Cupin: nep1样蛋白家族的候选分子结构gydF4y2B一个

背景gydF4y2B一个

nep1样蛋白(nlp)是一类新的植物坏死微生物诱导子家族。一些nlp在双叶植物中诱导超敏反应，尽管这种反应的基础尚不清楚。此外，这些高度保守的蛋白质的空间结构和作用尚不清楚。gydF4y2B一个

结果gydF4y2B一个

我们预测gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构gydF4y2B一个βgydF4y2B一个基于对齐、预测工具和分子动力学对nlp进行了丰富的分析。我们计算了42个NLPs蛋白的一致序列，预测了它的二级结构，并获得了该结构的高质量排列以及与两个Cupin超家族基序的保守残基。NLPs中的保守序列GHRHDWE和几个常见残基，特别是一些保守组氨酸与这两个cupin基序紧密匹配。除了双子叶生长素结合蛋白(ABPs)和nlp共享的其他常见残基外，所有双子叶ABPs在同一位置上也发现了一个额外的保守组氨酸。gydF4y2B一个

结论gydF4y2B一个

我们认为该坏死诱导蛋白类属于Cupin超家族。基于gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构，我们正在为nlp提出一些可能的功能。gydF4y2B一个

10多年前，从植物培养滤液中纯化出了一种能够引发植物细胞死亡的24-kD坏死和乙烯诱导蛋白NEP1gydF4y2B一个尖孢镰刀菌gydF4y2B一个．从那时起，在不同的微生物中发现了其他几种nep1样蛋白(nlp);包括细菌、真菌及卵菌[gydF4y2B一个1gydF4y2B一个］．在某些情况下，一个物种有一个以上的nlp副本，并且这些副本中的几个被认为是假基因[gydF4y2B一个2gydF4y2B一个，gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个］．nlp构成了一个植物毒性蛋白家族，包含一个分泌信号序列，能够在大量双子叶植物中引发细胞死亡和防御反应(由[gydF4y2B一个4gydF4y2B一个]和[gydF4y2B一个2gydF4y2B一个])。大多数具有NLPs的物种都是植物病原体，但也有例外，因为编码NLPs的基因已在已知不具有致病性的真菌和细菌物种中检测到。gydF4y2B一个

最近发表的一项研究在担子菌中发现了三个nlp副本gydF4y2B一个Moniliophthora孢gydF4y2B一个(MpNEPs)。gydF4y2B一个m .孢gydF4y2B一个在美国，引起女巫扫帚病的病原体gydF4y2B一个Theobroma可可gydF4y2B一个美国是美洲农作物减产的主要原因。作者观察到，尽管MpNEP1和MpNEP2的序列相似性很高，但它们呈现出不同的结构特征，并且MpNEP2的活性抗高温。他们还证明了这些基因在真菌的两个不同生命阶段中有不同的表达[gydF4y2B一个5gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

所有的nlp都包含一个称为诱导坏死的保守结构域gydF4y2B一个疫霉gydF4y2B一个蛋白1 (NPP1) [gydF4y2B一个6gydF4y2B一个］．目前对这类蛋白质中功能域、细胞靶向或蛋白质结合基序的知识缺乏，使揭示nlp的实际功能复杂化[gydF4y2B一个4gydF4y2B一个］．人们对确定它们的功能、在植物-病原体相互作用中的作用和分子结构越来越感兴趣[gydF4y2B一个4gydF4y2B一个］．主要的保守基序GHRHDWE与目前已知的任何蛋白质序列都没有显著的相似性，因此没有提供nlp功能的线索。gydF4y2B一个

Cupin超家族是由Dunwell在1998年发现的[gydF4y2B一个7gydF4y2B一个]是迄今为止描述的功能最多样化的折叠之一，包括酶和非酶的成员。其中包括螺旋-turn-helix转录因子、AraC型转录因子、草酸脱羧酶、生长素结合蛋白、球蛋白等。生长素结合蛋白(ABPs)是一种激素受体，对植物生理有重要影响;相关的草酸氧化酶参与了病原体的活动，而胚芽样蛋白、外质体、糖蛋白因其杯状折叠而具有显著的蛋白酶抗性。gydF4y2B一个

根据Dunwell等人。[gydF4y2B一个8gydF4y2B一个，gydF4y2B一个9gydF4y2B一个cupin结构域包含两个保守的基序，每个基序对应两个gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个，由另两个相对保守的区域隔开gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个中间有一个变量循环。基序间区域的总尺寸从11个残基到约50个残基不等。motif 1和motif 2中的特征保守序列为g(x)gydF4y2B一个_{5gydF4y2B一个}hxh (x)gydF4y2B一个_{3，4gydF4y2B一个}e (x)gydF4y2B一个_{6gydF4y2B一个}G和G (x)gydF4y2B一个_{5gydF4y2B一个}pxg (x)gydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}h (x)gydF4y2B一个_{3.gydF4y2B一个}n,分别。gydF4y2B一个

使用NCBI-Blast的同源搜索不会产生与gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构，因为可能的候选人得分很低，不能被认为是可行的候选人。结果是一长串坏死和乙烯诱导蛋白，所有这些都是gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个-丰富的蛋白质，但没有有用的信息与相关gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个结构。任何尝试寻找其他类似的蛋白质基于他们的gydF4y2B一个1 dgydF4y2B一个-结构(序列)到NLP蛋白的结果是其他NLP蛋白。在本文中，我们提出了一个gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个该蛋白家族的结构基于:(1)gydF4y2B一个1 dgydF4y2B一个(2)假设的催化中心，(3)预测的信号序列和目标位置，(4)半胱氨酸和组氨酸的保守残基，以及(5)预测的gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个结构。我们的计算实验结合实验线索指出Cupin超家族是nlp的结构。gydF4y2B一个

本文分为以下几个部分。在方法一节中，我们介绍了用于分析的序列和关于保守残基的NLPs比对结果。基于保守残基的模式，我们寻找候选结构，同时考虑到预测gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个结构。被选中的候选人是在gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构和具有nlp的保守残基。有了这些，我们提出了一个gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-核心区结构(gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个-rich区域，位于图中的90-220位置gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)。基于这一提议;我们分析了nlp的最核心部分，并讨论了它与已知蛋白质的关系。gydF4y2B一个

一致性分析gydF4y2B一个

Gijzen和Nürnberger将NLPs分为两组:包含两个半胱氨酸的(I型NLPs)和包含四个半胱氨酸的(II型NLPs)。I型nlp存在于真菌、卵菌和细菌中，而II型nlp不存在于卵菌中[gydF4y2B一个2gydF4y2B一个］．序列比对将nlp分为这两大类。gydF4y2B一个

