定量¹核磁共振代谢组学揭示了诱导剂处理的罂粟细胞培养中广泛的初级和次级代谢重编程

背景

罂粟花 （果实)产生多种具有生物活性的苄基异喹啉生物碱，并已成为研究植物生物碱代谢的模式系统。这种植物是麻醉镇痛药吗啡和可待因的唯一商业来源，但也生产许多其他生物碱，包括抗菌剂血根碱。由于环境干扰而引起的植物次生代谢的调节通常与其他代谢途径的调节改变有关。作为我们罂粟功能基因组学平台的关键组成部分，我们使用了质子核磁共振(¹H NMR)代谢组学研究了真菌诱导子处理罂粟细胞的初级和次级代谢之间的相互作用。

结果

代谢物指纹图谱和化合物特异性图谱显示，在诱导子处理诱导生物碱生物合成的反应中，主要代谢途径的广泛重编程。使用Chenomx NMR Suite v. 4.6，一个能够根据其各自的特征光谱识别和定量单个化合物的软件包，在对照和诱导剂处理的罂粟细胞培养中，监测了42种不同代谢物的水平超过100小时的时间过程。总的来说，在诱导子处理后的5小时内，可以检测到诱导子处理的细胞代谢组的可检测和动态变化，特别是在碳水化合物、有机酸和非蛋白氨基酸的细胞池中。对照培养物的代谢组在起始时间过程80小时后也显示出大量的调节，特别是在氨基酸和磷脂途径中间体的水平上。在初级代谢过程中，包括糖酵解、三羧酸循环、氮同化、磷脂/脂肪酸合成和莽草酸途径，检测到特定的通量调节，所有这些都产生次级代谢前体。

结论

细胞培养物对引发剂治疗的响应涉及大量和次生代谢的广泛重编程，以及相关的辅助因子生物合成途径。提供了Elicitor治疗的鸦片罂粟细胞培养物中初级和次生新陈代谢的广泛重编程的高分辨率图。

罂粟花 （果实)是世界上最古老的药用植物，生产几种具有重要药理意义的苄基异喹啉生物碱，包括镇痛药吗啡和可因，肌肉松弛剂和血管扩张剂罂粟碱，抗肿瘤药诺斯卡平和抗菌药物血根碱。罂粟中苯异喹啉生物碱的合成始于多巴胺和4-羟基苯乙醛通过norcoclurine合酶(NCS)的缩合反应生成(年代) -norcoclaurine [1那2]．编码大量酶的若干cdna，这些酶随后转化为年代)已从罂粟中分离出80多个苄基异喹啉生物碱[3.]．罂粟可以被认为是调查植物生物碱代谢生物学的模型系统。

生物碱的合成和积累是植物的组成、器官和细胞类型特定的过程。吗啡、诺斯卡平和罂粟碱通常是气生器官中含量最多的生物碱，而血根碱通常积聚在根中[4.]生物碱生物合成酶和同源转录物分别特异定位于韧皮部和相关伴生细胞的筛分元件[5.那6.]．相比之下，罂粟细胞培养不积累生物碱，只产生血根碱对特定的真菌诱导剂的治疗反应[7.]．Elicitor诱导的罂粟细胞培养物中的Sanguinarine生物合成提供了一种平台，以明确地表征在精确控制的条件下的生物碱和其他次生代谢途径的环境诱导。此外，建立广泛的基因组学资源，包括表达序列标签（EST）和DNA微阵列[8.]，对罂粟植物和细胞培养也加快了系统生物学方法的发展，以发现新的生物碱生物合成基因和相关的生物过程。

代谢物谱的改变可以被认为是环境扰动的最终细胞后果。与其他相对无偏见和高通量的技术一起，代谢组学促进了对环境变化对细胞反应的提高了解。在国防相关植物中等新陈代谢的背景下代谢产物分析报告虽然罕见，包括Elicitor治疗的分析Medicago truncatula利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)进行细胞培养[9.]，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析类胡萝卜素[10.]，苯丙素和单萜类吲哚生物碱的生物合成研究Catharanthus Roseus.叶子[11.]、咖啡酸和萜类代谢在烟草花叶病毒感染的烟草细胞中的作用[12.，茉莉酸甲酯(MeJA)处理后，羟基肉桂酸和硫代葡萄糖苷积累芸苔属植物拉伯叶子[13.]利用质子核磁共振(¹H NMR)。尽管使用¹在生物医学领域的代谢物指纹识别的H NMR是很好的，其对植物应用的报道不太广泛[14.]．

我们先前已经使用过傅里叶变换离子回旋共振谱图（FT-ICR-MS），以表明Elicitor处理的鸦片罂粟细胞培养物的代谢物中的大量调制伴随着转录组的主要改变[8.]．虽然FT-ICR-MS分析了992种分析物，包括几种生物碱途径的中间体和产物，但仅根据质量和相应的分子式只能鉴定出少数化合物。需要一种互补的技术来进一步描述罂粟细胞培养物代谢组中对诱导子处理的反应所发生的具体变化。

