCGTACTCATCTTCCTCC-3')，OsNHX1(LOC_Os07g47100;引物序列:5'-ATCTTCAATGCAGGCTTC-3'和5'-TGCATCCATCCCAACATA-3')，OsVHA-B(LOC_Os06g37180;引物序列:5'-ATTGACAGGCAGCTGCAT-3'和5'-GCAATGTCCATGCTAGGT-3')，OsCLC1(LOC_Os01g65500;引物序列:5'-TGTACAAGCAGGACTGGA-3'和5'-AGATAGGCCTTCACCTCA-3'，过氧化氢酶同工酶A (LOC_Os02g02400;引物序列:5'-GGATGACACCAAGACATG-3'， 5'-TCACGTTGAGCCTATTCG-3')。Actin扩增作为负载对照(引物序列:5'-GTGATCTCCTTGCTCATACG-3'和5'-GGNACTGGAATGGTNAAGG-3')。从每25 μg总RNA中加入地高辛-11- dutp制备阵列杂交探针。用0.5× SSC在42°C下洗涤Northern blot和cdna阵列膜30分钟，以抗地高辛碱性磷酸酶共轭Fab片段和CSPD (Roche, Germany)为底物检测杂交信号。在标准反应中进行RT-PCR分析，如所述[55］．肌动蛋白杂交扩增作为负载对照。密度分析使用Gelscan软件(INTAS，德国)。

构建减法cdna文库

用poly吸引试剂盒(Promega, Mannheim, Germany)从总RNA中分离mRNA。F. rubra ssp的减法cdna文库。根据制造商的方案，用PCR-Select Kit (Clontech, Heidelberg, Germany)合成利托利斯。从盐胁迫处理的F. rubra ssp中获得相同数量的mRNA。将滨海草的叶片和根组织在5周龄和12周龄时分别加入125 mM NaCl、250 mM NaCl和500 mM NaCl，分别处理6 h、24 h、48 h和7 d。从相同发育阶段的对照植物中提取相同数量的mRNA，并与胁迫植物平行收集，用于驱动cDNA。将缺失的cDNA克隆到PCR - topo II (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)中，用嵌套引物1和2R (Clontech)进行PCR扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行分析，并选择产生单条带的产物进行进一步的程序。测序PCR产物(MWG Biotech, SeqLab, Germany)在水稻TIGR数据库中进行BLAST分析。

cdna大阵列的制备，探针的标记和cdna阵列的杂交

PCR产物用QIAquick自旋柱(Qiagen, Hilden, Germany)纯化，用50% (v/v) DMSO溶解。比勒费尔德大学基因组研究中心(ZfG)生成了具有129种功能不同的est的cdna宏阵列。扩增后的PCR产物以3 × 3模式复制转移到尼龙膜上(Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech, UK)，中间留出空白区域用于局部背景减影。膜通过烘烤和紫外交联固定。在使用SuperScript II (Invitrogen)和oligo(dT)引物合成第一链cDNA过程中，从每个25 μg RNA中加入digoxigenin-11-dUTP (Roche, Mannheim, Germany)制备标记检测探针。探针使用QIAquick自旋柱(Qiagen)纯化，以去除未结合的核苷酸。探针在杂交前在100°C变性10分钟。采用与上述北方杂交相同的方法进行杂交。

水稻结构的生成与转化

cDNA的开放阅读框SAPK4采用RT-PCR技术从水稻叶片(var. IR29)中扩增出正义和反义寡核苷酸引物，在pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Netherlands)中克隆。SAPK4cDNA在pK2GW7中亚克隆，在35S-CaMV启动子控制下过表达;在pK7FWG2中亚克隆，在35S-CaMV启动子控制下c端gfp融合过表达[56］．根癌土壤杆菌将该菌株LBA4404进行转化，用于水稻的转化。成熟脱壳水稻种子在乙醇(94%，v/v)中灭菌30秒，在甲醛(0.8%，v/v)中灭菌40分钟，在次氯酸钠(1.8%，v/v)中灭菌。种子在含有两层无菌Whatman纸和7毫升无菌去离子水的培养皿中在42℃下孵育24小时，以允许预发芽。将种子置于含2 mg/l萘乙酸、1 mg/l激动素、55 mM葡萄糖、100 μM乙酰丁香酮(pH为5,2)的共培养液(CCL，改性Chu N6培养基)中浸泡10-15 min农．随后，将种子转移到含有固体共培养介质(含0.7% (w/v)琼脂糖的CCL)的培养皿中，在25°C的黑暗中孵育3天。将种子转移到含有头孢噻肟(400 mg/l)的CCS板上，在25°C下12/12 h(昼夜)光周期下孵育3天。为促进水稻分蘖和根系发育，在不含激素和卡那霉素(50 mg/l)的N6培养基中培养，光周期为12/12 h(昼夜)。所得种子按上述方法杀菌，卡那霉素(50 mg/l)处理发芽。用转基因T2水稻进行了实验。在含50 mg/l卡那霉素的0.5 × MS琼脂培养基上，通过卡那霉素选择标记的RT-PCR对转化水稻种子进行筛选。用空表达载体转化的转基因水稻系作为对照。

原生质体的分离及SAPK4-GFP融合蛋白的亚细胞定位

原生质体是从答:芥并被转换为表达结构，如所述[57］．洋葱表皮细胞转化参照[57］．对于SAPK4-GFP融合蛋白的亚细胞定位，使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica DMRE) [57］．

叶绿素a荧光和氯含量的测定

光系统II的光合量子产量(ΦPSII)由叶绿素计算一个使用Mini PAM (Walz, Germany)从附着的水稻叶片中获得荧光数据。光化光子通量密度为300 μE m^－2证券交易委员会^－1在生长过程中。采用饱和光脉冲(5000 μmol m)激发稳态最大荧光发射^－2年代^－1)．ΦPSII是根据制造商的说明计算出来的。的Cl^-用微量氯计数器(Marius-Utrecht，荷兰)测定叶提取物中的含量。

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft(波恩，德国)的支持。C.J.D.感谢德国DAAD的支持。

从属关系

1. 德国比勒费尔德大学生物学院植物生理生化系，比勒费尔德33615

   Calliste J Diédhiou, Olga V Popova, Karl-Josef Dietz & Dortje Golldack

2. 孟德尔分子植物生物学研究所，维也纳A-1030，奥地利

   奥尔加V波波娃

相应的作者

对应到Dortje Golldack．

作者的贡献

CJD:转基因水稻系的RT-PCR、CLSM分析、生成和鉴定OVP:构造生成、CLSM分析;K-JD:项目设计及监理;DG:结构生成，RT-PCR，项目设计和监督。

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