这里提出的统计方法与nlp显示的不同水平的植物致病性相似。它们以不同程度的强度影响不同的物种，是针对宿主的。gydF4y2B一个

I型和II型nlp的对齐分析结果如图所示gydF4y2B一个1gydF4y2B一个．第一个序列表示所有I型NLP，将被称为I型NLP共识，第二个序列表示所有II型NLP，将被称为II型NLP共识。由于这些一致序列在统计上代表I型和II型nlp，我们使用它们来获得二级结构预测，并与已知蛋白质进行局部比对gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个结构。最后，我们使用I型NLP共识构建了一个gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个结构。在获得I型和II型共识序列后，我们将它们提交给PredictProtein位点的PROF程序[gydF4y2B一个22gydF4y2B一个]以取得第二份证书(gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个)结构预测(见图gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)．gydF4y2B一个

我们观察到NLPgydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构可分为5个部分或结构域:(1)信号肽(位置1 - 25)gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个；(2)预测2 - 3个起始域(位置25-60)gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个预测gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个自信心低;(3)gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个两侧有两个半胱氨酸C62和C89，称为c62c89-gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个；(4)gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个-富区(位置90-220)，由9-10gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个(5)一个端域(位置220-270)，预测两个gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个分隔为gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个．预测的中心gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个-富区域的nlp将它们包含在gydF4y2B一个——βgydF4y2B一个SCOP类蛋白质。gydF4y2B一个

在这篇文章中，我们提出杯状褶皱是nlp的这一区域(残基90-220)的合适模板。信号肽从序列中切除，其他区域在nlp的主要结构中起次要作用。gydF4y2B一个

根据文献，I型和II型NLPs之间的区别是半胱氨酸C106和C112，仅存在于II型NLPs中[gydF4y2B一个2gydF4y2B一个］．然而，我们观察到其他差异，无论是在残基的保护模式和gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个结构。例如，虽然组氨酸H29和天冬氨酸D30在I型nlp中是保守的，但它们在II型nlp中是代表性不足的。另外，II型NLPs中的保守序列DxDxDgCY(位置56-63)和保守的组氨酸H179和H185 (I型NLPs中不存在)也很有趣。有关gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个结构，主要区别是gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个6，在I型nlp中没有预测到。为了研究哪些残基在nlp中是必需的，即只有它们(而没有其他残基)才能发挥特定的作用(功能和结构)，以及它们中的哪些残基可以被其他兼容的残基所取代(例如，相同的电荷，亲水性，gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个或gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个偏差等)，我们在对齐的每个位置上计算共同残差的数量，并在连续的直方图中绘制它们。例如，在I型nlp中，保守基序GHRHDWE被描述为gydF4y2B一个^{89％gydF4y2B一个}一个gydF4y2B一个^{7%gydF4y2B一个}kgydF4y2B一个^{4%gydF4y2B一个}] [hgydF4y2B一个^{96％gydF4y2B一个}ygydF4y2B一个^{4%gydF4y2B一个}] [rgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [hgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [dgydF4y2B一个^{92％gydF4y2B一个}fgydF4y2B一个^{4%gydF4y2B一个}ygydF4y2B一个^{4%gydF4y2B一个}] [wgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [egydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}]，其中字母表示单字母代码，数字表示aa在该位置的频率。对于II型nlp，直方图序列为[ggydF4y2B一个^{87％gydF4y2B一个}ngydF4y2B一个^{13%gydF4y2B一个}] [hgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [rgydF4y2B一个^{74％gydF4y2B一个}kgydF4y2B一个^{13%gydF4y2B一个}tgydF4y2B一个^{13%gydF4y2B一个}] [hgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [dgydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}] [wgydF4y2B一个^{80％gydF4y2B一个}fgydF4y2B一个^{13%gydF4y2B一个}lgydF4y2B一个^{7%gydF4y2B一个}] [egydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}］．我们可以看到，在I型nlp中，第一个甘氨酸可能被丙氨酸取代。这意味着在这个位置上有一个小的柔性残基(尽管甘氨酸更适合)在nlp的结构和功能中发挥必要的作用。gydF4y2B一个

我们将所有42个nlp中132-138和132-139位置的所有序列提交给蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)的搜索服务，得到了以下按e-value排序的候选序列列表(参见方法):gydF4y2B一个1 vj2gydF4y2B一个(e-value = 1.0)，gydF4y2B一个1 f51gydF4y2B一个(2.2),gydF4y2B一个1 ixmgydF4y2B一个(2.3),gydF4y2B一个2 ftkgydF4y2B一个(2.3),gydF4y2B一个1季度gydF4y2B一个(2.6),gydF4y2B一个1 wm1gydF4y2B一个(2.6),gydF4y2B一个1 x2bgydF4y2B一个(2.6),gydF4y2B一个1 x2egydF4y2B一个(2.6),gydF4y2B一个2 c0hgydF4y2B一个(2.7)和gydF4y2B一个2 hi0gydF4y2B一个(3.9)。gydF4y2B一个

的gydF4y2B一个1 vj2gydF4y2B一个结构，一种功能未知的蛋白质gydF4y2B一个Thermotoga maritimagydF4y2B一个(一种最佳生长温度为80°C的嗜热真细菌)属于rmlc样cupin SCOP超家族，主要是Beta CATH类。从gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构分析，nlp被识别为gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个-丰富的结构[gydF4y2B一个19gydF4y2B一个]，可能属于gydF4y2B一个——βgydF4y2B一个SCOP类蛋白质，其中rmlc样杯蛋白是一个超家族。gydF4y2B一个1 vj2gydF4y2B一个的兼容数gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个它们相对于保守残基的位置是相同的，最后其序列rhshpwe与nlp的GHRHDWE模式非常相似。gydF4y2B一个1 vj2gydF4y2B一个有四个组氨酸作为锰离子的配体，这可以解释该母题在nlp中的重要性。其他候选人，gydF4y2B一个1 f51gydF4y2B一个，gydF4y2B一个1 ixmgydF4y2B一个而且gydF4y2B一个2 ftkgydF4y2B一个给出序列GHSRHDWMgydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个因此他们被丢弃了。此外，所有的蛋白质gydF4y2B一个1季度gydF4y2B一个，gydF4y2B一个1 wm1gydF4y2B一个，gydF4y2B一个1 x2bgydF4y2B一个，gydF4y2B一个1 x2egydF4y2B一个，gydF4y2B一个2 c0hgydF4y2B一个而且gydF4y2B一个2 hi0gydF4y2B一个拥有许多gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个少数人混杂gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个，也被丢弃了。gydF4y2B一个