核磁共振（NMR）光谱对代谢组的优点包括用于样品制备的相对容易性，无损分析，识别广泛化合物的可能性，具有最终化合物鉴定的增强能力，以及提供未知化合物的结构信息[14.那15.].一些植物研究使用基于NMR的代谢物指纹图谱来记录代谢物组的一般变化，而不识别特定的代谢物。使用相对较粗的植物提取物的NMR光谱对特定化合物进行分析受到一些问题的阻碍，包括光谱复杂性、共振峰重叠以及缺乏标准化合物的综合光谱库。在本文中，我们报告了¹H NMR用于表征激发子诱导的罂粟细胞培养物的代谢组。我们使用了一种新的工具，Chenomx NMR Suite v.4.6，以克服在分析¹H-NMR Spectra [16.]．该软件包包括一个代谢物库构建的化学建模化合物的兴趣使用他们的峰中心和J产品信息。该库用于分析样品提取物的光谱，并以累积的方式创建检测代谢物的数学模型。采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的化学计量学方法提取和显示数据集的系统变异。我们的结果表明，诱导子治疗引起的次级代谢的诱导伴随着特异性主要通路的广泛重编程。

诱导反应的整体代谢物分析

在D₂o by¹核磁共振图1显示在诱导后0,5,30和100小时获得的典型光谱。在对应于糖（3.0-4.5ppm）的区域中的Elicitor治疗后，NMR光谱最大的差异发生了30小时。在30 H对样品的光谱中观察到几个差异，但是在同一时间点，尤其是芳族（6.5-8.0ppm）和脂族氨基酸/有机物基本上与Elicitor处理的光谱基本上不同的差异。酸（0.5-1.5 ppm）区域。对控制和引发剂处理细胞的每次时间点的三个独立生物重复进行主成分分析（PCA）（图2A).第一主成分（PC1）将样本与时间分开，占数据内方差的65.6%。第二主成分（PC2）将样本分成对照组和诱导处理组，占方差的17.4%。

PCA分数绘图（图2A[响应于对照细胞培养物不明显的Elicitor治疗，显示出培养的罂粟细胞代谢物中的快速和动态变化。在Elicitor治疗明显地从早期的时间点发散20至100小时，样品收集20至100小时。相反，只有80和100h的控制样品与在早期控制时间点收集的那些发散。相应的负载曲线图显示了对样品之间的变化负责的光谱区域（即垃圾箱）（图2B.）.样本上的PCA评分图(图2A)和装箱图(图2B.)，属于同一象限，代表特定的核磁共振波谱区域，这些波谱区域的峰值在这些样品中高于其他所有波谱区域，并对不同时间点的差异以及在对照组和诱导处理细胞之间的差异贡献最大。具体的代谢物被识别在每个编号[见附加文件1]．值得注意的是，一些垃圾箱包含多个代谢物;因此，直接负责观察到的方差的代谢物不能明确地分配，而无需特异性的分析。葡萄糖，果糖和蔗糖如葡萄糖，在0-50小时的控制培养物中更丰富，最负责对照和引导者处理的细胞中不同时间点的差异。与对照相比，亚丙酸盐，柠檬酸盐，苏氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）在12-100小时的细胞中更丰富的代谢物。在80和100h的对照提取物中的较高水平下发现谷氨酰胺，2-氧氧化丁酸，胆碱和氨基酸，例如亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，酪氨酸和天冬酰胺，并在这些时间点对来自Elicitor处理的提取物进行区分这些样品。

正交部分最小二乘判别分析（OPLS-DA）在三组时间点进行：0-10小时，20-50小时和80-100℃。该算法通过专注于负责两类判别的化合物（即控制和引发剂处理的样品），揭示了特异性代谢物的发生和浓度的发生和浓度更大的变化。在这三个时间点基团内的代谢物分布中的调节主要负责根据PCA的对照和引导者处理的细胞培养物的判别（图2A）.在0-10 h时间点上，OPLS-DA显示对照和诱导剂处理的样品沿主成分明显分离(图)3.）.与PCA不同，OPLS-DA中的bins被赋予了可变的重要性，较高的数值对应的bins在任何给定时间点对控制和诱导处理细胞之间的解释方差的贡献更大[参见附加文件]1]．柠檬酸盐，苹果酸盐，毛酸盐和苏氨酸是可检测的代谢物，在Elicitor处理的细胞中0-10小时之间的丰度增加，而糖的水平降低。类似地，20-50小时的特异性代谢物水平的变化主要是由于有机酸，GABA，苏氨酸和几种未识别的化合物的细胞库的增加，并且减少糖水平（图4.）.在Elicitor处理的细胞中，20小时样品显示出在30和50小时收集的那些偏差，表明在诱导后的代谢物中发生了大约30小时的重大改变。相反，所有时间点聚集在一起在控制样本中。在80和100h的提取物中，有机酸，糖和几种未识别的化合物几乎没有在对照中，而胆碱，谷氨酰胺和其他氨基酸和2-氧缩流物增加（图5.）.在这些时间点，Elicitor处理的样品比对照更紧密地聚集。

