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深入了解发根形成的早期步骤procuste1的纤维素合成酶突变体拟南芥

BMC植物生物学体积8，文章号:57（2008）引用本文

摘要

背景

植物根毛起源于表皮细胞的形成涉及极性起始位点的选择和初始毛隆起的产生，这需要局部细胞壁松动。在拟南芥中，极性起始位点位于表皮细胞的基底端。然而，目前对毛发起始部位的选择机制或实现局部毛发生长的机制知之甚少。拟南芥的procuste1（prc1-1为了研究细胞壁松动在毛发形成早期阶段的作用，研究了纤维素合成酶突变体。

结果

的prc1-1突变体表现为毛细胞不受控制的优先膨大，并伴有毛发定位错误。结合prc1-1突变体与根毛缺陷6-1（rhd6-1)，其本身几乎完全没有根毛，导致根毛形成的显著恢复。的pEXPANSIN7:绿色荧光蛋白（pEXP7:绿色荧光蛋白)标记，该标记在野生型根的毛胚细胞档案中特异性表达，在rhd6-1突变体。然而,pEXP7:绿色荧光蛋白表达式rhd6-1 / prc1-1双突变体在表皮细胞亚群中恢复，这些细胞要么形成了根毛，要么在毛发形成的早期阶段表现出与EXP7功能一致的隆起表型。

结论

这些结果表明RHD6作用上游的正常细胞壁松动事件涉及EXP7RHD6功能缺失时，RHD6的松动和伴随EXP7表达式被阻塞。在prc1-1突变背景下，毛发形成过程中对RHD6的需求减少，这可能是由于模仿毛发形成过程中细胞壁松动事件的较弱细胞壁结构造成的。

背景

根毛是由表皮细胞产生的细长突出物，其作用是吸收养分和水分，并将根固定在土壤中[1］．在野生型拟南芥中，根毛由被称为成毛细胞的表皮细胞形成，这些表皮细胞覆盖在两个皮层细胞之间的边界上[2］．根毛的形成可分为两个不同的阶段，即起始阶段和生长阶段[3.］．根毛起始的第一个可检测标记是Rop GTPase的出现，该酶在任何可见隆起形成之前定位于成毛细胞的基底端[4，5］．根毛起始的第一个可见迹象是形成一个凸起，在拟南芥中，这个凸起通常位于表皮细胞的基底端[6，7］．为了形成隆起，细胞壁必须经历松动，而且细胞质的碱化，细胞壁的酸化[8]、扩张素(EXP)及木葡聚糖内转糖基酶(XET)活性[9都有助于这一步。XETs通过破坏和重组交联纤维素微原纤维的木葡聚糖的糖苷键起作用，而膨胀素介导细胞壁松动，而不经历细胞壁主要结构成分的破坏。XET活性已被证实局限于根毛隆起形成的部位[9，表明它在头发形成中起着特定的作用。拟南芥扩增素基因中的两个(AtEXP7而且AtEXP18)在成毛细胞中表达，但在成房细胞中不表达[10]，这表明它们也在细胞壁的松动中发挥作用，以促进毛发的萌生和生长。膨胀素在根毛形成中的作用被进一步证实，这一发现发现膨胀素在玉米根系隆起形成的部位积累[11］．此外，在大麦HvEXPB1根无毛组织中无扩张素基因表达大麦秃根突变体，但2个突变体正常，形成短根毛。这表明HvEXPB1是根毛形成所必需的[12］．

纤维素是细胞壁的主要结构成分，由β-1,4连接的葡萄糖残基链组成，这些残基被组装成微原纤维。细胞壁中微原纤维的排列方式影响细胞的扩张方式。已在拟南芥中描述了一些突变体，它们表现出异常的细胞扩张，其中一些在纤维素生物合成中受到影响。例如，在rsw1（CESA1；［13]),rsw2（KORRIGAN；［14，15]);rsw3(葡糖苷酶II;［16])和rsw10(ribose-5-phosphate异构酶;［17])突变体。的rsw10突变体表现出根生毛细胞的膨大，这被认为是由于根中缺乏纤维素引起的。有趣的是，的表达RSW10是否仅限于毛细胞档案提供了一个可能的联系之间的根毛形成和异常扩张rsw10．的根表皮膨大（reb1 / rhd1)突变的拟南芥也表现出毛胚细胞的异常扩张[18，19］．REB1编码udp - d -葡萄糖4-氨基戊二烯酶的异构体，该酶在形成udp - d -半乳糖中起作用。的reb1突变体缺乏半乳糖化木葡聚糖和阿拉伯糖基化(1→6)-β- d -半乳聚糖[20.］．有趣的是,reb1突变体显示出在成毛细胞中JIM14和LM2阿拉伯半乳聚糖表位的缺失，而它仍然存在于成毛细胞中[19]这意味着成毛细胞阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)是正常各向异性膨胀所必需的。

