自由生长的白杨叶片的整体表达谱gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

基因组研究通常是在与自然条件非常不同的受控环境中对幼苗进行的。事实上，温带国家的植物暴露在环境条件的巨大波动中，对于多年生植物来说，这种波动会持续好几年。我们研究了一种自由生长的白杨(gydF4y2Ba杨树tremulagydF4y2Ba)贯穿多个生长季节gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

我们发现，叶片发育第一个月的基因表达在很大程度上是由一个发育程序决定的，尽管叶片的扩张、叶绿素积累和通过该程序的进展速度受到温度的调节。我们还能够为叶片发育的四个不同亚阶段定义“转录签名”。在成熟叶片中，天气因素对基因调控起重要作用。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究表明，多变量方法与现场高通量转录方法一起可以提供在不断变化的环境条件下植物状态的额外的、新颖的信息，这是在实验室条件下无法模拟的。我们已经生成了一个数据集，可用于识别某些发育阶段或治疗的标记基因，以及评估基因表达的自然变异。gydF4y2Ba

植物叶片是一个奇妙的器官，它为植物，最终为人类提供生长和维持所必需的碳水化合物。在许多物种中，叶片的形态具有显著的可塑性，在不同条件下发育的叶片的形状和大小在同一物种的植物中甚至在单个植物中都可能有很大的差异[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．叶片的分化由遗传程序控制，但为了使叶片形状具有可塑性，发育程序受到环境因素的修改[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．在细胞扩张阶段之后，发生二次细胞壁形成，细胞随后无法改变其形状。然而，发育程序继续在适应反应中修改叶片中的基因表达，优化其执行其主要功能——光合作用的能力。gydF4y2Ba

在大多数植物中，叶子是由顶端分生组织形成的，贯穿于它们的营养发育过程中，并且经常会出现不同发育阶段的叶子。大多数树木的生长模式也不确定，在整个生长季节都有叶片形成，而叶片塑时指数(lpi)有时可用于描述沿茎的不同叶片发育阶段[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba］．然而，有些树具有确定的生长，因此下一个生长季节的所有叶子都已形成，但在冬季芽将以同步的方式在来年春天生长。树木冬芽的叶片发育是一种不同寻常的发育途径。在花蕾中，叶子的发育在早期阶段就被抑制，节间伸长也被抑制，如果树木有一个确定的生长模式，大部分或所有将在未来季节发育的叶子都会在花蕾中越冬。当芽在春天重新被激活时，大多数叶子的扩张被认为是细胞扩张的结果，但细胞分裂也会发生，并且重叠的细胞分裂和扩张决定了叶子的最终大小和形状[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．年轻的白杨树通常有一个不确定的生长模式，并产生新叶，直到达到临界日长的时候，生长停滞和萌芽发生。然而，在瑞典(生长季节很短)，成熟的白杨和许多其他树种只有一次同花顺，所以在给定的日期，所有的叶子都是相同的年龄。gydF4y2Ba

影响叶片发育和基因表达的环境和发育因素之间的相互作用可以通过几种方式来解决，例如通过分析具有影响叶片发育的突变的植物[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]或将植物置于高度受控的条件下，在特定变量发生变化后测量基因表达或发育参数的变化[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．第三种较少使用的策略是在自然、不受控制的条件下监测叶片发育和基因表达[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这种方法面临着相当大的挑战。例如，天气参数或生物相互作用的随机变化可能会掩盖调节叶片基因表达和发育的主要内在过程，当测量响应时，测量参数选择中的偏差可能会影响结果。为了尝试生成有关复杂现象和高度相互作用因素的可解释数据，我们结合了几种科学方法，包括高通量基因组分析来测量基因表达(或至少是mRNA水平)，以及在自然条件下生长的植物的形态、生理和生态评估。我们已经证明，对生长在不受控制的、高度可变的条件下的白杨树叶片的基因表达数据进行多元统计处理，可以分析以分离影响基因表达的发育因素(更确切地说是叶龄依赖因素)和环境因素[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．这促使我们着手开展一个项目，分析在自然条件下以最有效的方式生长的树木叶片中的基因调控的全球模式，以补充模型一年生植物叶片中基因表达的数据gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们相信，可以使用严格的样本选择方案，以实验设计和多元统计为指导，以最大化结果中的信息含量为目标，而不是每天对样本进行DNA微阵列测试。考虑到我们实验树的生长已经确定，并且基于我们之前的研究，白杨叶片的寿命可以分为三个阶段。在季节早期(在Um eå从5月下旬到6月下旬)，叶子从芽发育，达到成熟，并在季节结束时衰老。在这两者之间，有一个时间窗口，叶子既不生长也不衰老。根据11个基因的表达数据，我们发现，在季节的早期和晚期，基因表达的变化较大，而在季节的中期，基因表达更稳定[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．当叶子没有生长，但还没有开始衰老时，基因表达在理论上只需要1)如果叶子的蛋白质组成因环境条件的变化而发生变化或2)替换已经降解的蛋白质。因此，这个时间段对于分析环境对基因表达的影响具有最大的信息量。gydF4y2Ba

本研究旨在解答白杨叶片基因调控的几个问题。例如，DNA微阵列能最好地用于获得高质量的表达数据，以忠实地监测在自然、不受控制的条件下生长的树木叶片中的生物合成活动吗?哪些天气因素对决定mRNA水平最重要?如果比较几个季节，同一个体的基因表达有多相似或不同?为此，我们构建了白杨叶片从萌发到衰老整个发育过程中的基因表达时间表，并确定了生长季节不同阶段的环境影响。gydF4y2Ba