Metabolite-specific剖析

一个定制的罂粟核磁共振波谱库被创建来识别和量化个体代谢物(见附加文件)2]数据库中显示了来自不同途径的总共212种化合物，并将其配置成连锁图，以揭示一般代谢关系（图1）6.）.总共42种化合物被确定，并且可以在分析检测极限下明确地鉴定102种已知的植物代谢物，或者在样品中不存在。由于其他代谢物丰富引起的掩蔽，不能确定另外68种化合物的状态。数字7.和8.显示对照和诱导子处理细胞在100小时时间过程中鉴定的单个代谢物的概况。与对照组相比，经诱导剂处理的细胞中葡萄糖、蔗糖和果糖等碳水化合物的水平下降得更快。与对照组相比，诱导子处理的细胞中戊二酸及其衍生物通常更丰富。

在对照和诱导子处理的样品中检测到11种氨基酸。在对照培养中，大多数氨基酸的水平在50至100 h之间增加，但在诱导剂处理的细胞中保持低水平。氨基酸谷氨酰胺和谷氨酸,参与氮代谢,通常是低elicitor-treated细胞相对于控制在5 h后时间点。天冬酰胺也参与氮代谢和一般水平高于5 h后诱导子处理,但总的来说是高在100 - h控制提取。与对照组相比，在诱导剂处理的细胞中，苯基异喹啉生物碱前体酪氨酸的丰度在1到50小时之间增加。与对照组相比，诱导剂处理的细胞在5 ~ 30 h之间酪胺水平较低，但在80和100 h时较高。苯丙氨酸也在诱导后2-10小时增加，但对照培养在80和100小时检测到最大的细胞池。两种非蛋白氨基酸，GABA和β-丙氨酸在诱导剂处理的培养中快速积累。值得注意的是，β-丙氨酸是对照培养中唯一缺失的代谢产物，并且是由诱导子处理诱导产生的。的中间Coumarate phenylpropanoid新陈代谢和苯丙氨酸的衍生物,最初积累在控制和elicitor-treated细胞,但大量减少从50 - 100 h。苯甲酸含量的增加更明显在elicitor-treated细胞,达到一个最大值50 h,此后逐渐下降。

赤藓糖4-磷酸（E4P）和磷丙酮（PEP）是Shikimate途径的前体。E4P的丰度反映了细胞碳水化合物库的调节。对照和引导者处理的细胞中E4P水平的初始增加之后是Elicitor处理的培养物更快地下降。相比之下，PEP水平仍然相对稳定，但引发了20％和30小时，对照培养物100小时。可以鉴定大多数三羧酸（TCA）循环中间体。柠檬酸盐水平在引导者处理的细胞中增加，与对照相比，所有时间点都较高。相比之下，独联体- 阳离子池在对照和引导者处理的细胞中相对相似且稳定，但在80和100小时的Elicitor处理的细胞中保持基本上高。对照和引发剂处理的培养物中的2-氧代流水平逐渐增加，但在60-100小时的埃及治疗细胞中下降。琥珀酸和富马酸盐水平通常是稳定的，但琥珀酸池在Elicitor处理细胞中的50-100小时较高。引发剂处理细胞5-80小时后，草酰胺水平较低。

O-磷酸胆碱、胆碱和乙醇胺参与磷脂代谢，但仅参与O-磷酸胆碱水平在诱导剂处理的培养中增加。相比之下，胆碱和乙醇胺只在对照组的后期出现峰值。在诱导后2- 50小时，参与脂肪酸生物合成的辛酸盐水平增加，并且在诱导剂处理的细胞中略高。

的应用¹H NMR补充了我们以前的尝试将FT-ICR-MS部署到概况改变，以响应于对真菌引导者的治疗进行罂粟细胞培养物的代谢物。可以制作几个有趣的比较。首先，FT-ICR-MS提供了关于992分析物的定量信息，尽管仅基于可用分子量数据和相应的分子式进行比较，但仅基于约2％的鉴定了其中的约2％[8.]．相反，使用的70％的212％的目标化合物获得了信息¹H NMR代谢组学结合Chenomx NMR Suite。化合物的鉴定依据¹核磁共振氢谱比使用分子质量更可靠，分子质量只提供分子式，而不是结构式。质子核磁共振还显示了FT-ICR-MS未检测到的丰富的细胞代谢物。值得注意的是，其中有几种氨基酸，在我们之前的研究中使用的广泛的分子质量数据库中未发现任何氨基酸研究[8.]．相反，生物碱途径的中间体和产物，包括N-methylcoclaurine,N- 通过FT-ICR-MS鉴定甲基己籽，刺激素，二氢植物和血征[8.]．然而，核磁共振未检测到任何生物碱的特征光谱。这可能是由于这些生物碱在D₂O.¹H NMR已被证明是有效的和补充的FT-ICR-MS的化合物特异性分析植物细胞代谢组。

