果胶均半乳糖醛酸掩盖了植物细胞壁中丰富的木葡聚糖表位

背景

分子探针用于检测细胞壁聚合物现场为了帮助理解它们的细胞生物学，一些研究表明细胞壁表位在植物器官的各个部分都有限制的出现，这表明细胞壁结构是高度发育调控的。木葡聚糖是双子叶植物初生细胞壁的主要半纤维素或交联聚糖，尽管其存在或与细胞发育和细胞壁微观结构相关的功能知之甚少。

结果

利用新糖蛋白方法，将罗望子籽木葡聚糖的XXXG七糖与牛血清白蛋白偶联产生免疫原，我们生成了针对木葡聚糖XXXG结构基序的大鼠单克隆抗体(命名为LM15)。通过糖基微阵列对LM15结合的分析和寡糖半抗原抑制结合的研究，证实了LM15的特异性。使用LM15对罗望子和旱金莲种子细胞壁中的木葡聚糖进行分析，其中木葡聚糖作为贮藏多糖存在，表明LM15木葡聚糖表位存在于罗望子种子增厚的细胞壁中，并存在于旱金莲种子增厚的细胞壁中相邻的外层区域。LM15与烟草和豌豆茎节间结合的免疫荧光分析表明，木葡聚糖表位局限于这些器官中的少数细胞类型。从等效切片中酶解果胶均半乳糖醛酸，可在这些器官中大量检测到LM15木葡聚糖表位的不同模式，并与一系列细胞类型的细胞壁微观结构有关。

结论

这些观察结果支持了木葡聚糖与植物细胞壁中的果胶有关的观点。他们还表明，与细胞发育和细胞分化相关的已记录的细胞壁表位模式可能需要重新考虑与其他细胞壁成分对细胞壁表位的潜在掩盖有关的问题。

细胞壁是植物细胞的主要组成部分，对细胞的发育、生长方式和植物器官的力学性能有重要影响。植物细胞壁也具有相当大的经济意义，因为它们是陆地生物量和用于纤维、燃料和食物的植物来源材料的主要组成部分。初生细胞壁和次生细胞壁由结构复杂多样的多糖组成[1- - - - - -3.］．主要的多糖类是纤维素、半纤维素(或交联聚糖)和果胶多糖，后两类含有多种聚合物结构。为了了解多糖的特定结构及其相互作用和关联如何构成不同的细胞壁结构和功能，需要采用方法来评估聚合物现场在整个器官和细胞壁内。标记蛋白具有特异性结合多糖结构基序的能力，是目前实现这一目标的最佳方法之一。这些蛋白主要是单克隆抗体和碳水化合物结合模块。针对三种主要多糖类聚合物的一些结构特征的细胞壁探针表明，细胞壁多糖结构的发生可以与发育环境高度相关[4- - - - - -10］．然而，探针还不能用于已知发生在细胞壁组分内的所有结构基元，因此现场所有聚合物结构的位置还不能确定。

木葡聚糖是非禾本科植物初生细胞壁中最丰富的半纤维素之一，被认为具有氢键作用和将纤维素微原纤维系在一起的功能。这种承重的半纤维素网络维持了原代细胞壁的强度，这是支撑植物扩张生长的关键因素[1- - - - - -3.，11，12］．半纤维素的木葡聚糖组高度多样化，在结构上显示出显著的分类变异[1，12- - - - - -15］．木葡聚糖的主链是(1→4)-β- d -葡聚糖，一些葡萄糖残基被短侧链取代。已为木葡聚糖衍生的低聚糖开发了一种基于结构的命名法，以指示与主干糖基序列的连接[16］．例如，不分枝的葡聚糖残基称为G，含有单个木糖的葡聚糖残基称为X，含有β-Gal-(1,2)-α- xyl双糖的葡聚糖残基称为l。根据携带侧链的主干残基的数量，木葡聚糖被分为XXXG型或XXGG型，XXXG型有三个连着木糖的连续葡聚糖残基和第四个不分枝残基[17］．迄今为止，由于只有少数探针可用，将这种结构复杂性置于细胞生物学环境中还不容易。木葡聚糖抗血清[18]和一种单克隆抗体(CCRCM1)，与木葡聚糖携带的集中表位结合[19]已经被开发出来。这些已经被用来检测木葡聚糖现场［4，7，20.- - - - - -22］．