整个季节基因表达的发育模式可以用DNA微阵列可视化gydF4y2Ba

我们首先想要获得叶片发育的生理学概述，我们使用叶片大小(扩张)和叶绿素积累来定义叶片发育。这表明叶绿素的积累滞后于膨胀的开始一周，但在叶片停止膨胀后又持续了2周(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．通过计算树木从休眠状态释放后高于某一阈值温度(通常为+1°C至+5°C)的温度和或“日度”，可以准确地模拟树木的萌芽[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．我们想知道温度是否也调节白杨叶片的叶片膨胀和叶绿素积累。目前尚不清楚白杨何时会从内休眠中释放出来，但肯定是在3月底之前很久(Rishikesh Bhalerao, pers。通讯)。如果使用+1°C的阈值温度，将叶长与温度和绘制成几乎完美的线性拟合(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.97)，说明到6月19日，当温度和达到500时(数据未显示)，叶片膨胀的温度依赖性。此外，如果将叶绿素水平与温度总和进行比较，同样发现到6月28日，叶绿素水平几乎完全吻合，对应的温度总和为700。因此，温度似乎是叶片膨胀和叶绿素积累的主要决定因素，从嫩芽爆发到叶片完全发育。gydF4y2Ba

在本项目的第一部分中，我们重点研究了主要受叶龄/发育阶段调控的基因。几年来，我们每天都从实验树上采集树叶样本，因此可以从许多不同的树叶样本中选择用于微阵列分析。在这方面，最能提供信息的是所有天气参数都尽可能相似的样本，而发育阶段的差异则尽可能大。因此，我们希望选择分布在整个生长季节且天气条件相似的采样日。为了在统计上做到这一点，我们将主成分分析(PCA)应用于距离研究树约200米的气象站记录的天气数据(详见材料和方法)。2000年整个生长季节的天气概况已于先前发表[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．来自每天计算的天气参数的PCA表示[参见附加文件]gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]，我们选择了10天，平均分布在生长季节。选定的日子天气晴朗，白天最高气温在10至20°C之间。我们还包括一个额外的样本(7月18日)[见附加文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，在季节中期，天气明显不同(下雨)。gydF4y2Ba

我们分析了11个选定日期的基因表达，使用DNA微阵列，在4个重复中对照一个共同的参考。由于不均匀杂交而导致质量较差的玻片将从进一步分析中移除。然后，我们应用主成分分析来获得数据集的概览，并以无监督的方式总结样本中基因表达的变化(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．整个生长季节的11个样本显示了非常明显的发展趋势，如PCA评分图所示[见附加文件]gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．复制样本紧密聚集在一起的事实说明了我们阵列分析的高再现性。可以通过图表绘制时间线，其中样本按时间顺序出现。这表明了我们用来为实验选择样本的方法的成功，因为由于随机环境因素而导致的基因表达谱中的噪声在很大程度上被消除了，使得发育程序的影响得以清晰地区分。gydF4y2Ba

发育调控基因表达的大部分变化似乎发生在7月1日之前，当时叶子正在扩张，内部结构已经形成。这些观察结果促使我们在这一阶段更详细地分析基因表达，以提高分析的时间分辨率。出于这个原因，我们在实验设置中加入了三个额外的样本，以便在同一时间段内进行分析。此外，我们决定还包括来自同一时期的另外7个样本，但来自另一年(2002年)。选择这一年是因为2002年这段时间的天气异常温暖，而2000年5月和6月异常寒冷，因此可以了解在叶片发育期间温度是如何影响基因表达的。gydF4y2Ba

我们用上面提到的方法分析了所有这些数组。对两个季节基因表达的总体模式的概述证实，基因表达的主要变化发生在蓓蕾破裂后的第一个月。PCA评分图的第一个维度(t1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，描述了大部分(37%)的变异，将5月和6月的样本与其余样本分开，表明基因表达的主要差异发生在2000年7月6日和2002年7月1日之前。第二个维度(t2)描述了15%的变化，主要是按照时间顺序对其余的样本进行排序，并将7月6日和9月12日的样本与其他样本清晰地分开。然而，8月3日至8月29日的样本在第一个或第二个维度上都没有被令人信服地分开。显然，在7 - 8月，基因表达的叶龄依赖变化较小，基因表达没有明显的发展趋势，特别是在8月1日前后(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．随着季节的推移，基因表达发生了较大的变化，9月12日样本的表达谱与之前所有样本的表达谱都有很大的不同。当然，这与秋季衰老过程的早期阶段是一致的，尽管叶绿素的退化在这个日期才刚刚开始，而且可见的叶片衰老直到很久之后才发生[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．7月18日的样本，当时天气不同，并没有成为一个明显的异常值。gydF4y2Ba

温度决定了叶片发育过程的进展速度gydF4y2Ba

由于2000年6月和2002年6月的天气是如此不同，因此两个季节的样本不仅增加了这些生长阶段分析的分辨率，而且还提供了有关发育和环境因素之间关系的额外信息。然而，所有样本的转录组大体上可以与一条曲线相连，这意味着尽管叶子在2000年和2002年暴露在不同的天气条件下，但它们基本上经历了相同的“线性”发育过程，即基因表达模式以预定的方式变化，仅在很小程度上受天气条件的影响。然而，在这两年里，树叶显然以不同的速度通过了这个项目。在2000年，该程序开始晚(即萌芽晚)，叶片沿发育轴的进展比2002年慢得多;2002年5月27日对应于2000年6月3日或4日，而2002年6月3日的基因表达谱与2000年6月16日的基因表达谱相似(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，我们想知道转录组的状态，不仅是叶片膨胀和叶绿素积累，是否也由温度和决定。我们计算了2000年和2002年1月1日以来的温度和。日度数的累计总和，如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的研究结果表明，“转录组状态”的天数与温度和几乎完全相关，这与以下假设一致:不仅是芽突发、叶片扩张和叶绿素积累，而且从芽突发到叶片成熟的整个叶片发育过程都依赖于温度和。gydF4y2Ba