在本研究中，我们使用了procuste1（prc1-1)拟南芥缺纤维素突变体，探讨细胞壁结构在调节根毛形成中的影响。拟南芥的prc1-1在纤维素合成酶中发生了突变CESA6导致细胞壁纤维素含量减少的基因[21］．突变体prc1-1幼苗表现为毛发膨大，形成根部的成毛细胞，且初生根伸长减少[21，22］．我们的研究表明prc1-1能部分绕过头发形成中的缺陷吗rhd6-1根无毛突变体，表明细胞壁结构是毛形态发生的重要因素。

结果

根表皮向内凸起prc1-1主要与毛细胞有关

尽管前面有描述prc1-1表型方面，还没有对根部缺陷，特别是表皮细胞鼓胀现象进行详细分析。检查prc1-1从图中可以看出，膨大的细胞主要排列在顶端-基底部，两侧是未膨大的细胞。1 b)．这说明鼓胀现象在prc1-1根可能不是一个随机事件，而是以某种方式与特定细胞的位置属性联系在一起。为了进一步研究这一点，用树脂埋入根的径向切片prc1-1野生型幼苗和每个鼓包或非鼓包的细胞根据其处于毛细胞(毛细胞)位置还是成毛细胞(非毛细胞)位置进行评分。膨大细胞主要分布于毛胚细胞，但也不完全是prc1-1根(图。1 d, E)．在野生型根组织中没有发现表皮细胞膨大的证据。1 a, C)．这表明表皮细胞的膨大与它们相对于下层皮层细胞的径向位置有关，并且可能与毛发萌生和/或生长的过程有关。

图1
图1

prc1-1根表皮膨大，主要表现在生毛细胞中．野生型(A)和prc1-1根(B)在MS琼脂上生长5天。径向剖面野生型(C)和prc1(E)野生型的成毛细胞或成房细胞位置凸出和未凸出的表皮细胞数量的量化，prc1-1, rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1突变体。错误条显示sd。Bar = 100 μm A, B;50 μm, C, D。

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虽然凸出的表皮细胞常形成根毛，但很明显，非凸出的细胞也能形成根毛，有些凸出的细胞不能形成根毛。从50个独立的初生根(不包括缺乏根毛的未膨出细胞)的500个细胞样本量中，大多数(65%)膨出并形成了毛发。未形成毛发的隆起细胞(17%)和未隆起但形成毛发的细胞(18%)明显较少，但比例相似。虽然发育事件导致头发的形成prc1-1通常导致隆起的细胞表型，有可能由不隆起的细胞形成毛发。

突变体prc1-1根的表皮细胞长度减少，根毛密度增加

的prc1-1根比野生型短(图2)。2)，而且外表多毛。这可能是…的结果prc1-1与野生型相比，突变型的表皮细胞长度减少或可能形成更多的根毛。为了测试这些可能性，野生型和prc1-1清除根系，测量分化的根毛细胞的毛细胞长度。突变体prc1-1与野生型相比，成毛细胞长度减少了43%(图2)。2 b)．因此，越短prc1-1根长主要是由于减少细胞伸长而不是减少细胞分裂。以进一步确定毛发密度明显增加的依据prc1-1根，每毫米的毛数在毛细胞的单独文件中计数。这表明prc1-1根毛密度几乎是野生型的两倍。2摄氏度)．尽管大多数prc1-1毛细胞形成单根毛，4%的表皮细胞被观察到有两根根毛(n = 358细胞)(图。2 e)．相比之下，野生型成毛细胞只形成单根毛发(n = 236个细胞)(图2)。二维)．同样值得注意的是prc1-1根毛有显著程度的分枝(图;2 e)．因此，在根毛的密度较高的外观prc1-1主要是由于表皮细胞长度的减少，而双发和毛发分支表型的贡献较小。