在这里，我们描述了从罗望子籽木葡聚糖中获得的具有3个木糖基和4个葡萄糖基残基的七糖(木葡聚糖命名为XXXG)与蛋白质载体的偶联，以作为免疫原。免疫接种后，我们发现了一种大鼠单克隆抗体，命名为LM15，它与木葡聚糖的XXXG基序结合，我们已经使用该抗体证明了木葡聚糖结构的调节和细胞壁内的发生以及与一系列物种的植物解剖有关。

多糖在植物细胞壁中不是孤立存在的，了解不同种类聚合物之间的联系和联系是增加我们对植物细胞壁生物学认识的重要目标。越来越多的生化证据表明木葡聚糖可以附着在植物细胞壁的果胶聚合物上[23- - - - - -27］．通过酶降解去除植物横切面细胞壁上的果胶均半乳糖醛酸(HG)，并结合LM15抗木葡聚糖单克隆抗体，我们证明了细胞壁内存在发育调控的木葡聚糖表位集，这些表位被HG的存在所掩盖。这一观察结果对我们理解木葡聚糖在细胞壁中发生的精确发育模式和细胞发育模式具有重要意义细胞壁生物学。

xxxg定向木葡聚糖单克隆抗体的筛选

为了了解植物细胞发育背景下的木葡聚糖结构，需要一套涵盖木葡聚糖结构各个方面的探针。由于XXXG寡糖是木葡聚糖的主要基序，因此产生了针对该基序的特异性单克隆抗体探针。罗望子木葡聚糖中的XXXG七糖经还原胺化反应偶联至牛血清白蛋白。用该新糖蛋白免疫原免疫后，以罗望子木葡聚糖为抗原，用elisa法筛选融合产物。选择了几种有效结合罗望子木葡聚糖的细胞系，并选择了一种分泌大鼠IgG2c单克隆抗体和指定LM15的细胞系进行完全表征。在ELISA中，LM15与罗望子籽木葡聚糖和XXXG-BSA新糖蛋白结合如图所示。1．为了确定LM15识别木葡聚糖的特异性，并评估其与其他细胞壁聚合物的可能结合，LM15被用于探测组装了大量植物细胞壁多糖的聚糖微阵列[28］．具有代表性的结果如图所示。2并且表明除了罗望子木葡聚糖(非聚焦)和豌豆木葡聚糖(包含聚焦侧链)样本外，很少能识别细胞壁聚合物。与果胶聚合物样品和黄胶和卡拉亚胶的低水平结合可能是由于这些提取的样品中木葡聚糖含量低。模型植物器官提取物样本拟南芥也包括在微阵列中[28]并且对碱溶性材料的识别比阳离子螯合剂溶性材料的识别更强——木葡聚糖的这种模式是预期的[28］．

在ELISA和聚糖微阵列中，LM15与罗望子木葡聚糖的结合表明它与这类细胞壁聚合物特异性结合。为了证实这一点并确定结合所需的结构特征，使用竞争性抑制(半抗原)elisa测定了一系列木葡聚糖衍生和相关低聚糖存在对LM15与罗望子籽木葡聚糖结合的抑制作用。在罗望子籽木葡聚糖包被酶联免疫吸附试验板中，以100倍稀释的浓度使用LM15杂交瘤上清液时，最有效的半抗原抑制剂是XXXG寡糖，如图所示的代表性竞争性抑制酶联免疫吸附试验。3.．抑制50% LM15结合所需的XXXG低聚糖浓度为1.9 μg/ml。XXLG和XLXG异构体(不易分离)的混合物为4.3 μg/ml, XLLG为348 μg/ml, GGGG纤维四糖为560 μg/ml，均能达到相当的抑制作用。这些数据表明，两个半乳糖残基的存在在很大程度上阻止了LM15对低聚木葡聚糖的识别，尽管一个半乳糖残基更容易被耐受。异戊糖(α-Xyl(1→6)Glc)和木糖二糖(β-Xyl(1→4)Xyl)在浓度为1 mg/ml时对LM15与木葡聚糖的结合无影响。总之，我们已经生成了木葡聚糖XXXG结构基序的单克隆抗体。该探针用于探索木葡聚糖的结构和发生与植物细胞类型和细胞壁微观结构的关系。