我们在Dunwell的一篇综述中收集的68个纸杯中研究了这两个基序残基的保守程度[gydF4y2B一个8gydF4y2B一个]，我们得到了以下直方图:gydF4y2B一个

我们可以看到组氨酸的典型定位使它们能够作为离子配体[gydF4y2B一个23gydF4y2B一个］．对于这些母题的定位gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构或相对于另一个gydF4y2B一个βgydF4y2B一个-strands，参见图gydF4y2B一个2gydF4y2B一个，最后一行。这两个基序(更确切地说，所有三个组氨酸)是彼此接近的gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构，使3个组氨酸(hgydF4y2B一个^{82％gydF4y2B一个}hgydF4y2B一个^{65％gydF4y2B一个}hgydF4y2B一个^{75％gydF4y2B一个})和谷氨酸(egydF4y2B一个^{53%gydF4y2B一个})作为金属配体，什么可能解释为什么这些残基是高度保守的(见表gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)．一些cupins(被称为gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个- residual)在第二和第三配体之间有三个残基，而其他的有四个残基(gydF4y2B一个4gydF4y2B一个残留物因预测)。gydF4y2B一个

比较表中nlp和cupins的残差直方图gydF4y2B一个1gydF4y2B一个，我们可以看到hrhdxe序列存在于大多数nlp和大多数nlp中gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个残留物因预测。此外，75%的cupin序列和95%的nlp分别在第2个基序和第193位上有一个组氨酸(第4配体)。这些与一般铜杯结构中最重要的残基相对应，任何这些残基的取代都会降低蛋白质保持金属离子的能力，就像在一些铜杯中的情况一样。我们得出结论，cupins中的第一个基序及其xhxhxxx [x-]e模式对应于NLPs的GHRHDWE [gh]模式和组氨酸hgydF4y2B一个^{75％gydF4y2B一个}在第二个cupin基序中对应H193gydF4y2B一个^{95％gydF4y2B一个}在nlp中。当然，这种通信必须与gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-structure，我们接下来会看到什么。gydF4y2B一个

序列GHRHDWE的嵌入gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个施加侧链的交替方向(向内和向外)。此外，疏水性模式必须与这一事实相容。高度疏水的残基，如色氨酸(w)，将其疏水侧链向蛋白质内部延伸，形成g-h133-r↑-h135-d↑-w↓-e↑-[gh]-v-v-v-w↓(向下箭头表示侧链指向蛋白质内部，向上箭头表示侧链指向蛋白质内部)。组氨酸H133和H135在nlp中遵循这种交替模式，使它们成为金属离子的配体(见图)gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)．gydF4y2B一个

在杯口，138和139两个位置(见表gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)通常含有带负电荷的残基，如天门冬氨酸(d)或谷氨酸(e)。然而，只有E139作为金属离子的配体。因此，尽管在I型和II型nlp中高度保守，e138作为可行的候选配体必须被丢弃。h139在II型NLPs中可以作为离子配体，但只有19%的I型NLPs在这个位置上存在组氨酸。在[gydF4y2B一个8gydF4y2B一个]，只有从gydF4y2B一个海床horikoshiigydF4y2B一个而且gydF4y2B一个拟南芥gydF4y2B一个这个位置有组氨酸吗gydF4y2B一个hgydF4y2B一个(GenBank gi 3256432，一个假设的蛋白质)和ahhhtfggydF4y2B一个hgydF4y2B一个(gi 1169199, dna损伤修复/耐受蛋白)。先前获得的gydF4y2B一个T. maritima 1vj2gydF4y2B一个和它的序列rgydF4y2B一个hgydF4y2B一个年代gydF4y2B一个hgydF4y2B一个pwegydF4y2B一个hgydF4y2B一个(配体是斜体)也包括在这一组。看来，第三组氨酸增加了金属离子结合的稳定性，这是在极端温度下生存条件下所必需的gydF4y2B一个p . horikoshiigydF4y2B一个而且gydF4y2B一个t . maritimagydF4y2B一个．gydF4y2B一个

第139位第二常见的残留物是天冬酰胺(n)，在[gydF4y2B一个8gydF4y2B一个]:gydF4y2B一个落花生hypogaeagydF4y2B一个(gi 1168390a) pkhadadgydF4y2B一个ngydF4y2B一个而且gydF4y2B一个枯草芽孢杆菌gydF4y2B一个(gi 2636534) ahfdaytgydF4y2B一个ngydF4y2B一个．由于在133和135位缺少组氨酸，这些杯形管可能不能结合任何金属离子。gydF4y2B一个

天冬酰胺n139存在于26%的nlp中，可能也不参与任何离子的结合。此外，许多nlp(26%)在139位有非带电残基，这一事实提出了一个问题，即在这个位置是否需要带电残基。许多cupins(29%)含有不带电残基(vgydF4y2B一个^{8gydF4y2B一个}一个gydF4y2B一个^{7gydF4y2B一个}lgydF4y2B一个^{3.gydF4y2B一个}Cg)在这个位置，表明这些cupins根本不需要残基139作为离子配体。例如，匹林gydF4y2B一个1 j1lgydF4y2B一个(dgydF4y2B一个hgydF4y2B一个pgydF4y2B一个hgydF4y2B一个rgfet……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个一个gydF4y2B一个egydF4y2B一个)使用三种组氨酸(h133, h135和h193)和一种谷氨酸(e195)作为Fe的配体gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}，而不是e139，尽管它可以执行此功能。而且，有几个杯子没有使用任何3gydF4y2B一个^{理查德·道金斯gydF4y2B一个}配体在这个位置。例如异青青霉素N合成酶gydF4y2B一个曲霉属真菌nidulansgydF4y2B一个， PDB代码gydF4y2B一个1 bk0gydF4y2B一个(w序列gydF4y2B一个hgydF4y2B一个egydF4y2B一个dgydF4y2B一个vslit……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个和离子FegydF4y2B一个^{3 +gydF4y2B一个}）;clavaminate合酶gydF4y2B一个1 ds1的gydF4y2B一个(序列fgydF4y2B一个hgydF4y2B一个tgydF4y2B一个egydF4y2B一个mathr……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个和离子FegydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}）;假设蛋白质gydF4y2B一个1 jr7gydF4y2B一个(l序列gydF4y2B一个hgydF4y2B一个ngydF4y2B一个dgydF4y2B一个gtyvee……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个和Fe离子gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个})和花青素合成酶gydF4y2B一个拟南芥1gp4gydF4y2B一个(一个gydF4y2B一个hgydF4y2B一个tgydF4y2B一个dgydF4y2B一个vsaltf……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个、铁gydF4y2B一个^{3 +gydF4y2B一个})．即使在场，e139gydF4y2B一个^{53%gydF4y2B一个}对于应该与金属离子结合的残留物来说，在cupins中不是很保守。此外，cupin乙酰丙酮双加氧酶Dke1的位点定向突变e139→q139导致铁的损失增加gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}离子和降低热稳定性[gydF4y2B一个24gydF4y2B一个]，但其功能特征几乎没有改变。我们得出结论，天冬酰胺n139不作为金属离子的配体，导致61%的nlp在这个位置上没有配体。最后，人类半胱氨酸双加氧酶gydF4y2B一个2 ic1gydF4y2B一个(见图gydF4y2B一个2gydF4y2B一个)对Fe只有3个组氨酸配体gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}离子(h133, h135和h193)。在这个序列中的第三个组氨酸igydF4y2B一个hgydF4y2B一个dgydF4y2B一个hgydF4y2B一个tdshc……gydF4y2B一个hgydF4y2B一个不充当金属配体，也不需要其他残留物来保持金属离子，这表明nlp同样可以在这个位置保持金属离子。gydF4y2B一个