均未知道负责诱导罂粟细胞培养物中防御反应的Elicitor制剂中的组分是不知道的。然而，已经假设真菌细胞壁葡聚糖涉及。虽然我们不能排除检测到的代谢物谱的微小变化的可能性因在真菌水解产物中的化合物的降解而导致的，但许多代谢物水平的动态和大量调节强烈地支持植物细胞代谢物中的真正和深刻的变化。

光谱数据的多元统计分析为代谢组动力学提供了独立于个体代谢物识别的视角。例如，PCA基于广泛、无偏的关系对数据集进行聚类，并提供主要负责样本间差异的代谢物一般类型的线索。G对照组和激发子处理的罂粟细胞培养提取物的叶状代谢物指纹图谱显示，在加入激发子后的5-10小时内，细胞代谢发生了显著的调节。在整个范围内，主峰的变化都是可见的¹关键时间点（即0、5、30和100 H）的H NMR光谱表明，与对照组相比，激发子处理细胞的30和100 H样品中对应于碳水化合物的光谱区域中的共振显著减少（图1）1）.这些数据表明，与对照组相比，用诱导子处理的细胞消耗碳水化合物更快。的光谱样本elicitor-treated细胞出现类似的30和100 h。相比之下,控制在100 h样本显示所有光谱区域的主要区别显示广泛的代谢重构可能由于营养物质的消耗,尤其是蔗糖的培养基。诱导子处理的细胞在30和100小时的光谱普遍相似，这表明与对照组相比，诱导子处理的细胞合成代谢和分解代谢活性有本质上的不同。

全球主成分分析表明，诱导子处理的细胞代谢组比对照培养的细胞更动态。对照样本的方差在时间过程的早期点是最小的，但在80和100 h时是很大的(图2）.这些数据与FT-ICR-MS检测的对照和诱导剂处理罂粟细胞培养的992个分析物相对丰度的PCA结果一致[8.]．OPLS-DA在三个不同的代谢相中（即0-10小时，20-50小时和80和80％和100h）之间的控制和Elicitor处理的细胞之间的清晰分离（图0-10h，20-50小时和100小时）（图3.那4.和5.）.这三个阶段的监督(OPLS-DA)分析允许检查防御反应的早期(即0-10小时)和中期(即20-50小时)成分，以及持续代谢影响(即80和100小时)。有趣的是，诱导剂处理和对照培养在处理后80和100小时发现了最大的差异。虽然在诱导子治疗后80小时以上发生的代谢物变化并不代表特定的诱导子相关的防御反应，但延长的时间过程提供了环境干扰对代谢组的长期后果的见解。

相应的负荷图提供了关于代谢物身份的额外线索，这些代谢物主要对观察到的方差负责。碳水化合物和有机酸极大地促进了诱导剂处理细胞和对照细胞在诱导后50小时的分离。相比之下，氨基酸水平是对照组和诱导子处理细胞在80和100 h总方差的主要因素。这些结果表明，基于多元统计方法的代谢物指纹分析的有效性，在对照和诱导剂处理的罂粟细胞培养中，代谢产物的丰度和差异调节为鉴定代谢产物提供了重要线索。然而，定量的、化合物特异性谱数据分析允许对个体代谢物水平的动态变化进行前所未有的检查(图)7.和8.）.相对丰度的绝对量化或信息(即绝对细胞浓度，从定制的罂粟数据库中总共212种不同化合物中的144种细胞代谢物中获得(参见补充文件)2]．