罗望子和旱金莲种子子叶薄壁细胞壁中的木葡聚糖

木葡聚糖是罗望子和旱金莲种子子叶薄壁细胞壁的主要结构成分[29- - - - - -31］．为了探索xxxg定向单克隆抗体LM15与植物细胞壁的结合，从这两个物种的成熟种子中切除的子叶薄壁组织固定并包埋在树脂中，切片后进行间接免疫荧光分析。小鼠单克隆抗体CCRCM1 [19结合到木葡聚糖的集中表位(不存在于罗望子籽木葡聚糖中，但存在于旱金莲籽木葡聚糖中)用于与LM15进行比较。

对罗望子种子子叶薄壁的LM15结合和Calcofluor White染色的比较表明，LM15结合在整个细胞壁上，包括子叶薄壁的广泛细胞壁增厚。4)．相比之下，CCRCM1不与这些细胞壁结合，尽管它与维管组织的非增厚细胞壁结合(未显示)。罗望子属豆科豆科豆科植物。木葡聚糖也是一种丰富的储存聚合物旱金莲属植物种子属植物科在芸苔目。LM15和CCRCM1结合旱金莲种子子叶薄壁细胞壁如图所示。4并显示出对种子薄壁细胞壁的不同区域的识别。LM15与细胞壁增厚区域结合，与靠近中片层的外层区域结合最强(图2)。4 c, d)．相比之下，CCRCM1表位的含量较低，出现的情况也不稳定，当它出现时，只出现在面向质膜的细胞壁薄区域(图2)。4 e, f)．

用果胶裂解酶去除果胶均半乳糖醛酸，增加了LM15与烟草和豌豆茎细胞壁的结合

木葡聚糖的结构在分类上具有多样性，如豌豆和拟南芥属蔷薇科，具有XXXG型木葡聚糖[1，3.］．通过豌豆茎节间横切面的亮场和Calcofluor White染色图像显示，部分维管束环(茎角较大的维管束)分别在远端和近端由硬化的薄壁组织或纤维细胞带以及皮层和髓薄壁连接在束间区(图2)。5 a、b)．间接免疫荧光分析LM15结合到豌豆茎的等效部分，表明该抗体结合到维管束原生木质部内部区域的有限一组细胞壁(图2)。5度)．在维管束韧皮部和髓实质也有较弱的与细胞的结合。从等效切片的免疫标记过程中省略LM15导致未观察到荧光(未显示)。LM15对细胞壁的这种出乎意料的低识别水平通过用重组果胶裂解酶预处理从切片中去除果胶HG进一步探索。这种预处理导致整个切片中LM15表位的检测大幅增加，并呈现出不同的细胞壁模式，如图所示。5 d即切片预处理暴露了一组LM15表位。果胶裂解酶预处理后，LM15表位在表皮细胞壁、皮层和髓实质的细胞壁、维管束韧皮部区域的细胞和木质部束的内部区域大量检测到。在髓实质细胞中，与束间区细胞壁增厚的细胞直接相邻的细胞中，LM15表位的出现在与纤维细胞的交界处突然停止。5 d)，表明切片细胞的四层壁中只有三层被抗体标记。总之，除次生细胞壁细胞(维管束的厚壁纤维和束间纤维)外，大多数细胞中都检测到LM15表位。酶处理前后CCRCM1表位观察到类似的发生模式(未显示)。酶处理后的这种发生模式与果胶HG在等效截面上的发生模式相似，这可以通过抗HG单克隆抗体JIM5的结合来显示[32]到图中未用酶处理过的部分4 e．本研究中所有未用果胶裂解酶处理的对照部分均在酶最大作用所需的高pH缓冲液中孵育。高pH值导致果胶汞的去酯化，因此，在这种情况下，JIM5表明在细胞壁中存在汞，与原来的甲基酯化状态无关。图中显示了因果胶裂解酶处理而导致的JIM5 HG表位的缺失。5 f．