半胱氨酸的作用gydF4y2B一个

费布里希等人。[gydF4y2B一个6gydF4y2B一个]的研究表明，半胱氨酸C62和C89都是保守的，并且是NLPs功能所必需的。此外，它们之间的线圈似乎编码了一个糖基化位点，这对于分泌的蛋白质意味着防止蛋白质水解，正确的折叠和热稳定性。此外，高度保守的甘氨酸G76G77似乎促进了恰好在这个线圈中间的折叠，使半胱氨酸聚集在一起。gydF4y2B一个

半胱氨酸之间结合模式的分析表明，C62和C89在I型和II型nlp中形成二硫键桥的置信水平为90%。在PDB中搜索GnxsGGL模式得到该蛋白gydF4y2B一个1 eh6gydF4y2B一个，它有一个gydF4y2B一个转gydF4y2B一个在s75G76上，支持了这两个半胱氨酸都是二硫键的假设。gydF4y2B一个

相对于仅存在于II型nlp中的其他两种半胱氨酸，DISULFIND程序认为C106与任何其他半胱氨酸结合的概率仅为30%，C112为0%。然而，从这两个半胱氨酸的位置，不难推断它们是键合的gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{一个gydF4y2B一个}而且gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{BgydF4y2B一个}形成一个gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个(见图gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)．这两个半胱氨酸似乎加强了这些gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个应该呈现这种构象。这两个半胱氨酸也有可能通过锌离子与两个保守的组氨酸H133和H134结合，例如在WRKY蛋白的锌指中。wrky蛋白具有特殊的锌指基序，其特征为cx模式gydF4y2B一个_{4、5gydF4y2B一个}残雪gydF4y2B一个_{22、23gydF4y2B一个}hxh和II型nlp具有相似的模式cxgydF4y2B一个_{4gydF4y2B一个}残雪gydF4y2B一个_{19gydF4y2B一个}hxh。wrky蛋白是一种转录因子，有100个代表gydF4y2B一个答:芥gydF4y2B一个［gydF4y2B一个25gydF4y2B一个］．例如，蛋白质AtWRKY6与衰老和防御相关的过程有关[gydF4y2B一个26gydF4y2B一个］．WRKY蛋白的结构可能与II型nlp共享。然而，它们具有相同功能的可能性较小。［gydF4y2B一个27gydF4y2B一个]表明nlp诱导的坏死需要与双褶叶植物质膜胞外质侧的靶位点相互作用。他们表明，在双叶植物中，NLP的异位表达仅当蛋白质被传递到外质体时才会导致细胞死亡。然而，Bae等人的研究表明，NEP1在植物中定位于细胞壁和细胞质。这一结果表明NEP1可以穿透质膜，但可能无法穿透细胞器[gydF4y2B一个28gydF4y2B一个］．据观察，nlp是亲水的，不太可能穿过质膜。在此基础上，提出了基于ABP的模型结构gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个在表面有许多亲水残基，疏水残基被埋藏，支持了nlp不能穿过质膜的假设。此外，欧芹原生质体对PpNPP1的快速反应(大约150秒)(gydF4y2B一个疫霉parasiticagydF4y2B一个NPP1)仅在质膜水平上与相互作用相容[gydF4y2B一个6gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

NLP 2d和3d-结构gydF4y2B一个

类似rmlc的杯蛋白超家族属于SCOP双链β -螺旋折叠。Cupins是双链的，因为它们是由两个反平行链序列组成，并以短弯连接。如果nlp是cupin，那么在gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个cupins的结构和nlp预测的结构。杯形由8-10组成gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个[J]。gydF4y2B一个

的形成gydF4y2B一个βgydF4y2B一个-barrel可以这样理解:首先E折叠在F上，然后D折叠在G上，C折叠在H上，最后B折叠在I上:gydF4y2B一个

最后，这条双链像螺旋一样转动，形成一个gydF4y2B一个β-gydF4y2B一个两个桶gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个: CHEF和BIDG，其疏水残基瞄准筒体内部。在桶内，在疏水口袋里，我们发现金属离子与配体结合在一起，靠近桶的顶部(底部被E和F封闭gydF4y2B一个βgydF4y2B一个-strands，参见图gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)．呈现催化活性的Cupins将其底物绑定在桶的顶部，靠近疏水口袋处的金属离子。gydF4y2B一个