基于这些发现，我们将“叶片发育期”细分为子阶段，例如阵列实验所涵盖的两年时间(阶段I)。将2000年5月25日、6月1日和2002年5月27日的样品划分为Ia相(温度和为250 ~ 400)，将2000年6月9日和2002年5月30日的样品划分为Ib相(温度和为400 ~ 450)，将2000年6月15日和2002年6月3日的样品划分为Ic相(温度和为450 ~ 500)，将2000年6月22日、2002年6月10日、6月29日和2002年6月17日的样品划分为Id相(温度和为500 ~ 750)。由于2000年6月29日以后叶子进入了第二阶段(“成熟叶子”)，2002年6月24日和2002年7月1日的样本被分配到第二阶段。从Ia期到Ib期的转变与叶绿素在叶片中积累和叶绿体发育的开始相吻合，而从Ic期到Id期的转变则对应于叶片停止伸长的时间(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，叶片完成阶段I并进入阶段II所必需的温度和约为350。从第一个可比较的转录阶段(Ia期晚期，2002年5月27日，与2000年6月3-4日相当)到第二阶段，2000年大约花了25天，而2002年只有14天，说明温度对叶片发育的作用有很强的影响。gydF4y2Ba

叶片发育过程中的基因表达反映了关键的细胞事件gydF4y2Ba

将表达数据中的信息转化为生物学上相关的信息是从事转录组分析的生物学家的一项主要任务。在定义了许多叶片转录组阶段并将它们放在两年的日历上之后，我们的目标是描述每个阶段的转录活动，以便我们能够得出关于每个发育阶段的主要细胞活动的结论。微阵列技术提供的数据仍然相当嘈杂，对适当功能类的基因组的研究比对单个基因的分析提供了更可靠的数据[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．因此，如前所述，我们将2000年和2002年的样本按照各自的发展阶段进行排序，并检查了数据集中的基因表达模式，该数据集可在UPSC-BASE中查看[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．为了确定，在无监督的方式，主要代谢活动在每个阶段I子阶段，我们分类的阵列元素在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba微阵列根据基因本体论(GO)的分类最为接近gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Baorthologues。随后，我们使用Bioconductor中的GOstats包确定了GO类[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，这些基因在每个样品中上调或下调的基因集中均显著过高，其顺序根据温度总和/叶片发育阶段而定。在图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，在上调基因中过度代表的GO类别用红色表示，而在下调基因中显著过度代表的GO类别用绿色表示。在Ia期，叶片在扩张，但叶绿素的积累尚未开始(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．Ia期的主要转录模式是编码核糖体蛋白的基因(如蛋白质生物合成和核糖体生物发生类的基因)和代表类的组蛋白(如染色质组装和染色体组织)的大量上调。其他上调的氧化石墨烯类包括细胞组织和基于微管的过程，以及DNA代谢。许多在细胞增殖或模式形成中起作用的基因的表达，如周期蛋白依赖激酶(PttCDKB2) (PU00348) [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]， yabby样转录因子(PU09301, PU09931, PU09586, PU08954, PU26269, PU09515) [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，视网膜母细胞瘤(PU09599, PU01146) [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]和Aintegumenta (PU04170, PU05886, PU02438) [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]在这个阶段也很强大。许多类基因在Ia期表达水平很低，包括与光合作用、次生代谢以及对光/辐射、氧化应激、水、病原体、损伤等许多生物和非生物刺激的反应相关的基因。参与乙烯生物合成的基因在Ia期晚期和Ib期早期表达较弱。Ia期期间，叶片快速生长，这种生长明显伴随着显著的细胞分裂活性，而叶片的许多典型代谢途径，如光合作用、次生代谢和应激反应，则保持不动。gydF4y2Ba

在Ib期，通常在Ia期高表达的GO类(核糖体蛋白、组蛋白、DNA代谢等)没有过度表达。因此，在白杨冬芽发育过程中，细胞分裂活动主要发生在短时间内。然而，编码光合装置和叶绿素生物合成成分的基因的表达量大幅增加。与脂代谢相关的几类蛋白质(脂肪酸生物合成、脂质转运、脂质生物合成)也在Ib期上调。碳水化合物代谢、细胞壁组织和生物发生等类别也在Ib期过量表达，这与Ib期是细胞伸长主要发生的阶段一致。Ib期表达特别低的类别包括木质素生物合成，表明次生细胞壁形成尚未开始。显然，细胞迅速伸长，原代细胞壁合成，前质体在这一阶段发育为叶绿体。在个体基因水平上，微管蛋白在Ia期和Ib期都有上调。在这些亚阶段，一些参与细胞壁生物合成的基因表达达到峰值，包括编码膨胀蛋白的基因(exp1，与其他膨胀蛋白基因相比，其表达水平在Id期最高)，阿拉伯半乳聚糖蛋白AGP18, AGP20 FLA10，富脯氨酸蛋白(PRP4)，果胶甲基酯酶样蛋白，胚芽蛋白样蛋白(GER3)和果胶裂解酶。一种纤维素合成酶在Ib期开始高表达，并在II期开始时保持高表达水平。色素合成中光合蛋白和酶编码基因的高表达也持续在Ic和Id阶段。此外，脂质转运和细胞壁组织和生物发生等类别表达较高。 Overall, there were considerable similarities between the Phase Ib and Ic transcriptomes, but some categories differed. For example, phenylpropanoid and lignin biosynthesis was significantly under-represented in Phase Ib, but not in Phase Ic. GO classes overrepresented in Ib, but not in Ic, included lipid and fatty acid biosynthesis and cellular morphogenesis. This suggests that some, but not many, cells in Phase Ic had stopped elongating and started secondary cell wall biosynthesis. In the last sub phase of Phase I (Id) cells had stopped elongating (Figure1gydF4y2Ba)和木质素生物合成相关酶的编码基因高表达。此外，与氨基酸(特别是蛋氨酸)生物合成相关的类被过度代表，碳水化合物代谢类也是如此。gydF4y2Ba