在组织水平上，由果胶裂解酶作用揭示的LM15表位和未处理切片上的JIM5表位具有类似的情况。为了记录LM15的出现，图中显示了更详细的果胶裂解酶揭开的LM15和JIM5表位的高倍放大维管束显微图。6．在未经处理的切片中，LM15表位在原木质部细胞的细胞壁中最丰富，在后木质部细胞壁的离散区域和韧皮部区域的某些细胞中也可以通过calcoflor White标记识别，在某些情况下细胞壁增厚，而在其他情况下则没有(图)。6 b)．此外，在细胞中检测到表位，具有薄壁细胞的特征，与最小的原生木质部细胞相邻。果胶裂解酶处理后，韧皮部、皮层和髓实质的所有细胞壁均保持强标记。JIM5表位的模式相似，它也存在于偏木质部细胞壁的离散结构域，但在木质部和韧皮部之间的形成层中含量丰富，表现出微妙的区别。在韧皮部区域，JIM5表位没有出现在整个细胞壁，而是出现在细胞间区，与LM15表位相比，JIM5表位在皮层薄壁的细胞角也相对更丰富。

属菊科茄属植物的茄科植物不含XXXG木葡聚糖，但具有不同的XXGG和XSGG型木葡聚糖低聚糖，其中S表示木葡聚糖残基上附着有阿拉伯糖残基[1，13，33］．如图所示，LM15与烟草茎部细胞壁结合较弱。7这主要发生在毛角组织、形成层中的周期性细胞和靠近木质部带的髓薄壁组织(图2)。7 b)．用果胶裂解酶预处理等效部分以去除果胶HG可增加LM15的结合。HG去除后，LM15表位在表皮、皮质厚壁组织、薄壁组织以及形成层和髓薄壁组织的细胞壁中均被检测到。7 c)．单克隆抗体CCRCM1在果胶裂解酶处理前后均未与烟草茎结合(图中未显示)。在用果胶裂解酶处理切片前后，用抗HG JIM5标记切片，表明HG表位被有效地从切片中去除(图2)。7 d, e)，也表明JIM5 HG表位比LM15表位更广泛地出现在整个器官的所有细胞类型的所有细胞壁中。为了探索果胶裂解酶预处理对该系统中其他细胞壁表位检测能力的影响，我们用针对(1→5)-α-L-arabinan的单克隆抗体LM6检测了未处理和处理的相当部分，(1→5)-α-L-arabinan是一种结构基序，通常与果胶的鼠李糖半乳糖醛酸- i多糖有关[34］．该抗体在果胶裂解酶处理前后与表皮细胞、皮层和髓实质结合的模式相似，但果胶裂解酶处理后荧光信号更强(图2)。7 f, g)．

如图所示，LM15和JIM5表位在胶原细胞合并为薄壁细胞的皮层区域进行了更详细的比较分析。8．果胶裂解酶预处理显示的LM15木葡聚糖表位，在大角组织壁增厚过程中均有出现，但在靠近中片层的细胞壁区域最为丰富，这种出现模式在皮层薄壁组织中保持不变(图2)。8)．相比之下，JIM5 HG表位在增厚的厚角组织细胞壁上分布均匀，在某些情况下，在靠近质膜的细胞壁上分布更丰富。该表位在薄壁细胞中排列在细胞间隙的细胞壁中尤其丰富。在髓实质(图。9)，用酶去除果胶HG后，在整个细胞壁中发现了LM15表位，但在细胞间隙的粘连和未粘连细胞壁之间的连接处，总是观察到特别丰富的LM15表位(图2)。9)．相比之下，JIM5 HG表位在整个细胞间隙排列的细胞壁中最为丰富。9 f)．在本研究使用的切片制备中，某些细胞不仅在纵壁切片上观察到，而且还观察到横壁内表面完好无损(见图中星号)。9．这种细胞壁的免疫细胞化学分析可以为细胞壁微观结构提供额外的见解[35］．用Calcofluor White荧光对细胞壁内表面的这些区域进行高倍放大(图9c-e)，显示荧光减弱的区域，可能是坑场。与calcofluwhite荧光较强的区域相比，这些区域显示出更多的LM15荧光9汉英)．JIM5在Calcofluor White显示强荧光和弱荧光的区域显示了类似的差异标记，尽管这是不太明显的(图2)。9胃肠道)．