碳水化合物代谢

蔗糖在植物新陈代谢中起着核心作用，是植物中的能源产生的临界来源。在Elicitor处理的细胞中比对照组更快地耗尽蔗糖，葡萄糖和果糖池等碳水化合物的池，这反映了对碳和能量增加的增加的碳和能量来支持次生代谢的需求。使用Elicitor治疗的鸦片罂粟的FT-ICR-MS分析，还观察到加速耗尽碳水化合物水平[8.)和elicitor-treatedMedicago truncatula［9.细胞培养。在罂粟细胞培养的诱导子处理后2小时内，编码磷酸戊糖和糖酵解途径酶的几个转录本的丰度也增加了[8.]．然而，在据报道培养基中的碳水化合物的增强以改善血征积累，因此不会限制生物碱产生的碳水化合物的碳水化合物的可用性并未限制生物碱生产。17.]对呼吸代谢的大量需求也是供应莽草酸途径、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸红糖（E4P）前体所必需的。莽草酸代谢产生芳香族氨基酸，其中酪氨酸和苯丙氨酸被用作罂粟中苄基异喹啉生物碱和苯丙烷代谢的前体。然而，在激发子处理的细胞中，编码磷酸甘油酯变位酶和烯醇化酶的转录物水平受到抑制，它们催化PEP生物合成的最后两个糖酵解步骤[8.]．PEP也来自葡糖苷酸胆碱羧基酶（PEPCK）中的草酰乙酸盐衍生自葡糖生成。Pepck转录水平也被诱导在Elicitor处理的细胞中（K.Zulak和P. Facchini，未发表的结果）。与对照组相比，ExaloAcetate水平相当低得多。因此，脱氧酸盐可以用于Elicitor处理的细胞中的PEP合成。据称于病原体攻击致玉米胚胎中致葡甘油生成诱导葡糖生成[18.]．糖异生通路的激活可能解释诱导细胞中碳水化合物库的维持。此外，据报道，糖异生烯醇化酶被2-磷酸甘油酸抑制[19.磷酸甘油酸变异酶的产物。罂粟细胞中磷酸甘油酸突变酶的转录水平受到诱导子处理的抑制[8.]．

在诱导子处理的欧芹细胞中，呼吸CO的进化增加₂伴随着参与糖酵解的酶水平的诱导和氧化戊糖磷酸盐途径[20.]．虽然没有发现己糖和PEP之间的中间产物，但几乎检测到了TCA循环中的所有中间产物(图)6.和7.)。与FT-ICR-MS类似，未使用糖酵解或氧化戊糖磷酸途径中间体进行鉴定¹H-NMR，除了PEP之外。随着时间的进展，与对照组相比，几种TCA中间体，包括琥珀酸盐，苹果酸盐和柠檬酸盐在引导者处理的细胞中变得更加丰富。参与碳/氮气传感的2-氧氧化术的细胞池也开始在30小时后在Elicitor处理的细胞中越快地降低。

在80和100 h时，几乎所有检测到的氨基酸水平在对照组中都显著高于诱导子处理的细胞。在较早的时间点，诱导子处理的细胞中氨基酸水平略高，表明对氮的需求较低和/或蛋白水解活性增加。同样，对照培养物在诱导后80和100小时胆碱和乙醇胺水平升高，表明与诱导剂处理的细胞相比，进入脂肪酸和脂质代谢和/或增强磷脂降解的通量更少。几乎每一种糖酵解物和三羧酸中间体的水平也在诱导子处理的细胞中较高，这表明与对照培养相比，碳水化合物代谢增加。在对照细胞中，诱导的分解代谢可能是必需的，以提供能量以维持对蔗糖饥饿的反应的呼吸[21.]．在Elicitor处理的细胞中抑制了在80和100小时时抑制了在蔗糖饥饿时激活的分解代谢途径，以将通量保持为次级代谢。

氮同化

据报道，诱导剂处理的罂粟细胞培养中的氮同化主要涉及NH_4.⁺［17.].相比之下，对照组培养物使用NO_3.^-和NH_4.⁺一样。涉及NH的主要途径_4.⁺同化是谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺：α-氧基氟盐氨基转移酶（GS / GOGAT）循环。谷氨酰胺和谷氨酸用作氮素供体，用于生物合成化合物，如氨基酸，核苷酸，叶绿素，多胺和生物碱[22.]．还建议GS / Gogat循环在植物细胞中发挥碳/氮传感的作用[22.]．然而，在诱导剂处理的罂粟细胞中，推定的可塑性(即最近的同源物是质体定位的)GS和GOGAT的转录本被抑制[8.相对于对照，Elicitor处理的细胞中谷氨酰胺和谷氨酸水平较低。在用真菌引导者处理的豆细胞培养物中，GS活性在24小时的时间内降低，但Gogat活性稳定[23.]．这两种活性在对照豆苗中是稳定的。在受病原菌攻击、诱导子处理或不同植物激素处理的烟叶中，硝酸盐还原酶和脉络膜谷氨酰胺合成酶的转录水平和GS活性均受到抑制。相比之下，胞质GS和谷氨酸脱氢酶的转录水平和GDH活性被诱导[24.]．

诱导剂处理的罂粟细胞中GS/GOGAT循环的下调提出了一个问题:氮是如何被同化和储存以满足生物碱生物合成的大量需求的?在某些物种中，天冬酰胺比谷氨酰胺更适合于氮的运输和/或储存。在诱导剂处理的罂粟细胞中，天冬酰胺的丰度比大多数氨基酸晚。天冬酰胺的浓度也增加丁香假单胞菌- 培养的番茄叶，表明天冬酰胺，而不是谷氨酰胺主要参与氮气的氮气的运输[25.]．