E和F之间的线圈必须足够灵活，以允许EDCB在FGHI上折叠。甘氨酸作为最灵活的残基，是发挥这一作用的最佳候选，我们在假定的EF-序列中发现了其中的两个残基gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个在nlp中:g163g164。而且，g163g164距离1有27个残基gydF4y2B一个^{圣gydF4y2B一个}和2gydF4y2B一个^{ndgydF4y2B一个}组氨酸配体与26个残基分离得到4个gydF4y2B一个^{thgydF4y2B一个}I型nlp中的组氨酸配体(H133R134H135-xgydF4y2B一个_{27gydF4y2B一个}-g163g164-xgydF4y2B一个_{26gydF4y2B一个}-H193)。最终的结果是三个组氨酸的最终结构都非常接近(见图)gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)，就像它们作为离子配体一样。此外，一个有趣的序列是坏死型I NLP BeNEP2gydF4y2B一个cgydF4y2B一个pah g163g164 wdgydF4y2B一个cgydF4y2B一个在EF-gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个，其两侧有两个半胱氨酸。DiANNA 1.1二硫键预测程序[gydF4y2B一个29gydF4y2B一个]预测这两个半胱氨酸以82%的置信水平结合，支持上述与E和F线圈的预测gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个关闭枪管底部。这些gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个和gydF4y2B一个循环gydF4y2B一个在两者之间形成了所谓的Inter Motif Region (IMR)，它包含12到130个残基，并且在cupin中没有显示保守模式。这种高度可变的区域在杯型和低置信水平gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个对该地区nlp的结构进行预测是困难的gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个- cupins和nlp之间的结构对齐。数字gydF4y2B一个4gydF4y2B一个的置信度gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构预测使用PROF程序用于I型和II型NLP共识，以及用于gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个Cupin，这里我们可以看到个体之间的对应关系gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个在这些蛋白质中。我们注意到gydF4y2B一个βgydF4y2B一个-桶由7-9的高置信水平建立gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个以及1-2个低可信度的cupins和nlp之间的链对应。例如,gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{1gydF4y2B一个}在I型NLP中，共识对应于gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{一个gydF4y2B一个}在因预测,gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{BgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{3.gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{CgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{4gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{DgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{5gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{EgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{7gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{FgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{8gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{GgydF4y2B一个}，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{9gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{HgydF4y2B一个}最后gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{10gydF4y2B一个}对应于gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{我gydF4y2B一个}．nlp中最保守的模式是GHRHDWE序列(gydF4y2B一个ηgydF4y2B一个在图gydF4y2B一个4gydF4y2B一个)，介于假定的C (gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{3.gydF4y2B一个})和D (gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{4gydF4y2B一个}）gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个．从这个模式的位置，尽管C是一个低置信链，但它的位置是很容易确定的。这一对应关系被确认的对齐gydF4y2B一个βgydF4y2B一个一些有代表性的NLP和cupin序列的-barrel(见图gydF4y2B一个2gydF4y2B一个)．这是27个I型和15个II型nlp, 32个双子叶ABPs(所有cupin)， 9个单子叶ABPs(所有cupin)，以及本文讨论的其他3个cupin的共识:gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个(转化),gydF4y2B一个2 ic1gydF4y2B一个而且gydF4y2B一个1 vj2gydF4y2B一个．gydF4y2B一个

对于I型和II型NLP共识的预测与cupin结构之间的两个差异值得一提:首先，gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{6gydF4y2B一个}存在于II型nlp中而不存在于I型nlp中，其次，nlp没有gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{JgydF4y2B一个}．当然，对应的gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{6gydF4y2B一个}来gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{FgydF4y2B一个}是第二类自然科学项目中一个诱人的假设，但这与I类和II类自然科学项目之间的极好的对齐以及图中所示的对齐不兼容gydF4y2B一个2gydF4y2B一个．我们可以认为对应的gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个在I型NLP共识中被PROF项目遗漏了，那是什么gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{8gydF4y2B一个}，而不是gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{9gydF4y2B一个}，应对应于gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{HgydF4y2B一个}I型nlp。与此想法相反，我们提出保守组氨酸H193gydF4y2B一个^{95％gydF4y2B一个}作为金属离子配体。在cupins，自4gydF4y2B一个^{thgydF4y2B一个}配体在gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{HgydF4y2B一个}，我们建议H193符号H的位置gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个在nlp。更准确地说，是4gydF4y2B一个^{thgydF4y2B一个}配体(组氨酸)必须在边界gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{HgydF4y2B一个}因为1gydF4y2B一个^{圣gydF4y2B一个}和2gydF4y2B一个^{ndgydF4y2B一个}配体在的边界gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{CgydF4y2B一个}(在CD中gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个)和C和HgydF4y2B一个β链gydF4y2B一个形成反平行gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个，可以通过以下设计可视化(方框表示gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个)．gydF4y2B一个

最后，我们可以说gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个- II类nlp的结构包括10个gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个而不是I型nlp中的9gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{8gydF4y2B一个}是gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{HgydF4y2B一个}与H179gydF4y2B一个^{87％gydF4y2B一个}(在…的边界gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{8gydF4y2B一个})表示作为4的余数gydF4y2B一个^{thgydF4y2B一个}配体。除了I型NLPs的保守组氨酸外，II型NLPs还有两个:H179gydF4y2B一个^{87％gydF4y2B一个}和H185gydF4y2B一个^{100％gydF4y2B一个}，它们可以作为配体。首先，I型nlp和II型nlp的良好排列指向了一个共同的结构，其次，大多数nlp是I型，第三，它们包括最具侵略性的nlp(坏死的)，第四，II型nlp不发生在卵菌中(见表)gydF4y2B一个2gydF4y2B一个)．因此，I类NLP代表NLP的类别，而II类NLP应被视为关于NLP结构的重要但次要的信息来源。gydF4y2B一个

内部Motif区域(IMR)gydF4y2B一个

前面的分析关于gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个nlp和cupins的-结构表明，用gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{6gydF4y2B一个}而且gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{7gydF4y2B一个}(假定的E和FgydF4y2B一个β链gydF4y2B一个)，这是一项艰巨的任务。它包含22-32个残基(II型NLP共识中的22-28个残基)和11个残基(II型NLP共识中的11个残基)gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个I型nlp中IMR的大小，也具有保守序列SgydF4y2B一个^{88％gydF4y2B一个}一个gydF4y2B一个^{50%gydF4y2B一个}HgydF4y2B一个^{95％gydF4y2B一个}ggydF4y2B一个^{74％gydF4y2B一个}．因此，我们在68个杯子中选择了[gydF4y2B一个8gydF4y2B一个那些大小相似的。与nlp的IMR最相似的cupin是gydF4y2B一个答:芥gydF4y2B一个Gi |461453，可能是激素生长素的受体。的gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-玉米生长素结合蛋白(ABP)的结构已经确定(gydF4y2B一个1 lrhgydF4y2B一个而且gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个配电盒中，见图gydF4y2B一个2gydF4y2B一个)．它有一个gydF4y2B一个β桶gydF4y2B一个域，是溶液中的二聚体，在IMR中有21个残基，在gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个．ABPs参与细胞扩张，位于内质网腔、质膜和细胞壁[gydF4y2B一个30.gydF4y2B一个］．它在绿色植物中无处不在[gydF4y2B一个31gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

坏死蛋白对宿主生长素反应的控制是有利的，例如原生质体电生理的变化。生长素诱导HgydF4y2B一个^{+gydF4y2B一个}分泌进入细胞壁，引起质膜的超极化gydF4y2B一个燕麦属gydF4y2B一个胚芽细胞[gydF4y2B一个32gydF4y2B一个]，烟草原生质体的电响应[gydF4y2B一个33gydF4y2B一个]和KgydF4y2B一个^{+gydF4y2B一个}电流在gydF4y2B一个烟草gydF4y2B一个警卫室[gydF4y2B一个34gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