我们表明，用新糖蛋白免疫已经成功地生成了大鼠单克隆抗体LM15，该抗体指向木葡聚糖的XXXG基序，可以有效地结合罗望子木葡聚糖(一种没有聚焦化的聚合物)，也可以与一系列物种的细胞壁结合。LM15可以与豌豆细胞壁结合(使用XXXG木葡聚糖)，也可以与烟草干细胞壁结合(使用XXGG木葡聚糖)，这表明LM15抗体可能不需要整个七糖XXXG来获得最佳识别——半抗原寡糖抑制研究也表明了LM15与木葡聚糖结合的一个方面，在这些研究中，XXLG和XLXG寡糖的混合物被观察到可以有效地抑制结合。

单克隆抗体等多糖定向探针是了解细胞壁中多糖多样性和存在的重要工具，这是了解细胞壁功能的分子基础的重要方面。木葡聚糖抗血清[18]和单克隆抗体CCRCM1 [19]已被用于证明木葡聚糖在一系列系统中发生的发育调节模式[7，21，22］．在旱金莲种子切片中，单克隆抗体LM15和CCRCM1与子叶薄壁细胞壁的不同区域结合，表明这些细胞壁内木糖葡聚糖结构的空间调控。在这些抗体结合的区域之间的旱金莲细胞壁区域(Calcofluor White荧光显示)没有被任何探针强烈结合(果胶裂解酶预处理对表位的发生没有影响)。要了解这些区域的木葡聚糖是在数量上减少还是在结构上不同，就需要开发针对木葡聚糖其他结构特征的探针。

LM15与未经处理的豌豆和烟草茎节间横切面的结合表明只能识别几种细胞类型，而且通常很弱。果胶汞的酶解显著增加了结合。在细胞壁免疫化学研究中，通常假设穿过一个器官/细胞，从而从质膜穿过细胞壁层到中间层的部分将暴露细胞壁中存在的所有聚合物。从许多记录在案的细胞壁表位的出现来看，这意味着一个表位的有限出现反映了一个特定表位的存在或不存在，在某些情况下，分离聚合物的理化分析支持了这一点。这是第一个明确的表位掩蔽病例的报告，在该病例中，一个切片中存在的表位的大多数副本被另一种细胞壁聚合物(在本例中为果胶HG)所掩盖。值得注意的是，在豌豆和烟草茎节间，除了果胶HG去除所揭示的外，还检测到一些木葡聚糖表位，而没有酶去除果胶HG。这表明可能有两种不同的LM15表位与细胞壁中的果胶有关。这些观察结果对我们理解细胞壁聚合物的结构具有重要意义，在考虑细胞壁结构的发育调控时，应考虑到这一点，抗体探针证明了这一点。

通过果胶HG去除发现木葡聚糖表位的基础可能是细胞壁孔隙度的普遍增加，从而增加了对表位的访问，或者果胶和木葡聚糖之间存在密切的特定结构联系在muro这阻断了木葡聚糖结构。烟草茎中LM6阿拉伯语表位的比较评估表明，果胶酸分解酶处理后其检测量增加，但没有LM15木葡聚糖表位观察到的程度。此外，LM6表位的出现模式并无差异。这表明果胶裂解酶预处理可以增加细胞壁孔隙度，从而在一定程度上增加所有抗体的可及性。然而，对LM15木葡聚糖表位检测范围和模式的明显影响表明，在该系统中木葡聚糖和果胶之间存在更密切的联系。

果胶和木葡聚糖都是植物细胞壁的重要定量聚合物，约占双子叶植物原代细胞壁多糖的三分之一[1］．在细胞壁结构方面，已知木葡聚糖通过氢键附着在纤维素微原纤维上，并被提出用于系住相邻的微原纤维，为抵抗细胞增大提供力学基础。几种聚合物的复杂果胶网络(主要是HG)嵌入纤维素-木葡聚糖网络，并施加细胞壁特性，包括细胞壁孔隙度[2，36，37］．细胞壁结构的早期模型提出了木葡聚糖和果胶中性侧链之间的糖苷链接[38］．最近的证据证实了木葡聚糖和酸性果胶聚合物之间的联系，但具体是通过果胶分子的鼠李糖半乳糖醛酸- i结构域[23- - - - - -27］．这些研究表明，这种联系是普遍存在的，在培养的拟南芥细胞中，已有证据表明，高达50%的木葡聚糖是在细胞壁沉积之前在果胶引物上合成的，并且聚合物间键在细胞壁中是稳定的[26，27］．果胶聚合物和木葡聚糖之间糖苷链接的意义以及这里报道的观察结果尚不清楚。