蔗糖合酶在Ia期表达量高，在Ib和Ic期表达量弱，在Id亚期表达量最强。在这个亚阶段，初生细胞壁的生物合成基本停止，次生细胞壁形成。二级细胞壁生物合成完成，木质素生物合成相关基因下调，标志着阶段I的结束，进入阶段II。当叶绿素不再积累，叶片明显完全成熟时。还应该指出的是，在整个阶段1中，许多类别的代表不足，包括对广泛的非生物和生物应激的反应，以及次生代谢。gydF4y2Ba

天气调节基因表达gydF4y2Ba

其次，我们想关注环境对基因表达的影响。尽管天气(至少是温度)也会影响年轻叶片中转录程序的进展速度，但当叶龄依赖性变化最小时，环境对基因表达的影响分析在成熟叶片中可以获得最佳分辨率。根据不同年份的天气数据，我们寻找天气状况最不稳定的一段时间。从8月7日到8月16日这段时间，特别是2003年和2004年，天气变化很大，基因表达的叶龄依赖变化基本上不存在，因此环境信号应该是基因表达的主要诱导因子和抑制因子。我们选择了从这些时间段采集的10个叶片样本，并使用DNA微阵列分析了它们的基因表达。这些数据用潜在结构正交投影(oppls)进行分析，这是一种有监督的多元线性回归方法[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．相对于无监督PCA方法，oppls需要并利用额外的背景信息;例如存在不同的样本组(类)[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba或治疗浓度。在这种情况下，opl的特殊性质是能够在数据表中分别描述与建模目标(例如区分不同类别)和其他系统趋势相关的信息。oppls被用于基于当前和以前天气的描述来预测基因表达水平，包括阳光、温度、湿度、风和降水参数[见附加文件]gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．交叉验证(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，以找到一个具有良好泛化特性的opl模型。基于交叉验证的opl模型的特性，随后确定了由天气参数可靠预测的微阵列元素，这表明这些元素受天气影响或直接受天气调节。gydF4y2Ba

在双线图中(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)与天气参数一起显示了199个预测较好的基因。不同天气参数之间的关系被强调，其中相互接近的参数对基因表达有类似的影响。与基因接近的天气参数与邻近基因呈正相关，而与基因相反的则呈负相关。离原址较远的天气参数对纳入基因的影响较大。正如预期的那样，温度和太阳有很强的相关性，而湿度和降水则有相反的影响。全局OPLS模型描述了微阵列元件和天气参数之间的多对多关系，但OPLS也可用于精确定位对特定微阵列元件的调节最重要的天气参数。为此，我们为每个微阵列元素构建了局部opl模型，其中天气参数用于一次连续预测一个微阵列元素。根据每个局部模式的预测负荷，可以近似地计算出天气参数对每个微阵列单元的影响。图中显示了两个模型示例gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，其中既显示了测量和预测mRNA水平之间的关系，也显示了与基因表达最相关的天气参数。与Wissel等人的研究结果相似，在这些情况下，可以通过天气参数准确预测mRNA水平，并且可以估计不同因素的相对重要性和方向。例如，Photosystem II 10 kDa (PsbR)基因mRNA水平与温度、太阳、风负相关，而与降水和湿度正相关(即在阴雨天表达更高);双组分响应调节基因mRNA水平与温度变化和太阳正相关，而与静态温度和太阳负相关(即在温度变化时表达更高)。先前有报道PsbR在脱水-复水控制下gydF4y2BaXerophyta云淡的gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，但结果却截然相反gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．双组分响应性调控基因属于GARP-ARR-B转录因子家族[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．ARR-B家族在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba可能是光调节的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

最后，我们比较了两个子实验中差异调控的基因。是否受发展或环境控制的“分界点”有些武断，但在两种分析中使用相同的标准，即正b值[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba我们定义了7615个序列元素的mRNA水平主要由叶片在早期的发育阶段决定，而在第二组实验中，在天气控制下只有2368个克隆。在两个列表中都找到了648个数组元素。与上述分析一致，在季节早期主要受发育控制的基因参与了叶片的中枢合成代谢过程。基因本体论类别在这些基因中有较高的代表性，如翻译、光合作用、核糖体生物发生与组装、细胞器组织与生物发生、核蛋白复合体生物发生与组装、核小体组装。[见附加文件]gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．相比之下，很少有GO类别持续受到天气因素的影响，而那些主要属于小型或定义不清的类别，如“系统开发”或“开裂”[见附加文件]gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