磷脂代谢

磷脂在细胞功能中起几个作用，包括信号转导，膜运输和细胞骨骼重排，并且也涉及过敏反应和系统所获得的阻力[26.]．磷脂酶A.₂(中国人民解放军₂)水解磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)为溶血磷脂(lysoPC)和脂肪酸[27.]．pl₂活动诱发葡萄孢菌但对干旱、伤害、活性氧中间体、水杨酸或MeJA没有反应[28.]这表明解放军₂诱导与病原体攻击有特异性，而不是一般应激响应。在欧芹和烟草细胞培养物中，PLA₂还响应Elicitor治疗诱导[29.]．只有在罂粟细胞里O- 磷胆碱响应于Elicitor治疗而增加。胆碱生物合成的第一步涉及丝氨酸至乙醇胺的脱羧[30.]．胆碱的生物合成可以遵循三条平行的途径，每一条途径都是由胆碱的作用催化的N游离基上的甲基转移酶[31.], phospho-bases [32.或磷脂酰基[33.]．因为磷酸胆碱可以直接与磷脂酰胆碱结合[33.， PLA的基板₂时，在时间过程中早期的细胞磷酸胆碱池的相对较低的丰度可能反映通过磷脂酰基途径的磷脂酰基途径增加，这在Elicitor处理的pH信号中涉及pH信号Eschscholzia californica细胞(34.]．pl₂据报道，在亚麻酸的生产中发挥着重要作用，茉莉酸（JA）的前体，响应应力[35.]．值得注意的是，FT-ICR-MS在诱导剂处理的罂粟细胞中鉴定出磷脂酰胆碱、亚麻酸和(+)-7-茉莉酸[8.]．这些数据表明，JA信令是罂粟小区中防御响应的重要组成部分。

非蛋白质氨基酸

GABA是一种普遍存在的非蛋白质氨基酸，由谷氨酸脱羧酶（GAD）从谷氨酸合成在一种被称为GABA分流的途径中，它绕过TCA循环的几个步骤。GABA通过GABA转氨酶转化为琥珀酸半醛，然后通过琥珀酸半醛脱氢酶氧化为琥珀酸。在植物中，GABA通常在生物和非生物胁迫下积累[36.]．GABA水平因MEJA和酵母ELICITOR而增加截形木霉细胞培养(9.]．在罂粟培养中，在诱导子处理后10 - 50小时，GABA的细胞池增加到最大水平。植物GAD受Ca调控²⁺/ cabloldulin [37.那38.]细胞质酸化[39.]谷氨酸的有效性[40]．据报道GABA积累与谷氨酸转化为谷氨酰胺的抑制作用，表明GABA在应激反应中的作用作为临时氮储存[41.]．GABA和谷氨酸水平也与昼夜节律有关，这表明GABA可能会缓冲谷氨酸含量，并有助于碳/氮平衡[42.]．GABA可以将谷氨酰胺作为罂粟培养物中的临时氮储存替换，并且也可能参与碳/氮信号。虽然后一种过程尚未得到很好的理解，但拟南芥缺乏缺乏GABA梯度涉及花粉管的误导，表明在细胞间信号中的GABA作用[43.]．

β-丙氨酸是主要由多胺（即精胺和氟胺）的非蛋白质氨基酸合成，通过泛酸盐参与辅酶A（COA）生物合成[44.那45.]，尿嘧啶[46.或可能源自丙酸[47.]．在鸦片罂粟细胞中，仅在引导者处理的培养物中检测到β-丙氨酸，表明在防御反应中的作用。β-丙氨酸也积累在Meja治疗中截形木霉细胞(9.]β-丙氨酸积累的诱导可能反映了辅酶a生物合成的增加。辅酶a是一种普遍存在的代谢物，参与脂肪酸、碳水化合物和氨基酸的氧化，在包括苯丙酸在内的许多次级代谢物的生物合成中起着关键作用。

莽草酸和芳香族化合物

Shikimate途径始于E4P和PEP的缩合，并通过形成Chorismate将碳水化合物代谢与植物和微生物中的衍生物联系起来[48.]．虽然在罂粟细胞培养物中鉴定了E4P和PEP（图7.和8.)，未检测到莽草酯途径中间体。在诱生剂处理的罂粟细胞中，早在处理后1-2小时，shikimate途径中编码每种酶的转录本水平就增加了[8.]．E4p的丰富分布与碳水化合物的丰富分布类似（即初始增加，然后在与对照中相比更快地减少Elicitor处理的细胞），可能是由于其与葡萄糖，果糖和蔗糖的代谢连杆（图6.）.相比之下，PEP在诱导20-30 h后出现短暂峰值，在对照培养中在100 h时水平增加。