图2
图2

初生根的生长和毛发的发育受到影响prc1-1突变体．(A)野生型和根伸长prc1-1发芽后2 - 9天。(B)野生型毛胚细胞长度;prc1-1，rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1主根(n = 600)。(C)野生型7日龄生毛细胞档案中每mm根毛数;prc1-1，rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1幼苗。(D)野生型根，显示单根毛，起源于表皮细胞的基部。填满的三角形标志着形成表皮细胞的毛发基底壁的位置。(E)prc1-1根显示2根毛起源于一个单一的表皮细胞(*)和一个分枝的根毛，其中分支点被一个开放的三角形突出。误差柱为SEM (B)或SD (C)， Bar = 50 μm。

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罗普定位和根毛定位的极性是可变的prc1-1

在野生型根中，毛通常开始生长并向毛细胞的基部生长[6，7，23］．在可见的凸起形成之前，未来毛发形成的位置由Rop GTPase标记，因此代表了根毛形成的非常早期的事件[4，5］．由一定比例的双毛形成prc1-1表皮细胞(图;2 e)表明毛发萌生部位的控制受到影响。为了验证这一点，我们测量了野生型和野生型的毛发形成相对于表皮细胞基底端的位置prc1-1突变的幼苗。头发位置的分布prc1-1使用Fisher精确检验(请参见下面的可用性和需求部分)(使用2 × 5表(p = 0.0)或Mann-Whitney秩和检验(请参见下面的可用性和需求部分)确定与野生型显著不同(p < 0.05)，(图3 d)．有一个主要的转变prc1-1与野生型相比，根毛向更基部的位置(图。3 a, B)．除了基底移位的毛发prc1-1也有较小比例的毛发显示向更尖的位置转移(图。3 c)．

图3
图3

根毛形成的位置在prc1-1突变体．测量野生型和野生型的根毛相对于基底细胞壁的位置prc1-1幼苗。(A)野生型，在毛胚的基部有典型的根毛。(B)pcr1-1显示出基部超极化的根毛。(C)prc1-1显示顶端移位的根毛。(D)野生型和野生型相对根毛位置的频率分布prc1-1．Rop蛋白定位于野生型和野生型prc1-1使用特定的抗rop抗体和DAPI染色来突出细胞核的位置。Rop信号为绿色，DAPI为蓝色(E)野生型(F)基本超极化Rop信号prc1-1(G)根尖移位的Rop信号prc1-1生毛细胞。箭头指示横向细胞-细胞界面的位置。Bar = 50 μm (A, B, C)， 20 μm (E, F, G)。

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对野生型和野生型的Rop GTPase进行免疫定位prc1-1以确定突变体中这种早期根毛位置标记的极性是否也发生了变化[24］．在野生型拟南芥根中，Rop信号定位于毛细胞的基部，与根毛的后续位置一致(图2)。3 a, E)．在prc1-1Rop信号在一些细胞中也被发现定位于成毛细胞的基底区域，但值得注意的是，该信号的离散性低于野生型，并且通常定位于更极端的基底位置(图2)。3 b, F)．然而，在一定比例的表皮细胞中，Rop信号明显转移到更顶端的位置(图。3 c、G)与观察到的头发位置的变化一致prc1-1表皮细胞(图;3 d)．

表示的表达式模式PRC1启动子活性不能解释成毛细胞相对于成房细胞膨大的优势

偏向性表皮向内凸起prc1-1成毛细胞与成房层细胞的比较(图。1 d, E)表明这与成毛细胞特有的特征或功能有关。另外,PRC1表达可能局限于该表皮细胞子集中具有特定缺陷的毛胚细胞文件。为了检验这些可能性，pPRC1：：uidA对GUS活性进行染色，结果显示GUS在根的所有表皮细胞以及下面的皮层、内胚层和中柱细胞中均有明显表达。4 a、B)．因此，成毛细胞表皮膨大的优势不能用差异来解释PRC1启动子活性在成毛细胞中与成房层细胞相比。不能排除两种表皮细胞类型之间PRC1蛋白或原发细胞壁纤维素合成酶复合物的活性不同的可能性。

图4
图4

PRC1在根的所有细胞中检测到启动子驱动的GUS表达．放置7天的p的整个坐垫(A)和径向切片(B)PRC1：：uidA主根GUS活性染色。Bar = 50 μm。

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的prc1-1突变可以部分挽救根毛的形成rhd6-1突变体

如果毛细胞的鼓胀与毛发的形成有关，那么可以假设鼓胀会在什么时候减少或消除prc1-1在rhd6-1突变背景基本上没有毛发[6］．为了验证这一理论，在prc1-1而且rhd6-1检查它们的根是否有凸起的根表皮细胞。膨化细胞的发生和形成的膨化细胞的大小明显减少prc1-1 / rhd6-1双突变体(图;5 d)与prc1-1(无花果。1 e，5度)．引人注目的是，有相当数量的根毛形成的prc1-1 / rhd6-1双突变体(图;2摄氏度，5 d)，尽管形成根毛的成毛细胞的比例不到野生型或野生型的一半prc1-1单突变根(图;5 e)．毛发的形态形成于rhd6-1 / prc1-1双突变体与野生型相似，但长度有所缩短(图2)。5 f)．与此形成鲜明对比的是rhd6-1在我们的生长条件下，在MS琼脂上生长时，根没有形成任何毛发(图。2摄氏度，5 b)．这表明prc1-1缺陷能够部分绕过根毛形成过程中对RHD6的需求。

图5
图5

根毛发育rhd6-1是部分恢复在prc1-1突变体的背景．野生型(A)的初级根组织，rhd6-1(B),prc1-1(C)和rhd6-1 / prc1-1(D)在MS琼脂上生长5天的幼苗。(E)野生型中显示根毛形成的成毛细胞百分比;rhd6-1，prc1-1而且prc1-1 / rhd6-1(n = 600 cells)。(F)野生型根毛长度;rhd6-1，prc1-1而且prc1-1 / rhd6-1(n = 100)。误差柱为SEM (E)或SD (F)， Bar = 100 μm。

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EXP7表达式rhd6-1根表皮细胞部分恢复prc1-1

根毛膨出的形成被认为与扩张素的细胞壁疏松活动有关，并与细胞外壁疏松蛋白的表达相一致EXP7野生型根中的基因。中的EXP7表达式不存在rhd6-1突变体(10］．因此，我们问是否prc1-1突变就能恢复EXP7基因表达rhd6-1突变体的背景。的pEXP7:绿色荧光蛋白马克被传给了单打prc1-1而且rhd6-1变种人以及prc1-1 / rhd6-1双突变体及其表达检测。与先前的研究结果一致[10),pEXP7:绿色荧光蛋白表情是缺席的rhd6-1突变体(无花果。6摄氏度)．然而，与我们的发现一致的是prc1-1部分挽救了根毛形成和诱导表皮隆起rhd6-1(无花果。5 d)，我们观察到pEXP7:绿色荧光蛋白表达部分恢复prc1-1 / rhd6-1双突变体，在那些形成根毛和/或表现出鼓胀的单个表皮细胞中特别观察到。6 d)．在prc1-1突变体pEXP7在形成凸起或产生根毛结构的表皮细胞中观察到GFP的表达(图。6 b)．这些发现将表皮凸起的形成与诱导EXP7表达式。

图6
图6

中不存在的EXP7表达式rhd6-1是恢复在亚群的表皮细胞在rhd6-1 / prc1-1双突变体．pEXP7：：绿色荧光蛋白将毛胚特异标记引入野生型，prc1-1，rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1．幼苗在MS琼脂上生长5天，用带GFP过滤器的徕卡荧光显微镜观察GFP表达。野生型(A);prc1-1(B);rhd6-1(C);prc1-1 / rhd6-1(D). Bar = 100 μm。

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是在恢复头发的形成吗rhd6-1由prc1-1通过乙烯依赖途径起作用?

通过使用银离子阻断乙烯受体，可以抑制野生型幼苗根毛的形成[25]或通过氨基乙氧基乙烯基-甘氨酸(AVG)抑制乙烯合成[6，26，33］．相反，乙烯水平升高可刺激野生型植物根毛形成，并可导致野生型植物根毛形成的恢复rhd6［6］．这就提出了一个问题，是否部分恢复了头发的形成rhd6-1通过prc1-1通过乙烯依赖途径起作用。为了测试野生型prc1-1，rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1在10 μM AgNO溶液中培养3.或2 μM AVG+或AVG在阻断野生型和所有测试的突变组合的毛发形成方面同样有效(图2)。7)．有趣的是，尽管Ag+而AVG治疗几乎完全阻止了头发的形成prc1-1时，仍有显著程度的表皮细胞鼓胀，尽管与没有抑制剂的根生长相比有所减少(图。7d e f)．这也表明，增加乙烯的形成prc15 μM氨基环丙烷羧酸(ACC)处理不消除根表皮凸起表型[27］．由此可见表皮膨大的表型prc1-1至少部分不依赖于乙烯，而头发的形成的恢复rhd6-1通过prc1-1乙烯依赖(图。7 k, L)．

图7
图7

根毛修复在吗rhd6-1通过prc1-1通过乙烯依赖途径起作用?在不添加(A、D、G、J)和10 μM AgNO的MS琼脂上培养7天，研究了幼苗根毛的发育3.2 μM AVG阻断乙烯合成(C, F, I, L) Col野生型(A, B, C)，prc1-1(d, e, f)，rhd6-1(G, H, I)和prc1-1 / rhd6-1(J, K, L). Bar = 100 μm。

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减少根伸长不能恢复根毛rhd6-1

的prc1-1突变背景导致在rhd6-1与头发的恢复相吻合。这就提出了一种可能性，即仅仅减少毛细胞的伸长就足以诱导毛发的形成rhd6-1．为了验证这一点，rhd6-1根在缺乏蔗糖但添加1%阿拉伯糖的MS琼脂上生长，阿拉伯糖会减少初级根的伸长[28］．1%阿拉伯糖抑制初根伸长的效果与野生型和野生型相似rhd6-1(无花果。8我)．对表皮细胞长度的测量表明，阿拉伯糖处理导致40%的减少，这与野生型和野生型之间的差异相似prc1-1或prc1-1 / rhd6-1根生长在1%的蔗糖(图。2 b)．没有根毛形成的证据rhd6-1在1%阿拉伯糖的存在下生长(图。8 f)相比之下，野生型prc1-1和prc1-1 / rhd6-1双突变体(图;8e g h)．使用0.3%木糖，4%山梨糖醇，3.5%肌醇或3%甘露醇作为碳源(数据未显示)，也得到了类似的结果，结果是减少rhd6-1根系伸长率27% ~ 60%。因此，减少表皮细胞伸长不是一个显著的贡献因素，在恢复毛发形成rhd6-1通过prc1-1．

图8
图8

根伸长和表皮细胞长度的减少不会引起根毛的形成rhd6-1．野生型(A, E)，rhd6-1(B, F),prc1-1(C, G)和prc1-1 / rhd6-1(D, H)在含有1%蔗糖(A-D)或1%阿拉伯糖(E-H)的MS琼脂上生长8天。(I)测量初级根长，并表示为1%蔗糖下野生型生长的百分比。(J)野生型成熟根表皮细胞长度;rhd6-1，prc1-1而且prc1-1 / rhd6-1用1%蔗糖或1%阿拉伯糖生长(n = 30)。误差条形显示s.d Bar = 100 μm。

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讨论

在这项研究中，我们试图解决的作用，细胞壁的强度和松动，在控制头发形成的早期步骤利用prc1-1突变体CesA6纤维素合成基因。我们的分析结果显示，成毛细胞呈放射状肿胀prc1-1根须与毛发形成的早期步骤有关，在无毛的根须中肿胀大大减少rhd6-1突变体的背景。径向膨胀prc1-1成毛细胞让人联想到类似的表型rsw10(核糖-5-磷酸异构酶)[17),根表皮膨大（reb1 / rhd1) [18突变体。的rsw10突变体,如prc1-1，显示出毛细胞膨大或膨胀，并减少细胞壁纤维素含量[17］．的RSW10该基因在根的远端延伸区和较成熟根组织的表皮、皮层和维管细胞中表达。这表明，细胞壁的改变是由rsw10不限于成毛细胞，成毛细胞的隆起可能与根毛的起始和/或生长有关，如图所示prc1-1在这项研究中。

的表达模式PRC1由p表示PRC1GUS报告包括成毛细胞和成房细胞文件以及底层细胞层(图。4)．然而，这种活动的可能性PRC1所使用的启动子区域不能反映内源基因的真实表达模式，不能排除。尽管如此，没有证据表明有优先的三毛细胞表达PRC1，有力地表明，这本身不能解释表皮细胞膨大的优势在毛发形成细胞prc1．原代细胞壁纤维素生物合成复合物被认为由3个不同的CesA亚基组成;即CesA1, CesA3及cesa6相关[13，16，21，29- - - - - -32］．不能排除的可能性是，由于其他CesA蛋白的表达模式或活性或其他重要因素，在成毛细胞和成毛细胞文件中纤维素生物合成复合物的功能不同。然而，细胞壁纤维素成分的改变并不是控制成毛细胞膨胀特性的唯一因素。分析reb1突变表明AGPs参与了各向异性的细胞扩张[19］．因此，许多不同的因素有助于控制毛胚细胞的扩张部位。