生长素通过调节H . a的活性刺激植物细胞的生长gydF4y2B一个^{+gydF4y2B一个}- atp酶。这种转运酶分泌的质子使细胞壁酸化，增加其延展性。然后，细胞内部的静水压力延伸到细胞壁。在相互作用中gydF4y2B一个m .孢gydF4y2B一个而且gydF4y2B一个t .可可gydF4y2B一个，已经有人提出了导致畸形的生长素诱导阶段和杀死宿主的生长素消耗次级阶段[gydF4y2B一个35gydF4y2B一个］．Kilaru等报道生长素的增加与真菌的相变相一致。这种增加可能是由于IAA(生长素)合成增强、IAA氧化酶抑制或病原体分泌IAA的作用[gydF4y2B一个36gydF4y2B一个］．这种可能性gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个nlp的结构与cupins相似，特别是与ABPs相似，使nlp控制植物生长素受体和由此产生的离子电流。此外，Haberlach等人已经表明，细胞分裂素和生长素的平衡是维持或消除植物组织抗性的重要因素。更具体地说，它们证明了这一点gydF4y2B一个p . parasiticagydF4y2B一个耐药gydF4y2B一个n .烟草gydF4y2B一个在高细胞分裂素/生长素水平下变得敏感[gydF4y2B一个37gydF4y2B一个］．可以想象，nlp可能与天然ABPs竞争，导致植物细胞分裂素/生长素比值明显增加。另一种可能性是nlp可能是生长素氧化酶。Krupasager报告说，在双核生物阶段，gydF4y2B一个Marasmius孢gydF4y2B一个不产生大量的细胞分裂素或生长素，但产生生长素失活酶，如iaa氧化酶和漆酶[gydF4y2B一个38gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

单子叶和双子叶ABPs的差异(见表gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)提供了额外的重要线索，因为gydF4y2B一个疫霉gydF4y2B一个物种是双子叶植物的主要病原体。单子叶细胞显然不受nlp的影响[gydF4y2B一个6gydF4y2B一个］．例如，玉米和大麦在PpNPP1渗透后不表现出任何细胞死亡症状。为此，我们研究了单子叶和双子叶ABPs之间的差异[gydF4y2B一个31gydF4y2B一个]，以及这些差异是否与nlp中的保守残差有关。这些残基是:gydF4y2B一个

我们观察到双碱基ABP残基和NLP高保守残基之间高度对应(I型NLP中的n73、L78、H162、v191和t200, II型NLP中的L78、R90和H162)。当然，EF-中的组氨酸残留H162gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个单子叶ABPs和双子叶ABPs之间最显著的差异是由nlp共享的。EF-中32双子ABPs与I型nlp的比对gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个导致一些常见的残基(见下面的序列)或具有相似理化特征的残基(见图)gydF4y2B一个2gydF4y2B一个对于整个对齐):gydF4y2B一个

要获得更详细的分析，请参见表gydF4y2B一个4gydF4y2B一个EF-中有9个单子叶ABP序列和32个双子叶ABP序列存在残基gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个．gydF4y2B一个

所有32个被研究的双抗ABPs和95%的nlp在EF-位点上有一个保守的组氨酸H162gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个．这两个NLP序列在下游4个位置(PiNPP1.2和PiNPP1.3)没有它，是不活跃的形式;可能源于最具侵略性的PiNPP1的基因复制gydF4y2B一个5种gydF4y2B一个．这两者在生物营养期和坏死期都有表达，而PiNPP1仅在后一阶段有表达[gydF4y2B一个17gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

Fellbrich [gydF4y2B一个6gydF4y2B一个]的研究表明，PiNPP1的最后8个残基可以被删除而不损失活性，但最后20个残基则不能(…ntdFGdgydF4y2B一个◇gydF4y2B一个AnvPmkdgnFltgydF4y2B一个◇gydF4y2B一个kvgnayya)。AnvPmkdgnFlt序列与坏死I型nlp中保守残基GxAnxP的一致性为100%。有趣的是，c端似乎对nlp和ABPs都很重要。c -末端合成的肽gydF4y2B一个玉米gydF4y2B一个ABP wdedcfeaak, 15-残基gydF4y2B一个n .烟草gydF4y2B一个Nt-abp1 c端肽(ywdeecyqttswkdel)和Nt-abp1本身已被证明可诱导超极化[gydF4y2B一个39gydF4y2B一个］．然而，与生长素的作用相反，nlp引起周围介质的去极化、碱化和KgydF4y2B一个^{+gydF4y2B一个}流出(gydF4y2B一个40gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

c端32个双核苷酸ABPs的直方图结果为yWDEqCyqtxxKDEL。突变实验表明kdel序列对ABPs的活性并不重要，可能会被删除，与两个阴性残基DE有关。由于nlp没有这样的序列，可以想象nlp与ABPs竞争导致了前面讨论的效应。gydF4y2B一个

除了abp之外，另一个在IMR大小方面类似的候选是gydF4y2B一个枯草芽孢杆菌gydF4y2B一个Gi |2635598，一种假设的蛋白质，没有确定的结构类似于人类半胱氨酸双加氧酶gydF4y2B一个2 ic1gydF4y2B一个．它是一种IMR大小为的单体gydF4y2B一个23gydF4y2B一个残和一圈gydF4y2B一个11gydF4y2B一个残留。［gydF4y2B一个41gydF4y2B一个]排列了10种不同生物的半胱氨酸双加氧酶，其中100%保守且功能重要的残基在图中大写gydF4y2B一个2gydF4y2B一个以便与自然科学计划的课程作比较。我们观察到，其中一些残基在坏死的I型nlp中是最保守的:例如，Y101和R103gydF4y2B一个βgydF4y2B一个_{一个gydF4y2B一个}， H133, H135和H193(作为离子配体)和D136。gydF4y2B一个

糖基化gydF4y2B一个

虽然用于检测糖缀合物中的糖的免疫分析研究没有揭示PpNPP1中的碳水化合物部分[gydF4y2B一个6gydF4y2B一个]，糖基化位点nxs存在于64%的坏死型nlp中(x = tgydF4y2B一个^{6gydF4y2B一个}V)在c62c89-gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个．糖基化发生在天冬酰胺(n)残基上，即所谓的nx(st)序列，这一过程的效率取决于残基x。gydF4y2B一个