苯丙烷醇响应于许多应力，包括紫外，病原体攻击，伤害，低温和营养缺陷[49]．苯丙氨酸(生成苯丙氨酸的前体)的水平最初在诱导剂处理的细胞中增加，这与苯丙氨酸解氨酶(朋友）在第2次后2小时内的转录物[8.]．两种苯丙氨酸衍生物，苯甲酸(BA)和香豆酸也被检测到。BA主要来源于苯丙氨酸，但通过异chorismate合成BA和水杨酸也已在拟南芥中得到证实[50]．以烟草花叶病毒(TMV)侵染的烟草植株为材料，用β-大孢子萌发素诱导烟草细胞产生BAPhytophtora megasperma［51]．BA及其衍生物在生物和非生物应激反应中起重要作用，并纳入几种与二级防御相关的代谢物[52]．例如，甲基苯甲酸甲酯在拟南芥患有各种生物和非生物胁迫的挑战[53]在类似条件下诱导苯甲羧甲基转移酶[54]．在罂粟中还没有发现类似的化合物。香豆酸盐水平最初在诱导剂处理的细胞中比对照组增加得更快，但随后在50-80小时后均下降。香豆酸由苯丙氨酸经苯丙氨酸PAL和肉桂酸4-羟化酶(C4H)连续作用合成。在罂粟,朋友和C4H.响应于Elicitor治疗诱导转录物水平，但在100小时内恢复到基础水平[8.]．使用FT-ICR-MS在Elicitor处理的鸦片罂粟细胞培养物中鉴定出三种额外的苯丙烷，错，5-羟基氢酸和香豆酰齐，[8.]．阿魏酸被羟基化成5-羟基阿魏酸，然后甲基化形成sinapate。肉桂酸和BA衍生物据报道被纳入细胞壁部分穆萨acuminata扎根镰刀菌素oxisporumElicitor [55];因此，作为整体防御响应的一部分，BA和锡亚酸盐衍生物也可以掺入鸦片罂粟壁中。

在罂粟中，酪氨酸和酪胺都是苄基异喹啉生物碱和羟基肉桂酸酰胺代谢的前体。酪氨酸/多巴脱羧酶(TYDC)分别将酪氨酸和多巴转化为酪胺和多巴胺，经诱导后可迅速诱导[56]．酪氨酸羟基氨基酰基官：酪胺羟基氨基酰基酰基转移酶（THT）冷凝酪胺和羟基氨基酰基 - COA酯形成羟基氨基酸酰胺，并响应Elicitor治疗诱导[57]．细胞酪氨酸池在2-50小时之间的Elicitor治疗中增加，但相对于对照组酪胺水平相似或更低，直到引出的80％和100小时（图8.)诱导子处理的细胞中酪氨酸水平的最初增加可能反映了这种氨基酸作为酰胺和生物碱生物合成前体的作用。

代谢物分析,¹H NMR是一个有用的工具，用来描述植物细胞培养物对环境扰动的代谢反应，如诱导子处理[8.那9.]．对罂粟细胞培养代谢组中的212种目标化合物进行绝对或相对定量的成功率达到了令人印象深刻的70%。额外代谢物的鉴定将需要对细胞提取物进行分离，以减少大量代谢物的掩蔽，并在特征光谱数据库中添加参考化合物。这种改进是可行的，并应鼓励进一步开发仍未开发的潜力¹核磁共振代谢组学和靶向分析。

在诱导剂处理的罂粟细胞培养中，防御反应的代谢需求涉及primary和secondary pathway关键成分的协调转录诱导[8.]．我们的研究结果表明，生物碱和其他次级和防御途径的诱导是对环境干扰的响应，伴随着特定初级代谢网络的广泛重编程。广泛的代谢组学和转录组学数据库的可用性将有助于建立一种系统生物学方法，以发现罂粟中苯异喹啉生物碱和其他次级代谢物的形成所涉及的生物成分和过程。代谢组学揭示的植物代谢网络的广泛整合表明，建立一个综合模型来预测次级代谢扰动对主要途径调控的后果是非常重要的。罂粟生物碱生物合成的预测代谢工程应受益于对上游代谢途径流量的合理调整，这些代谢途径为所需的自然产物的组装提供必要的前体和辅助因子。

细胞培养和诱导

罂粟花 （果实简历。Marianne）细胞悬浮培养物在23℃的荧光灯下保持在由B5盐和维生素组成的Gambourg 1b5c培养基上，100 mg l^-1myo- 肌醇，1 g l^-1水解酪蛋白20 g L^-1蔗糖和1毫克L^-1和1 mg l^-12,现在也是酸(2,4 - d)。每6 d用1:3稀释的接种物将细胞传代到新鲜培养基中。真菌激发子根据[58]．部分(1厘米²)葡萄孢菌用马铃薯葡萄糖琼脂上生长的菌丝接种含补剂但不含2,4- d的1B5C培养基50 mL。菌丝体的文化b .灰质在23°C的旋转摇床上，在黑暗中以120 rpm的转速生长6天。菌丝体和培养基均化，并在121°C下高压灭菌20分钟。在快速生长阶段（继代培养后2-3天）将1毫升真菌匀浆添加到50毫升培养细胞中。在激发子处理后的不同时间点通过真空过滤收集细胞。在每个时间点也收集对照培养物（即未经激发子处理）。所有样品在使用前均储存在-80°C下。