仅仅通过研究在温室和气候室中受控条件下生长的植物，我们真的能了解植物的生长、发育和驯化吗?很明显，在许多情况下，高度控制的条件是必要的，如果没有重复实验的可能性，植物生物学仍将处于初级阶段。然而，同样明显的是，在实验室中生长的植物与在自然条件下生长的植物表现非常不同，在自然条件下，生物和非生物因素通常变化很大，而且往往不可预测[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．这项贡献的总体目标是看看在自然条件下生长的植物上的基因表达的高通量研究在多大程度上可以给出可重复的结果，更重要的是，提供信息。我们已经建立了DNA微阵列分析管道[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]以便以标准化的方式处理我们的cDNA微阵列。在这里，我们使用这条管道处理了几年来从同一棵树收获的白杨树叶的许多样本，在样本选择后，基于之前的实验和考虑白杨树叶的生物学，优化了样本的信息量。基因编目项目的标准策略，如AtGenExpress [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba是在高度确定的条件下种植植物，以尽量减少样品之间的生物变异。这无疑是一种有用的策略，但我们证明了另一种策略，即随着时间的推移，监测暴露在不同环境条件下的单个个体的基因表达，也可以使用。植物的生活史限制了可以应用的策略，与白杨相比，白杨有几个缺点gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在这方面。它也有作为模型系统的优势，例如它的大尺寸和常年的生长习惯，由于这种研究无法在中国进行gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，两种模式系统相辅相成[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们相信，这项研究表明，一个发育程序(在本例中是叶片发育)可以使用未受控条件下的样本进行忠实的分析。在叶片发育的前几周，转录组发生了显著的变化，在这一阶段，预定义的叶片发育程序在决定叶片转录组方面比环境参数重要得多。在这段时间里，叶子膨胀，细胞分裂和伸长，叶绿体形成，最后，在我们的例子中，根据温度的不同，叶子在20-30天后成熟。不受控制的环境因素，如温度，当然会显著地调节叶片的发育[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba这一定是通过某些基因的差异调控发生的，但对整个转录组的影响还没有大到妨碍这种分析。第一阶段的某些“子阶段”的进展，以及其速度对温度的依赖，是预期的，当然也可以通过分析在恒定条件下生长的植物来检测到，但我们认为，从自然条件下生长的树木中获得这些信息增加了发现的意义。gydF4y2Ba

在针叶树和阔叶树中，温度总和已被证明是发芽的准确预测指标[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]，许多作者使用基于温度和的分析来得出关于花蕾爆发的重要结论[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．温度也可能是叶片膨胀的主要决定因素[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba和叶绿素的积累。然而，据我们所知，温度和与叶片转录组的联系如此紧密，一直到叶片完全成熟、内部结构形成和二级细胞壁生物合成完成的阶段。这种相关性必须通过对更多基因型和几年的研究来证实，但我们现在可以确定一组定义良好的标记基因来区分不同的亚阶段(数据未显示)，从而有可能在发育阶段有效地监测进展。同样，基于我们的数据集，可以选择最适合作为“控制基因”来标准化的基因，例如RT-PCR数据或指示各种环境压力的基因，而不受叶龄的影响。当然，我们的数据集并不像相应的数据集那样全面gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba叶子(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]，但我们相信，这将成为日后研究的有用资源。例如，通过包括大量的附加gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba在UPSC-BASE中存在的叶片微阵列数据集(例如，在干旱胁迫、草食动物和病原体处理、冷处理、日周期等之后)，我们现在可以进行荟萃分析，并识别在所有实验中具有相似转录反应的基因，即构成调控的基因。对于每一个规则，我们可以使用这里开发的方法，选择最影响基因表达的变量，记住不同的因素在叶片的生长、成熟和衰老过程中都很重要。另一种可能是，对于每个调控，选择一个或多个可以在大量样本中分析的标记基因，例如在不同的基因型中，以解剖基因表达的自然变异。考虑到不仅与大多数一年生植物和作物植物相比，而且与其他树木相比，DNA序列水平的遗传变异异常高，这种变异在白杨中可能是巨大的[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．这样的工具箱有望用于解决许多重要的问题，不仅可以了解树木生物学，还可以了解一般的植物生物学。我们的数据集还可以用于检查直系同源基因的表达模式，这些基因已被证明可以调节叶片发育的不同方面gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]或鉴定新的基因，这些基因的表达模式表明它们可能在叶片发育的各个阶段发挥作用。这些可能性超出了本文介绍的工作范围，但由于我们的数据集在UPSC-BASE中公开可用[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，这样的分析现在可以进行。gydF4y2Ba

叶片发育过程中基因调控的变化非常强烈。这对于在恒定条件下生长的植物的采样策略具有重要意义。除非对相同的发育阶段进行采样，否则不同处理引起的基因表达变化很可能被发育阶段差异造成的更大影响所掩盖。这一点很重要，因为许多处理，而不仅仅是温度，都会影响叶片的发育。这可以用我们自己的一个实验来说明，在这个实验中，高浓度[CO .]处理对基因表达的“直接影响”gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba]在很大程度上被叶片发育阶段的明显变化所掩盖，尽管对叶片进行采样的目的是它们应该处于相同的阶段(即具有相同的质体发育指数PI) [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．其他已发表的DNA微阵列实验可能也遇到了同样的问题，这增加了不同实验结果之间缺乏一致性的情况。gydF4y2Ba