在豌豆和烟草茎节间细胞壁中，果胶HG和LM15木葡聚糖表位不能精确地共定位。值得关注的是，所发现的LM15木葡聚糖表位以不同的复杂模式出现，与薄壁细胞、甲基部细胞和厚壁细胞等一系列细胞类型的细胞壁特征和微结构有关。在许多情况下，LM15表位在细胞壁中分布不均匀。在烟草茎髓实质横壁的内表面，LM15表位没有与Calcofluor White荧光共定位(可能是纤维素的指示)。其他方法表明，纤维素微原纤维可能没有被木葡聚糖均匀包裹，木葡聚糖可以出现在不同的细胞壁结构域，在某些细胞壁中可能很少[39，40］．也有研究表明，木葡聚糖在豌豆细胞生长过程中结构发生了变化。41在细胞发育过程中，结构变化可能是在细胞壁内进行空间调控的。在细胞间隙的角落检测到丰富的LM15木葡聚糖表位，在烟草髓实质细胞壁的这项研究中表现得最为显著，是在广泛的薄壁组织系统中观察到的LM7果胶HG表位的出现模式[6］．这可能表明，对于该组织，木葡聚糖在细胞间隙形成或稳定中的作用，可能是通过与果胶的联系。

研制了一种新的木葡聚糖结合大鼠单克隆抗体LM15，用于木葡聚糖分析在足底．在某些器官中，大量木葡聚糖表位被果胶HG的存在所掩盖，这一证明对理解木葡聚糖在原代细胞壁和细胞壁生物学中的功能具有重要意义。酶降解与细胞壁探针的结合使用可能是研究果胶聚合物与木葡聚糖之间链接发育调控的重要分析工具。进一步的工作将需要解剖的程度，细胞壁表位掩蔽发生在其他组细胞壁多糖之间。

新糖蛋白免疫原的制备、免疫方案及木葡聚糖定向单克隆抗体的分离

将含有3个木糖基和4个糖基残基的七糖(XXXG, Megazyme, Bray，爱尔兰)通过还原胺化与牛血清白蛋白偶联制备新糖蛋白(XXXG-BSA) [42］．XXXG (30 mg)溶解于1.0 ml 0.2 M硼酸钠缓冲液pH 9.0中。接着加入20毫克牛血清白蛋白，然后加入30毫克氰化硼氢化钠。混合物保持在50°C的水浴中，偶尔混合。24 h后，加入45 μl 80% (v/v)乙酸，将pH调整为pH 4.0。然后在4天内用蒸馏水对溶液进行多次透析。

大鼠免疫、杂交瘤制备和克隆程序如前所述[34］．雄性Wistar大鼠2只，第0天皮下注射100 μg XXXG-BSA，第33天和第71天皮下注射相同剂量的不完全弗氏佐剂。第145天，选择大鼠腹腔注射100 μg XXXG-BSA，加入1ml PBS。3天后分离脾脏，分离淋巴细胞并与大鼠骨髓瘤细胞株IR983F融合[43］．以罗望子木葡聚糖为抗原，ELISA法筛选抗体。随后通过细胞壁聚合物的聚糖微阵列进行了表征[28]和竞争抑制elisa使用罗望子木葡聚糖XXXG七糖和一系列相关的低聚木葡聚糖。XXLG和XLXG八糖异构体的混合物和XLLG非糖源自罗望子木葡聚糖，如所述[44采用Tosoh TSK凝胶酰胺柱(21.5 × 300 mm)高效液相色谱纯化，65%乙腈洗脱。以纤维素为原料，经乙酰解制备纤维素四糖GGGG [45]，并按上述方法从脱乙酰低聚糖混合物中分离出来。豌豆木葡聚糖样品是Marie-Christine Ralet (INRA, Nantes, France)的礼物。elisa方法如前所述[6]并且在所有情况下，固定抗原以50 μg/ml的浓度被包裹。甘露聚糖，罗望子木糖葡聚糖聚合物，异戊糖和木糖双糖从Megazyme, Bray，爱尔兰获得。所选抗体为IgG2c，命名为LM15。

植物材料和免疫细胞化学程序

罗望子(Tamarindus籼L.)种子取自英国沃特灵顿丛林种子公司(Jungle seeds)和旱金莲(金莲花属植物majusL. cv Tom Thumb)来自英国纽马克特Fothergill先生种子有限公司的种子。罗望子和旱金莲种子吸收24小时，然后切除子叶薄壁，固定并准备包埋在LR白树脂中，随后切片，如前所述，用于间接免疫荧光分析[8］．烟草(烟草L.)和豌豆(Pisum一l)植物在温室中生长16 h，保持在19 ~ 23°C。6周龄植株顶部的第二节间区域固定，用蜡包埋，按前面所述进行切片[46］．

除了LM15之外，本研究还使用了间接免疫荧光的三种单克隆抗体:CCRCM1，一种针对木葡聚糖集中表位的小鼠单克隆抗体[19]，由Michael Hahn博士(CCRC, University of Georgia, USA)赠送，JIM5，一种针对HG甲基酯化和非酯化表位的大鼠单克隆抗体[32]和一种大鼠阿拉伯楠单克隆抗体LM6 [34］．从细胞壁去除汞的切片预处理包括用重组微生物果胶裂解酶10A培养切片[47)(来自纽卡斯尔大学教授Harry Gilbert的礼物)，10 μg/mL，室温50 mM, 2小时N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)， 2 mM氯化钙₂所述pH值为10的缓冲液[10］．酶缓冲液的高pH除去细胞壁中的HG甲基酯，导致HG易被果胶酸裂解酶降解，也适合被JIM5识别。未用果胶酸裂解酶处理的切片在无酶的高pH缓冲液中孵育等效时间，并作为未处理对照成像。酶处理或缓冲处理后，切片在含5% (w/v)牛奶蛋白(MP/PBS)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中孵育1.5小时。然后，样品在PBS中洗涤至少3次，并在MP/PBS中与100倍稀释的抗大鼠IgG(全分子)或抗小鼠IgG(与异硫氰酸荧光素(FITC, Sigma, UK)连接)孵育1.5小时。样品在PBS中洗涤至少3次，并用Calcofluor White (0.2 μg/mL) (Fluorescent Brightner 28, Sigma, UK)在黑暗中孵育5分钟。样品至少清洗3次，然后安装在基于甘油的抗褪色溶液中(Citifluor AF1，琼脂科学，英国)。免疫荧光观察显微镜配备epifluorescence辐照和DIC光学(Olympus BX-61)。使用Hamamatsu ORCA285相机和Improvision Volocity软件拍摄图像。

我们感谢来自英国生物技术和生物科学研究理事会和欧盟FP6 Wallnet研究培训网络(MRTN-CT-2004-512265)的财政支持。部分资助来自斯洛伐克科学赠款机构(VEGA)。

从属关系

1. 利兹大学生物科学学院植物科学中心，利兹，LS2, 9JT，英国

   Susan E Marcus, Yves Verhertbruggen, Cécile Hervé， José J ordaza - ortiz & J Paul Knox

2. 斯洛伐克科学院，化学研究所，糖苷卓越中心，杜布拉夫斯卡，布拉迪斯拉发，SK-84538，斯洛伐克

   弗拉基米尔•法卡斯

3. 哥本哈根大学生物系，哥本哈根生物中心，Ole Maaløes Vej 5，哥本哈根，DK-2200，丹麦

   亨利埃特·L·佩德森和威廉·GT·维拉茨

相应的作者

对应到保罗·诺克斯．

作者的贡献

扫描电镜进行免疫原制备、细胞培养分离克隆LM15及其免疫化学表征。SEM, YV, CH, JJO-O和JPK参与了植物材料的制备，抗体与切片结合的表征和显微照片的获取。VF进行了寡糖的分离。HLP和WGTW进行了微阵列分析。JPK构思了这项研究并起草了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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