糖基化在大多数细胞表面和分泌的蛋白质中是重要的，并且通常对细胞表面与其他亚基的相互作用(识别)、保护蛋白质水解攻击、蛋白质溶解性和热稳定性至关重要。例如,gydF4y2B一个p . 5gydF4y2B一个已经进化出一种蛋白酶抑制剂来克服植物蛋白酶的作用[gydF4y2B一个42gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

sequon ntsg的糖基化概率(见方法部分)在44 - 62%之间变化。例如PiNPP1.1为44%，PsojNIP为50%，PpNPP1为54%，BeNEP1为62%。此外，MpNEP1和MpNEP2预计不会被糖基化，因为它们的亮片(nws)中含有大量的色氨酸(w)。他的VdNEP和BeNEP2没有sequon。gydF4y2B一个

此外，单子叶和双子叶ABPs之间的一个重要区别[gydF4y2B一个31gydF4y2B一个]指出ABPs和nlp是相同的gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构是双子叶ABPs有一个糖基化位点靠近蛋白质的开始，这在单子叶ABPs中不存在(dis)。这个位点也出现在一些I型nlp中(见表gydF4y2B一个3.gydF4y2B一个)．gydF4y2B一个

的gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个- nlp的结构仍有待实验确定。然而，在本文中我们提出了一些证据表明它们属于Cupin超家族。使用cupin模板和I型NLP共识，我们能够计算出预测gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个的结构gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个富部(图中90-220位置)gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)，在分子动力学下表现出3nS的稳定性。这种结构是杯蛋白的典型特征。此外，上游线圈的结构的预测由两个半胱氨酸边界仍有待解决。I型nlp上游线圈中的半胱氨酸是二硫键结合的，通过从分析中去除这一序列简化了问题。然而，自由线圈的正确定位成为一个新的问题，它比第一个问题更复杂。它是可以自由移动的，还是它的一部分gydF4y2B一个β表gydF4y2B一个？它的糖基化位点指向在细胞表面锚定蛋白质的某种作用。gydF4y2B一个

几个gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个结构预测软件与中央一致gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个富裕部分排名靠前gydF4y2B一个α螺旋gydF4y2B一个这使得蛋白质的中心部分极有可能属于所有-gydF4y2B一个βgydF4y2B一个吟游诗人类。gydF4y2B一个

半胱氨酸的保守模式指向两种不同的NLP类型:I型NLP含有两个半胱氨酸上游gydF4y2B一个β桶gydF4y2B一个和II型nlp，含有两个额外的半胱氨酸在左边界gydF4y2B一个β桶gydF4y2B一个．预测显示，前两个键结合在一起，但其他两个键没有。WRKY蛋白中半胱氨酸的模式与II型NLPs之间的相似性如此之高，如果半胱氨酸以锌指构象参与金属投标也不足为奇。此外，WRKY蛋白参与了植物的病原体检测系统，这对于参与植物致病活性的蛋白质来说是一个有趣的“巧合”。不幸的是，我们只有WRKY蛋白质结构的一部分，锌指部分(c端)。gydF4y2B一个

数字gydF4y2B一个1gydF4y2B一个清楚地显示了GHRHDWE基序残基所起的生物学作用。为此，有必要3gydF4y2B一个^{理查德·道金斯gydF4y2B一个}组氨酸在结构(H193)下游的确切位置，根据cupin结构，也存在于95%的分析NLPs中。只有两个nlp没有，而且它们没有坏死活性。组氨酸在结构中的相对位置和数量指向含有金属离子的蛋白质。此外，确切的金属离子仍有待确定，但我们的研究指向锰或锌。gydF4y2B一个

Cupin超家族非常庞大，功能多样。许多这些功能依赖于谷氨酸残留，这似乎不存在于nlp中。当这种残留物存在时，cupins参与酶活性，如草酸氧化酶，脱羧酶，双加氧酶等。nlp是否具有一定的草酸催化活性还有待实验研究。在任何情况下，[CagydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}］gydF4y2B一个_{cytgydF4y2B一个}ROS (HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个})和草酸都在病原体防御和感知中混合。此外，木质素的加工高度依赖于氧化酶和过氧化物酶(cupins)。研究表明，生发芽具有草酸氧化酶的功能(将草酸转化为CO)gydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}和HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个})和超氧化物歧化酶(gydF4y2B一个$\mathrm{2gydF4y2B一个}{\text{OgydF4y2B一个}}_{\mathrm{2gydF4y2B一个}}^{-gydF4y2B一个}$+ 2 hgydF4y2B一个^{+gydF4y2B一个}→HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}+ OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}） ［gydF4y2B一个43gydF4y2B一个］．任何对这种活动的干扰对真菌都是有利的，因为HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}和[CagydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}］gydF4y2B一个_{cytgydF4y2B一个}．即使没有催化活性，褶皱也是抗氧化的，这是氧化酶、脱羧酶和过氧化物酶所必需的特性。gydF4y2B一个

与cupins相关的一类是生长素结合蛋白，它不表现出催化活性，但在植物细胞中作为信号转导器工作。与nlp相比，它们具有许多共同的结构特征和保守残基。在这方面，最显著的特征是组氨酸H162的保守性，95%的nlp和几乎所有双子叶ABPs中都存在组氨酸H162，这与nlp只攻击双子叶植物有关。此外，ABPs向细胞传递信息的方式与离子通道密切相关。相应地，植物对nlp的第一个反应是离子电流的增加导致[Ca]的升高gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}］gydF4y2B一个_{cytgydF4y2B一个}．H的标高gydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}(和其他ROS物种)是[CagydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}］gydF4y2B一个_{cytgydF4y2B一个}elevation, and both [Ca .gydF4y2B一个^{2 +gydF4y2B一个}］gydF4y2B一个_{cytgydF4y2B一个}标高和HgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}OgydF4y2B一个_{2gydF4y2B一个}通过它们在衰老和坏死活动中的作用而为人所知。除了所有这些分子和功能线索，例如，真菌gydF4y2B一个m .孢gydF4y2B一个导致女巫扫帚的形成gydF4y2B一个t .可可gydF4y2B一个［gydF4y2B一个5gydF4y2B一个］．这种反应与细胞分裂素/生长素的平衡有关，是多种植物早期对生物胁迫的典型反应。gydF4y2B一个

有几种候选cupin具有相容的IMR大小，但只有双核苷酸ABPs似乎表现出与nlp的IMR中保守组氨酸的大小和存在以及预测的糖基化位点相关的兼容性。当然，植物上任何类似生长素的活动都对真菌有利(如上所述)。最后，正如Fellbrich所讨论的[gydF4y2B一个6gydF4y2B一个]， nlp的活性依赖于蛋白的C端和n端，这是ABPs共有的特征。gydF4y2B一个