双色微阵列数据提供了基因表达的相对测量，如果分析了许多样本，就像在这项研究中，过度和不足表示与整个数据集相比。在数据分析过程中必须记住这一点:例如，在阶段I中与压力相关的基因的低代表性并不是绝对的衡量标准，而是意味着低于“平均样本”，而且由于许多样本来自于叶片未生长的阶段，因此只有低表达的基因参与“构建叶片”，因此，所有其他类型的基因的高表达。因此，我们并不认为我们的数据一定表明，抗生物和非生物胁迫基因的表达在I阶段不是很重要，而是在发育基因过载中，应激基因正在消失。这对于在现场进行的这样一项研究来说没有什么特别的，但是在微阵列数据的所有时间序列分析中需要记住的事情。gydF4y2Ba

应该指出的是，我们在这里进行的分析只提供了关于叶细胞的“平均转录组”的指示。显然，不同的细胞类型会有非常不同的基因表达模式[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，而叶片的不同区域不会处于完全相同的发育阶段[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．我们认为，在花蕾发育期间，细胞发育可能比“正常”叶片发育期间更加高度同步。这是因为在冬芽中，许多细胞可能在同一发育阶段被阻止，当条件允许芽冲时，许多细胞的细胞活动是同步的。在连续生长的植物中，叶片不同部位的细胞处于不同的阶段，因此叶片中的整体基因表达谱可能更多地是多个发育阶段的混合，但这需要实验验证。gydF4y2Ba

最后，我们认为这一贡献也证明了多元统计在基因表达分析中的一些力量，无论是在分析DNA微阵列数据的模式方面，还是在识别例如时间序列中的断点方面，当基因表达特征的微妙变化可以被精确定位时。阿斯彭有几个缺点gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba作为模型系统，但它也有体积大、常年生长习性等优点。模型系统之间的另一个明显差异是遗传变异的数量。本地种群的白杨个体的基因内约有1%的核苷酸多样性[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba也就是说，在DNA水平上，两棵白杨树比人类和黑猩猩的差异更大。我们认为，这是支持我们的实验策略的进一步论据，即对一棵树进行详细的转录谱分析，因为使用不同的白杨树作为生物复制，将导致缺乏类似于将黑猩猩用作人类阵列研究的生物复制的结果的解决方案。我们的目的是利用这个数据集进一步研究白杨个体基因表达的自然变异，但这超出了本文的范围。gydF4y2Ba

抽样gydF4y2Ba

按照受控程序，从一棵完全生长的(>30年)自由生长的白杨树(gydF4y2Ba杨树tremulagydF4y2Ba)在2000-2005年整个生长季节的每个采样时间上午11时，在Umeå大学校园(北纬63°49′17”，东经20°18′40”)。采样的叶子在液氮中快速冷冻，并保存在-70°C等待分析。每种场合至少有20片叶子，然后在液氮中碾碎并混合。每次复制使用叶子混合物的一部分进行RNA提取。2000年的样本与之前一项研究中使用的样本相同[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

相关天气参数(温度、湿度、气压、风、太阳强度和降水)由位于Umeå大学校园的气象站收集的数据计算，该校园距离采集样本的树木约200米。全年每小时收集一次数据，并将其转换为描述原始天气参数稳定性、变化和时间滞后的新参数。滞后变量由不同组合的上午、下午、晚上和白天总结组成。计算出的滞后变量对应的是发展缓慢且不能由气象站直接测量的环境因子，如土壤水势和温度。有关天气资料分析的详情，请参阅主成分分析一节[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．在2005年生长季开始时，每天用尺子测量6片叶片的叶长，用叶绿素含量仪(CCM-200, Opti-Sciences, Tyngsboro, MA, USA)测量叶片叶绿素含量。gydF4y2Ba

第一组微阵列实验选取了11天天气条件相似的样本(6月1日、6月15日、6月29日、7月6日、7月18日、7月27日、8月3日、8月11日、8月18日、8月29日、9月12日)。随后，从2000年的另外3个日期(5月25日、6月9日、6月22日)和2002年的7个日期(5月27日、5月30日、6月3日、6月10日、6月17日、6月24日、7月1日)中选择了更多的样本。第三组微阵列实验(详细的天气研究)包含2003年和2004年8月7日至8月16日的样本。更多关于样品的详细信息可在UPSC-BASE [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．详细春季和天气实验的温度、降水、辐照度如图所示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

标记和杂交gydF4y2Ba

大多数样品采用共同的参考实验设计。共同参考的RNA是2000年40种RNA制剂的混合混合物[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．RNA根据先前发表的方法制备[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]进行小的修改[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．将RNA逆转录为氨基烯丙基标记的cDNA，使用20gydF4y2BaμgydF4y2Bag总RNA引物为5gydF4y2BaμgydF4y2Bag oligo-dT引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。然后使用Microcon 30 (Millipore, Bedford, MA, USA)浓缩器纯化cDNA，用H洗脱gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和干燥在一个速度真空离心式蒸发器。gydF4y2Ba

在第一次实验(整个季节)中，所有样品在四个重复中与共同参考样品进行人工杂交，不进行染料交换，使用POP1载玻片[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．样品于10年重新悬吊gydF4y2BaμgydF4y2BaL 0.1 M NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba其中cDNA与Cy-3-或cy -5-酯(Amersham Bioscience, Little Chalfont, UK)偶联3小时gydF4y2BaμgydF4y2Ba加入L的4 M羟胺以防止交叉偶联。混合样品使用QIAquick色谱柱(Qiagen, Valencia, CA, USA)进行纯化，然后在Speed-vac离心蒸发器中干燥。30gydF4y2BaμgydF4y2Ba将L份杂交缓冲液(0.5% SDS, 5× SSC, 5× Denhart’s溶液，50%甲酰胺)加入每张载玻片，42℃水浴孵育45 min。每个干燥样品在25gydF4y2BaμgydF4y2BaL杂化缓冲液与3gydF4y2BaμgydF4y2BaL oligo-dA (10gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaμgydF4y2BaL-1)和0.4gydF4y2BaμgydF4y2BaL tRNA (25gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaμgydF4y2BaL-1)，然后涂在载玻片表面。将载玻片在42℃下杂交16 h，用三种溶液(1× SSC, 0.2% SDS, 0.1× SSC, 0.2% SDS，最后0.1× SSC)洗涤。清洗后，将载玻片在氮气流下干燥。gydF4y2Ba