Rop in定位错误prc1-1不太可能解释毛胚形成的凸起

野生型拟南芥的根毛始终位于毛胚细胞的基部[6，7，23这意味着存在控制这种定位的发育机制。最近的研究表明，生长素为头发极性提供位置信息，这至少部分是通过介导的AUX1 / EIN2 / GNOM作用于Rop GTPases募集的上游到毛发起始部位[24］．尽管如此，目前对细胞壁中发生的修饰以及这些修饰在哪里发生以促进毛发隆起形成及其后续生长的了解相对较少。

在prc1-1成毛细胞发生在整个细胞外表面，这与野生型中所见的与毛发起始部位相关的正常局部凸起形成对比。然而，不太可能prc1-1凸起是不正常的毛发状结构，因为正常的毛发通常从凸起的表面发育而来。这进一步得到以下事实的支持，即在未经历导致毛发萌生的步骤的成房细胞中发现了一些有限的鼓胀。尽管Rop在某些地方被发现定位错误prc1-1尽管在野生型细胞中它比野生型细胞更分散，但它仍然保持在一个离散的斑块中(图2)。3e f g)．因此，Rop定位错误不太可能直接导致某些钻头整个外表面不受控制的鼓胀prc1-1生毛细胞。然而，活化的gtp结合形式的Rop2和Rop4的组成性表达导致表皮细胞膨大，使人联想到prc1-1表型(4，5］．在这种情况下，这可能是由于Rop标记整个细胞壁的松动，而不是一个离散的基本局部斑块。因此，CA-Rop在野生型中表达可能导致异位细胞壁松动prc1-1表现型。Rop错位的原因有一些，但不是全部prc1-1成毛细胞和更弥散的分布(图;3.)尚不清楚，但提示细胞壁结构或组成在一定程度上影响Rop蛋白的定位。

头发的形成rhd6-1能否部分获救prc1-1

虽然RHD6显然是正常毛发形成的一个重要因素，但很明显，在生长介质中应用生长素或乙烯可以绕过对其的需求[6］．的RHD6基因已被克隆，并显示编码一个基本螺旋-环-螺旋转录因子[33］．RHD6富集于分生组织和伸长区的毛母细胞核内，但在根毛出现前消失。这证实了RHD6在根毛形成的早期阶段和凸起形成之前起作用。有趣的是，密切相关的基因RHD6-LIKE1（AtRSL1)也显示出类似于RHD6．通过制作rhd6 / rsl1双突变体对毛发发育的影响是协同的，这表明这两个转录因子在调节毛发发育中共同起作用。本文的研究结果表明prc1-1突变能够部分恢复根毛的形成rhd6-1突变体(无花果。2摄氏度，5d e f)．这是有可能的部分救援rhd6-1根毛缺陷可能取决于功能性RSL1的存在。虽然这还没有经过测试，但很明显，RSL1的存在rhd6-1突变背景不足以促进根毛的形成，除非改变生长条件，例如生长在玻璃纸上[33]或添加生长素或乙烯[34］．而机制为prc1-1根毛的部分修复rhd6-1目前尚不清楚，双突变体中毛发的形成伴随着蛋白的表达这一事实提供了线索EXP7在一个rhd6-1背景。之前有研究表明EXP7而且EXP18表达rhd6-1可通过激素和环境处理，诱导根毛形成而恢复[10］．这些发现与这一观点相一致EXP7可以起到放松细胞壁的作用，从而促进头发的形成。这一发现进一步支持了这一结论，即成毛细胞的凸起区域富含膨胀蛋白[11］．而本研究的结果也支持了这样的结论RHD6不直接控制转录EXP7的功能作用EXP7仍然需要澄清，因为功能丧失突变体不显示表型[10］．

根毛修复prc1-1 / rhd6-1通过乙烯依赖途径发生

根毛的形成依赖于乙烯的产生和感知，可以使用合成抑制剂如AVG或银作为乙烯受体的抑制剂来阻止。之前的研究表明prc1在ACC上生长的幼苗表现出三重反应，因此突变体对乙烯敏感。这也表明prc1-1不太可能过量生产乙烯，因为在没有外源乙烯的情况下，它不表现出三重反应。此外，双突变体之间prc1-1乙烯不敏感ein2-1没有废除成长的缺陷吗prc1-1突变体(22］．这表明prc1-1生长缺陷可能与乙烯无关。本研究结果表明，AVG和Ag+能有效阻断根毛的形成prc1-1表皮细胞仍然表现出膨大的表型(图;7 e, F)．还发现乙烯不能挽救显型的膨胀prc1-1［27］．因此，鼓胀的表型至少部分地独立于乙烯作用。这种可能性prc1-1突变导致根表皮细胞内乙烯过量生产目前不能打折。然而，这是不可能测量乙烯生产专门在根表皮细胞来解决这个问题。

根毛萌生时细胞壁松动的模型

我们的结果表明，在野生型成毛细胞中，将Rop gtpase靶向于一个离散的基底位置，标志着该区域的局部细胞壁松动。这就提出了细胞壁松动是如何局限于Rop位点的问题。其中一种机制可能是通过激活钾通道而局部增加外体pH值[12从而诱导膨胀蛋白的活性。在prc1-1突变体这一过程受到几个方面的影响。首先，细胞壁结构的改变会导致根尖或基底移位和一些Rop定位的模糊，尽管目前还不清楚为什么会发生这种情况。有人提出，正常的膨胀压力的增加发生在野生型，但由于整个prc1-1细胞壁可能变弱，整个外表面凸出，而不仅仅是Rop定位的位置。有趣的是，根毛仍然可以从凸起形成，这表明Rop或另一种未知的特定位置信号仍然能够指导头发形成的正常隆起后步骤。

这是可行的RHD6通常需要引导细胞机制导致细胞壁松动等等rhd6突变体不会发生这种情况。通过将rhd6-1在一个prc1-1突变背景下，细胞壁松动的要求独立于RHD6实现，毛发生长可以进行。有趣的是prc1-1 / rhd6-1根,EXP7这种表达在膨大或形成根毛的细胞中特别存在。这表明EXP7是根毛形成的重要因素。一种有趣的可能性是，EXP7是由成毛细胞的径向扩张诱导的。在野生型中，这需要细胞壁最初的松动，可能是通过酸化和XET活性。在rhd6-1细胞壁松动可能被阻断，因此没有诱导EXP7．然而在prc1-1 / rhd6-1根的细胞壁已经在一个细胞子集中被充分削弱，从而允许膨胀压力引起径向扩张，进而引起的反馈感应EXP7表达式。这将导致根壁进一步松动，使根毛得以形成。

结论

的prc1-1突变体提供了细胞壁结构影响根毛形态发生的有用信息，也提供了有关的作用RHD6在头发形成中。通过影响细胞壁的结构和组成prc1突变后，根毛形成中对功能性RHD6的需求可以部分绕过。然而，还需要进一步的工作来阐明不同遗传和生理因素之间复杂的相互作用，这些因素共同决定了毛发形成的位置及其随后的生物发生。

方法

拟南芥的生长

野生型(哥伦比亚0生态型)和突变型种子表面灭菌[35和播种在体外在Murashige和Skoog (MS)琼脂上(4.3 g MS盐(Duchefa, Haarlem，荷兰);1%蔗糖，pH 5.8, 0.5 M KOH;1%植物琼脂;Duchefa, Haarlem，荷兰)。过滤灭菌硝酸银(Fisher Scientific UK Ltd, Loughborough UK)或AVG (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany)在适当的地方经过高压灭菌后添加到介质中。种子萌发前在4℃低温下冷冻48 h，光照时间为120 μmol m，光照时间16 h2 -年代－1光照强度(飞利浦TL-D 36W/840灯泡)，23°C，除非另有说明。在120 μmol m光强的控制生长室中进行土壤栽培2 -年代－1在23°C下光照16小时。

根组织分析

计算野生型的根毛数量，prc1-1，rhd6-1,prc1-1 / rhd6-1在垂直方向的MS琼脂板上生长7天的幼苗。根被固定在水合氯醛:甘油:H的溶液中2O 8:3:1，在20°C下放置过夜以清除。使用Axioplan 2显微镜(Zeiss, Oberkochen，德国)观察根系，并在与分化区相邻的1mm区域内的单个毛细胞文件中统计100个独立根的根毛数量。在野生型的成熟根组织中，确定了根成毛细胞的长度和形成根毛的成毛细胞的比例，prc1-1，rhd6-1而且prc1-1 / rhd6-1．幼苗在3个独立的生物重复中生长，并从10个独立的根中每个根中测量20个细胞，每种基因型总共有600个细胞。在树脂包埋根的径向切面上测定了表皮细胞膨出的发生和位置。对细胞进行了鼓包或不鼓包的评分，以及它们是否处于成毛细胞或成房细胞位置(每个基因型n = 30个独立根)。

pEXP7: GFP在根组织中的表达使用带GFP滤镜的徕卡MZIII荧光显微镜进行可视化，图像使用徕卡DC100相机捕获。根组织如前所述准备和切片[36］．组织切片用钌红染色(0.05%)，用Axioplan 2显微镜观察，用Axiocam相机拍摄图像。

测量根毛位置

将幼苗装入水合氯醛:甘油:H的溶液中2O 8:3:1和由所述生毛细胞长度除以所述生毛细胞基底细胞壁到根毛基底壁的距离所确定的相对根毛位置。使用Axioplan 2显微镜观察根，使用Axiovision 3.1软件进行图像捕获和测量。对于每种基因型，从3个独立的实验中测量了至少150个细胞，每个实验使用10个根和每个根5个成毛细胞。如前所述，采用Fisher精确检验和Mann-Whitney检验分析数据的显著性[7，24］．

Rop GTPase的免疫定位

根尖的固定和制备用于Rop GTPase免疫定位是基于Grebe和同事的方案[37]与Fischer和同事引入的修正[24］．使用5%驴血清进行阻断(Jackson免疫研究，West Grove, PA)。以1:50稀释的比例使用兔抗rop抗体，以1:50稀释驴抗兔fitc偶联抗体(Jackson免疫研究公司，West Grove, PA)。将样品装入Citifluor AF1 (Citifluor, London UK)前，用DAPI (1 μg/ml)染色。按所述进行CLSM [24]采用徕卡TCS SP2 AOBS扫描系统，安装在倒置的徕卡DM IRE2显微镜上，并使用徕卡TCS软件。使用405 nm二极管激光器(DAPI)和488 nm氩激光(FITC)进行激发。DAPI的发射波长在410 - 500 nm之间，FITC的发射波长在500 - 550 nm之间。使用Adobe Photoshop 7.0覆盖顺序扫描的图片，并在Adobe Illustrator 9.0中组装。

可用性和需求

Fisher精确检验:http://home.clara.net/sisa/fiveby2.htm

Mann-Whitney秩和检验:http://elegans.swmed.edu/~leon/stats/utest.cgi

缩写

XET:

Xyloglucan endotransglycosidase

经验值:

棒曲霉素

AVG:

aminoethoxyvinyl甘氨酸

ACC:

1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸

女士:

Murashige和Skoog

AGP:

阿拉伯半乳聚糖蛋白质。

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    文章谷歌学者

下载参考

确认

pPRC1种子由Monika Doblin(墨尔本大学)和Gregory Mouille(凡尔赛INRA)提供。的prc1-1等位基因是从Gregory Mouille那里获得的pEXP7：：uidAline由Hyung-Taeg Cho(韩国大田忠南国立大学)提供，Klaus Palme(德国弗赖堡大学)提供MG的Rop抗体。这项研究得到了瑞典科学研究基金会(SSF)、瑞典研究理事会(Vetenskapsrådet)和Formas的资助。

作者信息

从属关系

  1. 瑞典林业大学森林遗传与植物生理学系，Umeå， 901 83，瑞典

    Sunil K Singh, Urs Fischer, Markus Grebe和Alan Marchant

  2. 弗赖堡大学生物II研究所，Schänzlestrasse 1，弗赖堡，79104，德国

    Manoj辛格

  3. 南安普顿大学生物科学学院，伯德伍德校区，南安普顿，7PX, SO16，英国

    艾伦-马尔尚

  4. 植物生理学，Umeå大学，90187，瑞典

    Sunil K Singh

  5. 乔治-奥古斯特大学，Göttingen，德国

    一致的费舍尔

作者
  1. Sunil K Singh
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  2. 一致的费舍尔
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  3. Manoj辛格
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  4. 马库斯水鸟
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  5. 艾伦-马尔尚
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对应到艾伦-马尔尚．

额外的信息

作者的贡献

SKS进行了突变分析和报告研究，UF进行了Rop定位实验，MS生成并表征了Rop抗体。MG参与了实验设计和结果分析。AM构思了这项研究，并参与了其设计和协调，并撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿

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关于本文

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辛格，s.k.，费希尔，U，辛格，M。et al。深入了解发根形成的早期步骤procuste1的纤维素合成酶突变体拟南芥．BMC植物生物学8，57(2008)。https://doi.org/10.1186/1471-2229-8-57

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关键字

  • 表皮细胞
  • 根头发
  • 棒曲霉素
  • 根毛形成
  • 细胞壁松动

BMC植物生物学

ISSN: 1471 - 2229

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