为了获得非冗余和代表性的nlp集合，所分析的所有序列的成对距离都大于10%。这些生物和序列包括42个nlp(见表)gydF4y2B一个2gydF4y2B一个)．gydF4y2B一个

I型和II型nlp使用ClustalW对齐[gydF4y2B一个44gydF4y2B一个，默认参数为和gydF4y2B一个gapopengydF4y2B一个= 0(见[gydF4y2B一个45gydF4y2B一个]和[gydF4y2B一个46gydF4y2B一个])。gydF4y2B一个

这些序列是通过计算I型和II型nlp中最频繁的残差得到的。如果在序列对齐过程中，在超过50%的序列中引入了间隙，则从序列中删除相应的位置。因此，I型和II型NLP共识是≥50%序列的共识。此外，所有序列中超过85%的残基以粗体和大写显示(见图)gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)．例如，GHRHDWE序列出现在所有I型nlp中≥85%，表明其在蛋白功能中发挥着重要作用[gydF4y2B一个4gydF4y2B一个］．所有序列中超过70%的残基以粗体显示(见图)gydF4y2B一个1gydF4y2B一个)．例如，同一序列GHrHDwE在II型NLP中显示出较低的保守性，因为残基r和w出现在< 85%的II型NLP序列中。gydF4y2B一个

我们已经执行了一个对齐(ClustalW与gydF4y2B一个gapopengydF4y2B一个= 0)的I型nlp，我们有坏死活动的实验证据(用1表示)gydF4y2B一个^{•gydF4y2B一个}两个填充的圆gydF4y2B一个^{••gydF4y2B一个})，见表gydF4y2B一个2gydF4y2B一个我们在图中用星号表示所有坏死序列中保守的残基gydF4y2B一个1gydF4y2B一个(见[gydF4y2B一个47gydF4y2B一个])。gydF4y2B一个

二级结构预测使用PredictProtein位点的PROF程序进行[gydF4y2B一个22gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

在PDB中搜索gydF4y2B一个

将42个nlp中132-138和132-139位置的所有序列提交给蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)网站的搜索服务，得到10个最佳候选序列[gydF4y2B一个48gydF4y2B一个，gydF4y2B一个49gydF4y2B一个](搜索工具=gydF4y2B一个FastagydF4y2B一个)．每个序列生成一个候选蛋白列表，这些候选蛋白可以按e值排序。使用Sequence features =在PDB中搜索本地序列gydF4y2B一个主题gydF4y2B一个．gydF4y2B一个

二硫键和糖基化分析gydF4y2B一个

利用DISULFIND程序分析半胱氨酸之间的结合模式[gydF4y2B一个50gydF4y2B一个］．我们还使用了DiANNA 1.1二硫键预测程序[gydF4y2B一个29gydF4y2B一个]用于BeNEP2的分析。为了确定c62c89-中序列的糖基化概率gydF4y2B一个线圈gydF4y2B一个，我们将所有I型NLP序列提交到NetNGlyc 1.0服务器[gydF4y2B一个51gydF4y2B一个］．gydF4y2B一个

分子的分子结构gydF4y2B一个

我们使用ClustalW和默认参数gydF4y2B一个gapopengydF4y2B一个= 0.0以对齐图中所示的序列gydF4y2B一个2gydF4y2B一个．注意，对于对齐，我们只使用gydF4y2B一个β链gydF4y2B一个-富饶地区(gydF4y2B一个βgydF4y2B一个-桶域)，位置90-220。的gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个-结构用分子建模程序构建gydF4y2B一个spdbvgydF4y2B一个［gydF4y2B一个52gydF4y2B一个的单体作为模板gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个蛋白质。首先，我们用拉斯摩尔切割gydF4y2B一个βgydF4y2B一个的富裕地区gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个蛋白质。然后，我们使残基突变gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个序列到I型NLP共识中的那些残基，引入了必要的残基，其中对齐导致了空白gydF4y2B一个1 lr5gydF4y2B一个序列和删除残留的情况下，对齐产生缺口的I型NLP共识。在每一步之后，我们执行最小化，将新的残差拟合到旧的结构中。我们小心地只在蛋白质的螺旋区引入和删除残基。用GROMACS和最陡下降算法将得到的结构最小化，直到能量达到0.01 kJ/mol。然后，我们在真空条件下，在100ps的时间内，从0到30k进行模拟退火。所用力场为opls-aa/l。最后，在显式溶剂(spc水模型)中进行了100 pS从0到10 K和3 nS从10 K到273 K的分子动力学模拟退火。gydF4y2Ba

作者感谢弗朗西斯科·哈维尔·梅德拉诺·马丁审阅了手稿。N. Lemke也感谢A. S. K. Braz的有益讨论和建议。CNPq(研究补助金506414/2004-3和474278/2006-9)和FAPESP(研究补助金2007/02827-9)部分支持的工作。gydF4y2B一个

从属关系gydF4y2B一个

1. Programa de Pós-Graduação em Computação Aplicada, Unisinos, Av. Unisinos - 950, São莱奥波尔多，巴西gydF4y2B一个

   Adelmo L Cechin和Marialva SinigagliagydF4y2B一个

2. 联合国环境署Física e Biofísica，巴西博卡图Rubião小区gydF4y2B一个

   内伊LemkegydF4y2B一个

3. 生物技术研究所，UCS, R. Francisco Getúlio Vargas 1130，南卡夏亚斯，巴西gydF4y2B一个

   塞吉奥EcheverrigaraygydF4y2B一个

4. Departamento de Genética e Evolução, IB/UNICAMP，坎皮纳斯，巴西gydF4y2B一个

   Odalys G Cabrera & Gonçalo AG PereiragydF4y2B一个

5. Centro de Ciências Rurais, UFPampa/UFSM, São Gabriel，巴西gydF4y2B一个

   José CM MombachgydF4y2B一个

相应的作者gydF4y2B一个

对应到gydF4y2B一个内伊LemkegydF4y2B一个．gydF4y2B一个

作者的贡献gydF4y2B一个

GAGP和OGC提供了蛋白质序列和工作的主要动机。ALC、MS和JCMM构想了将NLP结构和关键残基与cupin超家族的结构和关键残基联系起来的研究。ALC和MS对保守序列进行比对和分析。ALC执行gydF4y2B一个二维gydF4y2B一个-结构预测和对齐。ALC和NL计算了所提出的方法gydF4y2B一个3 dgydF4y2B一个结构。SE和MS参与了NLP功能的提出。NL, JCMM和MS对工作进行了主要修改。所有作者都参与了这份手稿的撰写。gydF4y2B一个

开放获取gydF4y2B一个本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(gydF4y2B一个https://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2B一个)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。gydF4y2B一个

转载及权限gydF4y2B一个