对于第二组实验(详细的春季研究)，使用POP2阵列将样本与通用参考进行杂交[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]在自动幻灯片处理器(ASP;Amersham Bioscience, Little Chalfont，英国)。除了包含在POP1阵列中的所有克隆外，POP2还包含来自新的cDNA文库的克隆。样品于10年重新悬吊gydF4y2BaμgydF4y2BaL 0.1 M NaHCOgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， pH值9，并与适当的cy染料混合，溶解于10gydF4y2BaμgydF4y2BaL DMSO溶液。样品耦合120分钟，并根据原始说明使用Cyscribe GFX纯化试剂盒(Amersham Bioscience, Little Chalfont, UK)清洗。cDNA在60秒内洗脱gydF4y2BaμgydF4y2Ba然后在真空中将体积减小到41gydF4y2BaμgydF4y2BaL.适当的合并样品汇集并与45gydF4y2BaμgydF4y2BaL SSC (20×)， 45gydF4y2BaμgydF4y2Ba3 . L甲酰胺(100%)gydF4y2BaμgydF4y2BaL SDS (10%)， 1gydF4y2BaμgydF4y2BaL tRNA (10gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaμgydF4y2BaL-1)和3gydF4y2BaμgydF4y2BaL oligo-dA (25gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaμgydF4y2Bal - 1)。样品在95°C下变性3 min后注入ASP室，置于ASP室中。在此，将载玻片暴露于预杂交缓冲液(5× SSC, 50%甲酰胺，2.5× Denhart's溶液，0.1% BSA)中，然后用注射器注射样品。将载玻片在42℃下杂交14-16 h，然后用三种浓度依次降低的缓冲液(1× SSC, 0.05% SDS，然后是0.3× SSC，最后是0.05× SSC)洗涤。关于ASP中参数设置的详细信息可以根据要求发送。第三组实验(天气研究)采用POP2阵列进行环状杂交，如第二组实验所述。gydF4y2Ba

使用Scanarray扫描仪(PerkinElmer AB，瑞典)对载玻片进行4-5次扫描，并预设增加激光功率和光电管倍增器(PMT)设置。所得图像在Genepix 5.0 (Axon Instruments, CA, USA)中进行分析。处理所有TIFF图像时，将复合像素强度(CPI)设置为寻找圆形特征，并在默认大小(100gydF4y2BaμgydF4y2BaM)和复合像素强度阈值设置为300时对齐。弱点被自动标记为未找到。提取的数据存储为包含原始数据和各种统计测量的结果文件。必要时，将POP2阵列中2000年的POP1样本子集与2000年的原始POP1样本提取并进行分析。对于第一组微阵列载玻片，一些载玻片由于混合不均匀而被丢弃。保持杂交的数量在括号中，6月1日(4)、6月15日(2)、6月29日(3)、7月6日(3)、7月18日(4)、7月27日(4)、8月3日(4)、8月11日(4)、8月18日(3)、8月29日(4)、9月12日(2)。gydF4y2Ba

原始数据存储在公共微阵列杨树数据库UPSC-BASE [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba其中第一个(整个季节)、第二个(详细的春季)和第三个(天气)分别被分配为UMA-0001 UMA-0032和UMA-0078。每张幻灯片的不同扫描级别用限制性线性缩放(RLS)合并[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]然后逐步归一化[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]才能进一步分析。gydF4y2Ba

线性模型gydF4y2Ba

基因线性模型用于分析每个采样日期的基因表达值。线性模型描述为gydF4y2BaYgydF4y2Ba＝gydF4y2BaXgydF4y2Ba＊gydF4y2BaβgydF4y2Ba+gydF4y2BaεgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaYgydF4y2Ba是来自不同幻灯片的对数比向量，gydF4y2BaXgydF4y2Ba是设计矩阵，gydF4y2BaβgydF4y2Ba向量的参数和gydF4y2BaαgydF4y2Ba是误差。对于第三组实验(天气研究)，计算了硅平均，以便在不同时间进行比较[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．这些模型是使用微阵列数据线性模型(LIMMA)包中的函数计算的[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]在统计软件R [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]在UPSC-BASE中实现。gydF4y2Ba

主成分分析gydF4y2Ba

主成分分析(PCA)是一种无监督投影方法，用于从大型数据表中提取系统趋势[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．数据集可能包含数千个特征(例如基因的表达水平、蛋白质丰度等)，可以根据数据中的方差简化为少数几个表征最强系统效应的主要成分。这些主成分(一般称为潜在变量[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]描述了数据中的独立效应，通过得分向量和使用加载向量的相应特征将样本联系起来。主成分分析最典型地用于探索性分析目的;识别无法单独对每个样本进行分析的趋势、集群或外围样本。在本案例中，使用SIMCA-P 11.5软件(Umetrics AB, Ume aa，瑞典)对天气和微阵列数据进行主成分分析。所有变量均以均值为中心，并在天气分析之前缩放到单位方差，这意味着从每个天气参数中减去平均值并除以其标准偏差。微阵列数据仅以均值为中心。根据交叉验证选择PCA模型中的主成分数量[见附加文件]gydF4y2Ba8gydF4y2Ba详情)gydF4y2Ba