代谢产物提取

冷冻细胞培养组织(0.75 g)在液氮下用研钵和杵磨成细粉，用3个10毫升80% (v/v)乙醇提取。将aliquot混合并离心10分钟至颗粒细胞碎片。上清在真空离心机中常温冻干，用5ml H重新溶解₂O，用1 mL Chelex-100树脂(Biorad, Hercules, CA)去离子化两次，再冻干。样品在D中重新溶解₂O含有100mm KD₂宝_4.， pH 7.000±0.002,10 mM NaN_3.， 0.5 mM 2,2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸盐(DSS)作为内标。

NMR光谱学

¹采用标准Bruker noesypr1d脉冲序列，在弛豫延迟1.0 s和混合时间100 ms期间辐照剩余水峰，获得H NMR谱图。所有实验都是在Bruker Advance 600光谱仪(Bruker Biospin, Inc, Milton, Canada)上进行的，光谱仪工作在600.22 MHz，配备了一个在298°K下的5毫米TXI探头。总共256次扫描被收集到65,536个数据点上，光谱宽度为12,195 Hz，重复时间为5秒。在傅里叶变换、相位和基线校正之前，谱线加宽0.5 Hz。使用标准布鲁克脉冲程序进行的其他核磁共振实验包括全相关光谱(TOCSY)和异核单量子相干光谱(HSQC)，以确认化学位移分配。

数据分析

使用Chenomx NMR Suite V.4.6的分析器模块进行单个代谢物的鉴定和定量（Chenomx.nc.，埃德蒙顿，加拿大）。¹核磁共振波谱与包含212种植物特异性化合物的文库进行了比较。此库包含唯一的¹通过添加已知量的DSS，每种标准化合物的H NMR光谱记录在600MHz，该DSS也用作化学换档指示剂。出于本研究的目的，一维¹H NMR签名对应的选择化合物不存在标准的Chenomx库，包括那些苯基异喹啉生物碱，被用来创建一个自定义罂粟数据库[见附加文件2]．将核磁共振谱与该数据库进行比较，得到了化合物及其各自浓度的列表。在排除与溶剂(即在4.5-5.0 ppm范围内)和DSS相关的所有偏移后，其余光谱区域被划分为0.04-ppm bins。将bins归一化到DSS峰下的区域，以评估单个代谢物对光谱的贡献以及总光谱面积，以校正稀释效应。使用SIMCA-P v.11.5 (Umetrics, Inc.， Kinnelon, NJ)进行化学计量分析，使用无监督主成分分析(PCA)或监督正交偏最小二乘鉴别分析(OPLS-DA) [59]．OPLS-DA is a supervised analysis tool that was used on three time-course regions (i.e. 0–10 h, 20–50 h, and 80–100 h post elicitation) to reveal differences in the metabolite profiles otherwise masked by PCA using all data points [59]．OPLS-DA允许专注于由于诱引而产生的方差，同时最小化其他生物或分析变量。PCA和OPLS-DA的光谱区域均为x矩阵。x变量都是帕累托缩放以最小化基线偏差和噪声的影响。对于OPLS-DA，类别差异（例如对照组和激发子处理组）为Y矩阵。每个模型的质量由拟合优度参数（R²）基于在1/7交叉验证中正确预测的分数的预测参数的良好（Q²）.

决策支持系统:

2,2-二甲基-2-硅烷戊烷-5-磺酸酯

FT-ICR-MS:

傅里叶变换离子回旋加速器共振质谱法

¹H NMR:

质子核磁共振质谱

OPLS-DA：

正交偏最小二乘-判别分析

主成分分析:

主成分分析。

我们感谢Glen MacInnis的技术援助以及Jillian Hagel构建代谢物连锁图谱。加拿大自然科学和工程研究理事会向PJF提供了研究支持。AMW是阿尔伯塔省独创性工业奖学金的获得者。生物核磁共振中心得到了加拿大健康研究所和卡尔加里大学的资助。PJF是加拿大植物代谢过程生物技术研究主席。

隶属关系

1. 卡尔加里大学生物科学系，卡尔加里，阿尔伯塔，T2N 1N4，加拿大

   凯瑟琳·G·祖拉克、阿林·M·韦尔杰、汉斯·J·沃格尔和彼得·J·法奇尼

通讯作者

通信Peter J Facchini．

作者的贡献

KZ构思了实验设计，进行了样品准备和数据分析，并写了稿件的第一稿。AW监督并协助生物信息学和统计分析。HV监督NMR光谱。PF设想研究，准备了这些数字并完成了稿件。

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