潜在结构的正交投影gydF4y2Ba

潜在结构正交投影(oppls)是一种有监督的多元线性回归方法[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．相对于无监督PCA方法，oppls需要并利用额外的背景信息;例如存在不同的样本组(类)[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba或治疗浓度。目前文献中存在大量的监督线性回归方法[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

利用光照、温度、湿度、风和降水参数对采样时间和采样早期的基因表达水平进行预测。为了避免过度拟合的问题，交叉验证[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]，以找到一个具有良好泛化特性的opl模型。基于交叉验证的opl模型的特性，随后确定了由天气参数可靠预测的微阵列元素，这表明这些元素受天气影响或直接受天气调节。使用统计软件R [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]基于内部生产的代码。微阵列数据集的每个微阵列元素均以均值为中心，而天气参数均以均值为中心，并在分析之前缩放到单位方差。根据交叉验证选择oppls模型参数[见附加文件]gydF4y2Ba8gydF4y2Ba详情)。gydF4y2Ba

识别受天气影响的微阵列元件gydF4y2Ba

opl模型仅基于天气参数近似微阵列元素的表达剖面的能力将表示该特定元素的预测变化。预测的变化范围从负无穷到1，其中高的正值表示可靠的预测，反之亦然。这种识别可靠预测特征的策略以前曾在不同的环境中使用过[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．预测的变化估计值随后根据置换策略转换为传统的p值，其中天气参数和表达水平之间的联系已被破坏。这一过程重复了许多次，以估计从具有相同属性的数据表中可以偶然预期的预测变化的程度[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．随后，使用逐步错误发现率校正，对估计的p值进行多次测试膨胀校正[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba］．如果FDR < 0.05，则误发现率调整p值(FDR)被称为显著，共呈现199个显著微阵列元素。参见图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba微阵列元件及其与天气参数的关系概述。gydF4y2Ba

比较环境控制和发展控制对阵列元素的影响gydF4y2Ba

对于天气数据集gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba计算参考数据，并将每个日期b统计值为正的数组元素合并成唯一的环境基因集。对于详细的春季数据集，根据季节参考计算b统计量，并对两个数组元素列表进行比较。gydF4y2Ba

局部建模突出天气与基因的联系gydF4y2Ba

全局opl模型描述了微阵列元件与天气参数之间的多对多关系。从多元的角度来看，这是有益的，但直接确定对特定微阵列元素具有主要影响的天气参数可能并非易事。为此，我们为每个微阵列元素构建了局部opl模型，其中天气参数用于一次连续预测一个微阵列元素。根据每个局部模型的预测负荷，可以近似地计算出天气参数对每个微阵列元件的影响。如图所示gydF4y2Ba5gydF4y2Ba用于一组选定的微阵列元件。gydF4y2Ba

函数类分析gydF4y2Ba

为了系统地评估与有趣的生物学主题相关的变化，我们使用了GOstats Bioconductor包的一个版本[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]，针对我们的杨树阵列的应用进行了修改，并在UPSC-BASE中实现[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]使用从大众数据库获得的资料[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba资讯资源[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．函数类最接近gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba的正交gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因采集自基因本体(GO) [gydF4y2Ba66gydF4y2Ba)定义。GOstats的输入是重要基因的列表[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．对输出进行分析，并用于跟踪生物学主题的时间趋势，p值小于0.05的类被认为是重要的。结果被总结并绘制在一个GO图结构上。图表中只使用了在一个或多个时间点上过度代表的类别及其父辈。gydF4y2Ba

温度和gydF4y2Ba

温度总和是以超过阈值1°C的累积日平均温度[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]:gydF4y2Ba

式中TS为第t天的温度和，t (t)为第t天的日平均温度(℃)，gydF4y2BaTgydF4y2Ba_bgydF4y2Ba阈值温度(1℃)和tgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba为温度和累积的起始日期，此处为1月1日[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

这项工作得到了克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会、瑞典战略研究基金会、瑞典研究理事会、Kempestiftelserna和欧洲委员会的支持，通过第五研究框架-生活质量和生活资源计划管理的总研究部，合同编号:qlk5 - ct - 2002 - 00953 (POPYOMICS)。纳撒尼尔·斯特里特(Nathaniel Street)对手稿进行了有益的讨论和评论。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 乌姆eå植物科学中心，乌姆eå大学，乌姆eå， SE-901 87，瑞典gydF4y2Ba

   Andreas Sjödin, Kirsten Wissel & Stefan JanssongydF4y2Ba

2. 化学计量学研究小组，Um eå大学化学系，Um eå， SE-901 87，瑞典gydF4y2Ba

   马克斯Bylesjö &约翰TrygggydF4y2Ba

3. 汉诺威医科大学耳鼻咽喉科，卡尔-纽伯格一号，汉诺威，D-30625gydF4y2Ba

   克里斯汀•WisselgydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaStefan简颂gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

AS收集了叶片样本，对POP2数据集进行了微阵列实验室工作，分析了所有微阵列数据并起草了手稿。KW收集叶片样本并生成初始的POP1季节微阵列数据集。MB分析了天气与基因的相关性，并提供了关于opl的主要专业知识。SJ构思了这项研究，并与JT一起监督了该项目。所有作者都阅读并批准了手稿。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd授权发布。这是一篇开放获取文章，根据创作共用归属许可协议(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，前提是正确地引用原始作品。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba